喬飛 江雪飛 張彥

摘 要 以西瓜的花粉為材料，研究西瓜花粉自發(fā)熒光的光譜特征、熒光強(qiáng)度，并結(jié)合結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)優(yōu)化花粉自發(fā)熒光成像方法。結(jié)果表明：西瓜花粉的自發(fā)熒光在藍(lán)色波段最強(qiáng)；新鮮花粉在儲藏過程中熒光強(qiáng)度變化不大；西瓜花粉的自發(fā)熒光主要位于花粉外壁網(wǎng)紋上；分別用苯胺藍(lán)、Calcofluor white、碘化丙啶、吖啶橙對西瓜花粉染色后，花粉的其他部位在不同熒光通道下也可以呈現(xiàn)熒光。因此，本研究建立的方法不僅可用于分析西瓜花粉的大小、形態(tài)、外壁紋理、萌發(fā)孔、萌發(fā)溝等形態(tài)特征，還可以反映花粉表面熒光物質(zhì)分布的特征。

關(guān)鍵詞 花粉；西瓜；熒光；染色；結(jié)構(gòu)照明顯微鏡

中圖分類號 Q944.57 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract With watermelon pollen as the material， the spectrum and intensity of the autofluorescence were investigated， and the photography of the autofluorescence of pollens were optimized combined with Apotome microscope. The results showed that the maximum intensity of autofluorescence was in blue spectrum； The intensity of autofluorescence in fresh pollens fluctuated only slightly during storage； And the autofluorescence was located mainly on the reticula. After staining the pollens with aniline blue， calcofluor white， propidiumiodide， acridine orange respectively， the other parts could also be fluorescent in specific channels. Therefore， the optimized method could be not only suitable for observing the size， shape， reticulum， aperture and germ furrow， but also indicate the distribution of chemical composition.

Key words Pollen； watermelon； fluorescence； staining； Apotome microscope

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.024

花粉是種子植物特有的結(jié)構(gòu)，具有較強(qiáng)的遺傳保守性，不同種類植物的花粉粒在形狀、大小、外壁和紋理等方面都有著明顯的差別。西瓜花粉為近球形，具3孔溝，溝連接兩極，萌發(fā)孔為圓形，外壁具有網(wǎng)紋結(jié)構(gòu)，網(wǎng)眼大小不等但分布較為均勻[1]。植物花粉的形態(tài)和大小可由光學(xué)顯微鏡顯微觀察，而細(xì)微的紋理結(jié)構(gòu)多由掃描電子顯微鏡觀測[2-3]。定量測量花粉的形態(tài)指標(biāo)，已廣泛應(yīng)用于植物分類、系統(tǒng)進(jìn)化、育性鑒定等領(lǐng)域[4-6]。

花粉中含有多種熒光物質(zhì)，包括孢粉素、木質(zhì)素、芳香族氨基酸、NADH、NADPH、核黃素、多酚類物質(zhì)等[7]。近年來已有利用花粉的自發(fā)熒光結(jié)合激光共聚焦掃描顯微技術(shù)，重構(gòu)花粉的三維圖像的研究[8-10]。此外，根據(jù)花粉的自發(fā)熒光光譜特征，還可以區(qū)分植物的種類[11]。然而，哪些波段的自發(fā)熒光更適合用來重構(gòu)花粉的圖像，這些熒光位點(diǎn)是否和特定的結(jié)構(gòu)相關(guān)，尚未見報(bào)道。本研究以西瓜的花粉為材料，結(jié)合熒光結(jié)構(gòu)光學(xué)3D成像技術(shù)[12]，研究了不同熒光通道下西瓜花粉熒光成像效果。此外，本研究還利用幾種熒光染料對西瓜花粉進(jìn)行染色，對利用熒光染料染色重構(gòu)花粉的三維圖像的效果進(jìn)行了分析比較。

1 材料與方法

1.1 材料

西瓜花粉采自海南省儋州市中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所。實(shí)驗(yàn)分別觀察了新鮮花粉和4 ℃干燥保存了7、14、21和28 d的花粉。

1.2 方法

1.2.1 花粉自發(fā)熒光觀察 將新鮮花粉或者保存的花粉放在載玻片上，加一滴水，蓋上蓋玻片，用熒光顯微鏡（Zeiss， AxioImager Z2+ApoTome）觀察。將熒光光源（X-Cite 120Q）強(qiáng)度開到最大，固定曝光時(shí)間（5 ms），分別在DAPI、GFP、RFP、CFP、YFP和Rhodamine共5個(gè)熒光通道下拍照。不同熒光通道的參數(shù)設(shè)置具體見表1?；ǚ蹮晒鈴?qiáng)度用顯微鏡配套軟件（Zen 2）測量。每個(gè)樣品統(tǒng)計(jì)30粒以上花粉，求平均值。

