姚 毅，馬紅艷，呂學(xué)斌，楊躍奎*

（1. 運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城 044000；2. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610000）

北川白山羊FABP3基因cDNA的克隆及表達(dá)研究

姚 毅1，馬紅艷1，呂學(xué)斌2，楊躍奎2*

（1. 運(yùn)城農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山西運(yùn)城 044000；2. 四川省畜牧科學(xué)研究院，四川成都 610000）

脂肪酸結(jié)合蛋白（Fatty aicd Binding Protein 3, FABP3）是細(xì)胞內(nèi)脂類伴侶。本研究采用RT-PCR和RACE技術(shù)，分離并克隆山羊FABP3基因的cDNA序列，結(jié)合實時定量分析山羊FABP3在10個不同組織和5個不同泌乳時期的相對表達(dá)。結(jié)果表明：FABP3基因的mRNA序列全長為714 bp，包括5'非翻譯區(qū) 64 bp，CDS區(qū) 402 bp和3'非翻譯區(qū) 248 bp，共計翻譯為133個氨基酸，山羊FABP3與GenBank中牛（Bos taurus）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）的核苷酸同源性較高，分別為96%、89% 、87%；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示，F(xiàn)ABP3蛋白分子量為 14.76 ku，等電點為6.11，不具有信號肽序列，沒有跨膜結(jié)構(gòu)；組織表達(dá)分析表明，F(xiàn)ABP3基因在山羊的心臟組織中表達(dá)量最高，小腸次之，表達(dá)量最少的為肌肉組織；山羊5個不同泌乳時期乳腺組織FABP3的表達(dá)量分析表明，泌乳盛期的表達(dá)量最高，約為干奶期的130倍。

山羊；FABP3；克?。唤M織表達(dá)

脂肪酸結(jié)合蛋白是一種低分子量的蛋白，有明顯的組織特異性分布。在脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞生長、細(xì)胞信號和基因轉(zhuǎn)錄等方面發(fā)揮重要的作用[1]。脂肪酸結(jié)合蛋白在心肌細(xì)胞中能夠協(xié)助脂肪酸的移動。有研究表明，在心室隔膜有缺陷的病人的心肌上，脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)[2]。在胚胎上皮癌細(xì)胞中，超表達(dá)脂肪酸結(jié)合蛋白可以抑制增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[3]。在基因敲除鼠模型中，已經(jīng)探索了脂肪酸結(jié)合蛋白的生理學(xué)作用。脂肪酸結(jié)合蛋白的敲除鼠主要集中在心臟和骨骼肌中脂肪酸代謝的效應(yīng)方面，在這2種組織中，脂肪酸結(jié)合蛋白大量表達(dá)[4]。體內(nèi)的標(biāo)記研究顯示[5]，脂肪酸結(jié)合蛋白敲除鼠的心臟組織中，棕櫚酸和花生四稀酸的吸收減少了，在分離的心肌細(xì)胞中棕櫚酸和花生四稀酸的吸收也少了。FABP3基因在牛泌乳的乳腺組織中表達(dá)量很高，特別是從非泌乳期到泌乳期，F(xiàn)ABP3的mRNA表達(dá)量極大地上調(diào)了大約40倍以上[6]。除了運(yùn)輸脂肪酸的作用，脂肪酸結(jié)合蛋白也可以通過和激活的乙酰輔酶A結(jié)合進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞不受激活脂肪酸的負(fù)面效應(yīng)。在雞的研究中已經(jīng)證明了脂肪酸結(jié)合蛋白和硬酯酰輔酶A脫氫酶有互相調(diào)控的關(guān)系，暗示了這兩種蛋白可能在乳腺組織中協(xié)同發(fā)揮作用[7]。在牛的乳腺組織中，脂肪酸結(jié)合蛋白能夠為硬酯酰輔酶A脫氫酶提供脂肪酸[8]。在牛的乳腺上皮細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪酸結(jié)合蛋白的表達(dá)和活性在棕櫚酸和硬脂酸的脫氫過程中發(fā)揮優(yōu)先提供通道的作用，脂肪酸結(jié)合蛋白和棕櫚酸以及硬脂酸有比較高的親和力[9]。本研究旨在分析FABP3基因在不同組織和泌乳期的mRNA表達(dá)，探討其在脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中的功能和作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 泌乳北川白山羊的乳腺組織樣品利用外科手術(shù)法采集。選擇乳腺組織左邊或者右邊四分之一位置靠中間補(bǔ)位進(jìn)行采樣（大約10 cm2），保證采樣區(qū)域不重合。小心剃毛和清洗乳腺組織采樣部位，注射通用麻醉劑，用手術(shù)刀切開3～4 cm的切口，避免割開任何大的皮下血管。采集2～3 g的乳腺組織，盡快放到液氮中，儲存在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 提取RNA用的QIAzol購自德國QIAGEN公司，實驗中用到的內(nèi)切酶購自美國NEB公司、HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix購自上海翊圣生物科技有限公司，細(xì)胞中的RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，DNA膠回收試劑盒和大腸桿菌菌株TOP 10購自北京天根生化科技有限公司，T4連接酶購自Promega公司，DEPC水、IPTG和氨芐青霉素購自四川利他利安科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)已知的奶牛和綿羊的FABP3基因序列，利用Primer 5軟件設(shè)計北川白山羊FABP3基因CDS區(qū)上、下游引物，見表1。根據(jù)經(jīng)測序檢測正確的白山羊FABP3基因CDS區(qū)序列以及TaKaRa 3' RACE試劑盒設(shè)計3' RACE引物，參考FABP3基因CDS區(qū)序列以及Invitrogen公司的 5' RACE試劑盒說明，利用Primer 5軟件設(shè)計5' RACE引物，見表1。

