林榕燕 鐘淮欽 葉秀仙 黃敏玲

摘 要 為研究磷酸甘露糖變位酶基因（PMM）的功能及其在多糖生物合成中的表達調控機制，以霍山石斛原球莖為材料，利用RT-PCR技術，克隆PMM基因，對其 cDNA序列和表達情況進行分析。結果顯示：霍山石斛PMM基因cDNA序列長949 bp，包含一個747 bp的開放閱讀框，共編碼248個氨基酸，GenBank中的登錄號為KY912084。生物信息學分析表明：該蛋白屬于HAD超家族，可能是一種穩(wěn)定的、不具有信號肽和跨膜結構的親水蛋白。系統(tǒng)進化樹分析表明，霍山石斛PMM與鐵皮石斛、海棗、油棕、蘆筍親緣關系較近，處于同一分支。qPCR結果顯示：PMM基因在莖中的相對表達量最高；在4種不同藥用石斛比較中，鼓槌石斛的相對表達量最高，霍山石斛的表達量最低。本研究結果表明PMM基因可能不僅參與到石斛多糖的合成，還與其它化合物的生物合成相關。

關鍵詞 霍山石斛；PMM基因；克?。籷PCR

中圖分類號 S682.31 文獻標識碼 A

Abstract In the stusy， the cDNA sequence of PMM gene was isolated from the protocorm by RT-PCR， and its expression level was analyzed to elucidate the function of phosphomannomutase gene and its role during polysaccharides biosynthesis. The results showed that the length of PMM gene（accession number was KY912084 in GenBank）was 949 bp， containing a 747 bp open reading frame encoding 248 amino acids. Bioinformatics analysis showed that the protein belonged to HAD superfamily and might be a kind of hydrophily and stable protein， which had no signal peptide and transmembrane structures. The phylogenetic tree analysis showed that the protein had closer relationship with Dendrobium catenatum， Phoenix dactylifera， Elaeis guineensis and Asparagus officinalis， which at the same branch. qPCR results indicated that PMM gene was highly expressed in the stem and the relative expression of PMM gene was the highest in Dendrobium chrysotoxum and the lowest in Dendrobium huoshanense in the comparison of the four different medicinal dendrobium. The results suggested that PMM gene may not only be involved in the synthesis of dendrobius polysaccharide， but also related to the biosynthesis of other compounds.

Key words Dendrobium huoshanense； PMM gene； cloning； qPCR

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.020

霍山石斛（Dendrobium huoshanense），又名米斛，是蘭科石斛屬多年生草本植物，更是眾多保健藥品和保健食品的主要來源之一[1-3]，是石斛屬植物中藥用價值較高的一種石斛[4]。由于霍山石斛對生長環(huán)境要求十分苛刻，自然繁殖效率極低，加上人工的長期采挖，其野生資源已難覓蹤跡[5]?；蚬こ碳夹g能夠為植物的改良提供理論依據和物質基礎，近幾十年來，對霍山石斛進行了大量的研究，特別是組織培養(yǎng)技術取得了較大的進展[6-7]，但在基因工程研究方面，有關霍山石斛的報道還較少。石斛多糖是石斛屬植物的主要有效成分之一[8-9]，因此通過基因工程手段提高石斛多糖的含量具有重大意義。

石斛中的多糖主要由葡萄糖和甘露糖等單糖組成，從兜唇石斛中提取的多糖AP-l、AP-2和AP-3為β（l→4）連接的直連D-葡萄甘露聚糖[10]；密花石斛中分離得到的均一多糖DDP-1-D也被證實為葡萄甘露聚糖，主要由D-葡萄糖和D-甘露糖按3.01 ∶ 1的比例組成[11]；從流蘇石斛分離獲得的3種均一性多糖，經結構鑒定發(fā)現這3種多糖都是由葡萄糖和甘露糖按不同比例構成的[12]；袁晨琳[13]從霍山石斛中分離得到七種組分多糖，它們均由葡萄糖、半乳糖和甘露糖以不同的摩爾比組成。磷酸甘露糖變位酶（Phosphomannomutase，PMM）屬于一類新型的磷酸轉移酶，能夠催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之間的相互轉變，為合成GDP-甘露糖提供底物[14]。而GDP-甘露糖作為甘露糖供體參與到抗壞血酸、細胞壁多糖、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白、褐藻膠和巖藻聚糖等的生物合成中[15-18]。目前有關磷酸甘露糖變位酶的研究在真菌[19-21]、動物[22-23]、植物[24-25]中均有報道，但在霍山石斛中還未見任何報道。本研究以霍山石斛原球莖為材料，克隆了PMM基因，對其cDNA序列進行分析，并利用qPCR技術檢測了霍山石斛不同組織及不同品種藥用石斛中PMM基因的表達情況，為后續(xù)研究磷酸甘露糖變位酶的功能以及石斛多糖合成代謝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