用顯微鏡的ApoTome模塊逐層采集花粉z軸圖像，用最大投影法（MIP）重構(gòu)花粉的3D圖像。

1.2.2 花粉染色與成像觀察 DAB染色液配制參照J(rèn)ohnson-Brousseau和McCormick的方法[13]。Calcofluor white染色液，購自Sigma-Aldrich公司，使用時(shí)1 ∶ 1（V ∶ V）加入10%的KOH。碘化丙啶（Propidium Iodide），購自Sigma-Aldrich公司，加水配成濃度為20 μg/mL的PI染色液。吖啶橙（Acridine Orange），購自Sigma-Aldrich公司，加水配成濃度為0.5 μg/mL的AO染色液。

取新鮮花粉，加1滴染色液，染色10 min，蓋上載玻片，置于載物臺上，顯微觀察方法同上。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用Excel作圖，用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，選擇多重比較LSD法，“*”表示差異達(dá)到顯著（p<0.05），“**”表示差異達(dá)到極顯著（p<0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮花粉的自發(fā)熒光強(qiáng)度分析

在DAPI、CFP、YFP、GFP和Rhodamine共5個(gè)通道下分別測定新鮮花粉的自發(fā)熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)西瓜花粉有較強(qiáng)的紫色熒光，其次為青色熒光和綠色熒光，黃色熒光和紅色熒光最弱（圖1）。經(jīng)方差分析，紫色熒光、青色熒光和綠色熒光的強(qiáng)度極顯著高于黃色熒光和紅色熒光。

2.2 干燥保存花粉自發(fā)熒光強(qiáng)度變化分析

新鮮花粉經(jīng)4 ℃干燥貯藏，每7 d觀察測定其儲藏花粉熒光強(qiáng)度的變化（見圖2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，西瓜花粉自發(fā)熒光并未隨儲藏時(shí)間的延長而明顯下降，其中黃色熒光通道的熒光強(qiáng)度值呈現(xiàn)下降趨勢，其他通道的熒光強(qiáng)度值均呈現(xiàn)出先上升再下降的趨勢。紅色熒光（Rhodamine）通道的熒光強(qiáng)度值在儲藏21 d時(shí)有較為明顯的上升，但到28 d時(shí)又迅速降低。不同通道熒光強(qiáng)度值在貯藏期間變化明顯，和新鮮花粉比較，差異多達(dá)到極顯著水平（顯著性用“*”標(biāo)記，見圖2）。

2.3 不同染料對花粉熒光的影響

用吖啶橙、苯胺藍(lán)、Calcofluor white和碘化丙啶分別對新鮮花粉染色，染色后在不同熒光通道下測定花粉的熒光強(qiáng)度，經(jīng)測定值和花粉的自發(fā)熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較作圖（見圖3）。結(jié)果表明，4種染料對西瓜花粉紫色熒光（DAPI）、青色熒光（CFP）和綠色熒光（GFP）的強(qiáng)度影響較小，對黃色熒光（YFP）和紅色熒光（Rhodamine）的影響則較大，其中，經(jīng)吖啶橙染色后，西瓜花粉的黃色熒光強(qiáng)度上升了20多倍。經(jīng)方差分析，染色后的各通道的熒光強(qiáng)度和對照相比，差異均達(dá)到了極顯著水平。

2.4 花粉自發(fā)熒光3維重構(gòu)成像效果分析

如圖4所示，新鮮花粉在不同熒光通道下均可成像。但是用普通的表面熒光觀察，大量的非焦平面雜散光進(jìn)入，導(dǎo)致成像較為模糊。用Apotome結(jié)構(gòu)照明結(jié)合3D軟件模塊的方法成像，可有效去除非焦平面雜散光，成像清晰，可區(qū)分花粉的萌發(fā)孔、孔溝和外壁紋理結(jié)構(gòu)。