選取繼代培養(yǎng)50 d的生長旺盛的霍山石斛原球莖為材料，用于基因克??；選取繼代培養(yǎng)120 d的霍山石斛試管苗中的莖、葉、根以及4種不同藥用石斛（霍山石斛、金釵石斛、鐵皮石斛、鼓槌石斛）的試管苗為試驗材料，用于定量表達分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA的合成 采用通用植物總RNA提取試劑盒對供試材料進行總RNA的提取，并進行試驗所需的cDNA的合成。除5′RACE外，其它步驟中所用cDNA的合成都是采用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按說明書進行具體操作步驟，采用AP接頭作為引物進行逆轉錄，5′RACE 所需cDNA的逆轉錄是在反轉錄的cDNA第一鏈基礎上進行純化和加尾。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 利用NCBI數據庫中植物相關的PMM核酸序列信息，完成PMM基因保守區(qū)引物的設計。而后根據PMM基因保守區(qū)的測序結果設計3′RACE和5′RACE 所需要的引物。然后拼接所獲的的各片段序列，設計一對引物用于ORF的擴增。本試驗所用的各項引物見表1。PCR擴增反應及后續(xù)步驟參照樊榮輝等[26]的試驗方法進行。

1.2.3 生物信息學分析 參照林榕燕等[27]的分析方法，利用ExPASy軟件、CBS Prediction Servers軟件、Conserved Donain Search軟件、PSORT軟件以及PredictProtein軟件進行蛋白理化性質和結構特征分析，并利用MEGA5.0軟件（Neighbor-Joining，鄰位相連法）進行系統(tǒng)進化樹的構建。

1.2.4 霍山石斛PMM基因定量表達分析 本研究采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑（Takara）和ABI7500實時熒光定量PCR儀器（美國ABI公司），以18S rRNA作為參照基因，依據熒光引物設計原則，設計定量引物PMM-RT-F和PMM-RT-R用于PMM的qPCR擴增，檢測PMM基因在霍山石斛不同組織以及不同品種藥用石斛試管苗中的表達情況。每個反應包括3個重復，具體操作流程參照林榕燕等[27]的研究。

2 結果與分析

2.1 霍山石斛PMM基因cDNA序列的獲得

通過PMM基因保守區(qū)的PCR擴增，獲得一條455 bp的特異性條帶，片段大小與預期一致。而后進行5′RACE和3′RACE擴增，分別得到174 bp和503 bp的條帶，與預計的一致。將以上的3段序列進行拼接，得到長為949 bp的PMM核酸序列。應用ORF擴增引物（表1）驗證得到一條786 bp的特異性條帶（圖1）。測序結果經檢索，與其它植物有較高的同源性，說明本研究克隆得到的確實是霍山石斛PMM基因序列。該序列長949 bp，包含一個完整的共747 bp的ORF（6-752），編碼248個氨基酸，以及5 bp的5′UTR，197 bp的3′UTR（含poly A）。該基因在GenBank上的登錄號為KY912084。PMM基因cDNA的核苷酸序列及推導的氨基酸序列見圖2。

2.2 霍山石斛PMM基因編碼蛋白質理化性質和結構特征分析

利用ProtParam軟件和ProtScale軟件對霍山石斛PMM蛋白質理化性質分析的結果顯示，該蛋白的分子式為C1 275H1 977N327O376S8，由20種共248個氨基酸組成，分子量為28 159.17，原子總數為3 963。預測結果還顯示該蛋白不穩(wěn)定系數為37.98，推測該蛋白是一個穩(wěn)定蛋白；總平均疏水指數為-0.289，疏水性最高值2.122出現在第39個氨基酸處；親水性最強值-2.956出現在第139個氨基酸處；故推測該蛋白為親水性蛋白。

信號肽、跨膜結構及卷曲螺旋的預測結果表明：霍山石斛PMM的C值、Y值、以及D值均小于0.5，且從N末端開始的前60個氨基酸期望值為0.000 34，小于10，由此看出，霍山石斛PMM蛋白不含有信號肽。PMM蛋白的跨膜螺旋氨基酸期望值為0.001 71，遠小于18，推測該蛋白不具有跨膜結構。PMM蛋白在值窗口值為14，21和28時形成卷曲螺旋的預測概率均遠低于0.5，預測該蛋白無法形成卷曲螺旋結構。