2.5 不同熒光染料染色后3維重構(gòu)成像效果分析

4種染料染色后，不僅花粉的整體熒光強(qiáng)度發(fā)生了相應(yīng)變化（圖3），而且部分位置、結(jié)構(gòu)的熒光強(qiáng)度也有增強(qiáng)（圖5）。苯胺藍(lán)染色后，除萌發(fā)溝熒光增強(qiáng)外，其他部位熒光未呈現(xiàn)明顯變化。Calcofluor white染色后，DAPI通道下，萌發(fā)孔和萌發(fā)溝均呈現(xiàn)出了較強(qiáng)的熒光。碘化丙啶染色后，DAPI、CFP、GFP和YFP通道下萌發(fā)孔呈現(xiàn)較強(qiáng)熒光，并且在DAPI通道下，萌發(fā)溝亮度也明顯增強(qiáng)；此外，在CFP、GFP和YFP通道下，花粉外壁網(wǎng)孔內(nèi)壁也被染色，從而網(wǎng)脊和網(wǎng)孔呈現(xiàn)連續(xù)熒光，影響對網(wǎng)孔的觀察。吖啶橙染色后，DAPI通道和RFP通道基本沒有變化，但CFP、YFP和GFP通道下，萌發(fā)孔周圍呈現(xiàn)非特異性熒光。

3 討論

花粉具有自發(fā)熒光，不同種類植物花粉的自發(fā)熒光光譜并不相同。Urbanczyk等[14]的研究表明，39種不同泥炭植物的發(fā)射光譜最大峰值多位于465～565 nm之間。本研究中西瓜花粉在DAPI通道（420～470 nm）熒光強(qiáng)度最大，說明植物花粉的熒光光譜具有特定的特征。Mitsumoto等[11]發(fā)現(xiàn)花粉藍(lán)色熒光和紅色熒光的比值甚至可以在種的水平區(qū)分物種。此外本研究發(fā)現(xiàn)，西瓜花粉在貯藏期間可保持較強(qiáng)熒光，在4 ℃冷藏4周后，除黃色熒光外其他通道熒光強(qiáng)度均無明顯降低（圖2）。

結(jié)合激光共聚焦掃描顯微鏡，花粉的自發(fā)熒光也可以用來成像[5，15]，但是，自發(fā)熒光在花粉表面的分布并不均勻，例如，本研究中西瓜花粉的外壁紋理可以清楚成像，在不同熒光通道均可成像，不僅可用于分析花粉粒的大小、形狀，還可以分析網(wǎng)紋的大小、形態(tài)。而萌發(fā)孔和萌發(fā)溝雖然沒有熒光，但和外壁網(wǎng)紋區(qū)分明顯，形態(tài)大小均可觀察。由于花粉中有多種熒光物質(zhì)[7]，花粉表面熒光的強(qiáng)弱、分布及光譜和這些熒光物質(zhì)的分布可能就存在相關(guān)性。因此，本研究在對樣品未做任何處理的情況下，分析了花粉的熒光成像特點(diǎn)，結(jié)果暗示西瓜花粉外壁網(wǎng)紋中應(yīng)富含熒光物質(zhì)。本研究表明，利用結(jié)構(gòu)照明和3D成像顯微鏡，也可以對花粉進(jìn)行熒光成像，并且適用于表面結(jié)構(gòu)紋理熒光種類差異較大的花粉成像。和經(jīng)典的掃描電子顯微鏡成像[1-3]相比，利用花粉自發(fā)熒光成像具有簡單、快捷的優(yōu)勢，但是光學(xué)顯微鏡的分辨率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于電子顯微鏡。因此，對于那些粒徑較小的花粉以及花粉表面精細(xì)紋理結(jié)構(gòu)的觀察，是本方法以及前人報(bào)道的其他光學(xué)顯微觀察方法[8-10]難以達(dá)到的。

為了進(jìn)一步對沒有自發(fā)熒光的部位進(jìn)行成像，本研究篩選了常用于花粉和細(xì)胞壁染色觀察的染料，包括：苯胺藍(lán)[13]、Calcoflour white[16]、碘化丙啶[17]和吖啶橙[18]。這4種染料除了吖啶橙是非特異染料外，苯胺藍(lán)、Calcofluor white和碘化丙啶分別可特異性的和胼胝質(zhì)[13]、葡聚糖[19]和半乳醛聚糖[20]這些多糖類物質(zhì)特異性結(jié)合。因此，利用這些染料染色后觀察花粉的熒光成像特征，也可以進(jìn)一步分析花粉表面的化學(xué)物質(zhì)組成分布，本研究的結(jié)果（圖5）表明了萌發(fā)孔、萌發(fā)溝和外壁網(wǎng)紋在化學(xué)組成上的差異。但是，染色的效率不僅和這些化合物的含量相關(guān)，還受到花粉表面發(fā)育狀況、固定方法的影響[21]。因此，對于不同種類的花粉的染色觀察，需要分別探索建立適合的方法。

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