蛋白質的功能與其亞細胞定位有著緊密的相關性，對霍山石斛PMM蛋白的亞細胞定位的預測結果表明：該蛋白定位于微體的可能性最大，為57.2%；定位于細胞質的可能性為45.0%；定位于線粒體基質的可能性較低，為10.0%。

通過分析霍山石斛PMM蛋白的保守結構域，結果發(fā)現該蛋白屬于HAD超家族，還含有植物PMM蛋白特有的3個保守的結構域：保守序列為DXDXTLX的區(qū)域Ⅰ、保守序列為DKTY的結構域Ⅲ以及保守序列為[GSTDE][DSEN][DSENVG]的區(qū)域Ⅳ。這些保守結構域的存在是霍山石斛PMM蛋白行駛其功能所必須的。

對霍山石斛PMM蛋白的二級結構進行分析，結果顯示PMM的二級結構由39.92%的螺旋結構、36.29%的卷曲結構以及23.79%的折疊結構組成。利用SWISS-MODEL軟件，以5ue7.1.A為模板，預測霍山石斛PMM蛋白的三維結構，結果見圖3。從圖中可以看出該蛋白的主要結構元件還是螺旋、折疊和卷曲，與二級結構的預測結果相符。

2.3 霍山石斛PMM蛋白同源性和進化分析

選取包括霍山石斛（Dendrobium huoshanense，KY912084）在內的7種不同物種的氨基酸序列，利用DNANAN軟件進行序列多重比對分析。分析結果表明，不同植物的PMM之間具有較高的一致性，達到88.41%。同時發(fā)現，霍山石斛PMM的功能域氨基酸組成與其它植物幾乎一致，即都含有保守序列為DXDXTLX的區(qū)域Ⅰ、保守序列為XXSX的結構域Ⅱ、保守序列為DKTY的結構域Ⅲ以及保守序列為[GSTDE][DSEN][DSENVG]的區(qū)域Ⅳ（圖4方框所示）。

根據NCBI Blast比對結果顯示，PMM cDNA核酸序列推導的氨基酸序列與其它植物的同源性均較高，與鐵皮石斛（Dendrobium catenatum，AHY34917.1）的同源性最高，為99%。其它依次為：木本棉（Gossypium arboreum，XP_017616871.1）和黃麻（Corchorus capsularis，OMO78718.1）的88%，蘆筍（Asparagus officinalis，XP_020274219.1）和葡萄（Vitis vinifera，XP_002267677.1）的87%，海棗（Phoenix dactylifera，XP_008806840.1）和油棕（Elaeis guineensis，XP_010934857.1）的86%，玉米（Zea mays，NP_

001140792.1）、短花藥野生稻（Oryza brachyantha，XP_006653042.2）、小米（Setaria italica，XP_004960027.1）以及馬鈴薯（Solanum tuberosum，XP_006345602.1）的84%，二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003580842.1）、碧桃（Prunus persica，XP_007221006.1）和大葉藻（Zostera marina，KMZ62827.1）的83%。

以包括霍山石斛PMM的編碼蛋白在內15種不同物種的PMM氨基酸序列為模板，構建PMM的系統(tǒng)進化樹，進化樹中數字代表Bootstrap值。從進化樹結果（圖5）可以看出，序列被分為2個大的分支，包括霍山石斛在內的5種單子葉植物為一個分支；其它10種植物為另一分支，該分支中又可分為2大類，分別為單子葉和雙子葉植物。值得注意的是單子葉植物大葉藻被劃分到雙子葉植物這一類別，說明大葉藻的PMM氨基酸序列與雙子葉植物較為接近?；羯绞鶳MM首先與鐵皮石斛、海棗、油棕、蘆筍處于同一分支，與它們的親緣關系較近，其次是另一分支中的單子葉植物包括玉米、短花藥野生稻、二穗短柄草和小米。

2.4 定量表達分析

為了解PMM基因在霍山石斛不同組織中的表達水平，選取莖、根、幼葉及成熟葉為材料，以18S rRNA為參照基因，不同組織中的相對表達量見圖6。從圖中可以看出，霍山石斛PMM基因的相對表達量高低依次為莖> 成熟葉> 根> 幼葉。運用SPSS軟件分析發(fā)現，幼葉與其它3種組織間的相對表達量存在顯著性差異。

利用qPCR技術檢測PMM在4種不同藥用石斛，霍山石斛、金釵石斛、鐵皮石斛和鼓槌石斛試管苗中的表達情況，結果顯示PMM基因在不同石斛品種中的相對表達量大小依次為鼓槌石斛、金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛，且各品種間的相對表達量存在顯著差異。

3 討論

本試驗從霍山石斛原球莖中克隆得到PMM基因，其編碼248個氨基酸，與大部分真核生物中的 PMM長度相似。通過BLAST比對，發(fā)現該氨基酸序列與鐵皮石斛、木本棉、黃麻、蘆筍、葡萄、海棗、油棕等植物有很高的同源性，基本都在80%以上。蛋白質作為生命活動的主要承擔者，對其氨基酸序列的結構和功能進行預測與分析，可以為闡明生命現象的本質奠定理論基礎。本研究利用軟件對霍山石斛PMM蛋白進行理化性質和結構特征分析，發(fā)現該蛋白屬于親水性、穩(wěn)定性、不含信號肽和跨膜結構的蛋白，屬于 HAD 超家族的成員。HAD 超家族是一個巨大的蛋白家族[28]，其中包括各種各樣的酶，數量龐大，如磷酸甘露糖變位酶、磷酸酯酶以及脫鹵酶等，涵蓋了眾多代謝途徑。該家族有4個極為保守的基序，其中motif I的保守序列為D x x x[TV]，第一個天冬氨酸可作為必要的Asp親核試劑；motif II的保守序列為[S/T]，其中的氨基酸殘基可通過氫鍵結合到底物的磷酸基團；motif III和motif Ⅳ保守序列分別為DKTY和[GSTDE][DSEN][DSENVG]，參加到 ASP親核劑對底物磷酸基團的定向，并能夠結合Mg2+[29]。本研究所克隆得到的PMM基因序列與其它植物相比，具有較強的保守性，也表明本次試驗的可靠性。

磷酸甘露糖變位酶能夠催化D-甘露糖-6-磷酸和D-甘露糖-1-磷酸之間的相互轉化，一定程度上為GDP-甘露糖的合成提供前體物質。有研究證明該基因還參與抗壞血酸、含甘露糖的多糖、糖基化蛋白等的生物合成。經由農桿菌介導方法，將水稻PMM基因（OsPMM）轉入到粳型三系恢復系C418中，結果發(fā)現其在轉基因植株中的相對表達量明顯提高，相應地，抗壞血酸含量也有所提升[30]。在本氏煙中對PMM基因進行病毒誘導的基因沉默研究發(fā)現，減量表達該基因，葉片中維生素C的含量降低了；同時過表達該基因則可以提高葉片中維生素C的含量[14]。通過構建鐵皮石斛[31]PMM超表達載體，并對其進行功能驗證，結果顯示，相較于對照植株，轉基因擬南芥植株中的抗壞血酸含量和多糖含量均有明顯增加，說明鐵皮石斛PMM基因與抗壞血酸和多糖合成代謝有關。系統(tǒng)進化樹結果顯示霍山石斛PMM與鐵皮石斛PMM的親緣關系最近，推測二者之間的功能具有一定的相似性，說明霍山石斛PMM可能參與到抗壞血酸和多糖生物合成代謝中。

為探究PMM基因在霍山石斛多糖合成中的作用，本研究通過定量表達分析發(fā)現霍山石斛PMM基因在莖中的相對表達量最高，且成熟葉的相對表達量高于幼葉；這與鐵皮石斛PMM在營養(yǎng)生長和生殖生長階段的莖中均高度表達的結果基本一致[31]。結合金海英等[32]對霍山石斛多糖含量變化規(guī)律的研究發(fā)現，隨著培養(yǎng)周期的延長，多糖含量逐漸增加；以及基于莖是石斛多糖存儲的主要部位這一認知，推斷PMM基因可能與石斛多糖的生物合成相關。通過對不同藥用石斛品種中PMM基因的相對表達量比較發(fā)現，鼓槌石斛的表達水平明顯高于金釵石斛、鐵皮石斛和霍山石斛。而王再花等[33]對35種石斛材料的多糖含量測定發(fā)現，與鼓槌石斛和金釵石斛相比較，鐵皮石斛的多糖含量遙遙領先。鄭志新等[34]的研究也證明了鼓槌石斛的多糖含量低于鐵皮石斛。由此推測，PMM基因不僅參與到石斛多糖的合成，還可能與其它化合物的生物合成相關。因此，霍山石斛PMM基因的克隆與表達分析，將有助于該基因的功能及石斛多糖生物合成的進一步研究。

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