1.2.2 RNA 提取、cDNA 合成以及實時定量分析各組織中的總RNA提取利用TRIzol法進(jìn)行，細(xì)胞內(nèi)的總RNA提取參考天根總RNA提取試劑盒方法進(jìn)行， RNA 經(jīng)DNAase處理除去污染后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的方法參考TaKaRa的cDNA第1鏈合成試劑盒說明書操作。設(shè)計參照基因核糖體蛋白S9基因（RPS9）實時定量引物，通過RT-qPCR檢測FABP3基因在5個不同泌乳時期和10個不同組織中的mRNA相對表達(dá)水平。本實驗熒光定量反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Premix Taq 2×mix 5 μL，上、下游混合引物各0.4 μL，cDNA 0.4 μL，ROX Reference Dye（50×） 0.2 μL，ddH2O 4.0 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃ 31 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 30 s，95℃ 15 s繪制熔解曲線。以RPS9為內(nèi)參基因，用2-ΔΔCt進(jìn)行相對定量法分析。

1.2.3 山羊FABP3基因的克隆 利用PCR方法擴(kuò)增FABP3基因CDS區(qū)，并按照Takara的3'-Full RACE Core Set的說明書操作來獲取3 '側(cè)翼端的序列，同時按照5'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends 的說明書操作來獲取5'側(cè)翼端的序列，以得到FABP3基因的cDNA全長序列。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 將山羊FABP3基因的核苷酸序列放入NCBI網(wǎng)站中blastn（http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）中與其他物種的核苷酸序列進(jìn)行比對，同時應(yīng)用blastp對其氨基酸序列進(jìn)行比對，并對其同源性進(jìn)行分析。另外應(yīng)用ExPASy網(wǎng)站中的ProtScale （http://web.expasy.org/protscale/）分析 FABP3基因氨基酸序列的疏水性，通過CBS Prediction Servers （http://www.cbs.dtu.dk/ services/）的TMHMM 和SignalP分別對FABP3基因的跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽區(qū)域進(jìn)行預(yù)測。

1.2.5 統(tǒng)計分析 每個實驗重復(fù)3次。利用SPSS22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并用ANOVA檢測顯著性，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

表1 山羊FABP3基因cDNA克隆引物序列信息

表2 用于實時定量的基因及其引物和引物擴(kuò)增大小

2 結(jié) 果

2.1 山羊FABP3基因cDNA的克隆和序列分析通過RT-PCR和RACE技術(shù)，以山羊泌乳盛期乳腺的總RNA為模板，克隆獲得山羊FABP3基因的cDNA全長序列，為714 bp （GenBank收錄號為FJ844408）。通過對序列進(jìn)行分析表明，該基因的開放閱讀框（ORF）為 402 bp，編碼133個氨基酸，ATG為其起始密碼子，TGA為其終止密碼子；5'UTR為64 bp，3'UTR b包含加尾信號AATAA和完整的poly （A）尾巴，長為248 bp。FABP3蛋白質(zhì)的分子量為14 761 u，等電點（pI）為6.11。

2.2 山羊FABP3的同源性分析 通過以上序列比對發(fā)現(xiàn)，山羊FABP3基因的ORF與GenBank中已發(fā)表的牛（BC102153.1）、人（BC007021.1）和小鼠（NM_010174.1）FABP3基因相比較，具有較高的核苷酸相似性，分別為97%、 88%和83%，氨基酸序列同源性分別為 96%、89% 、 87%。其非翻譯區(qū)核苷酸序列與牛、人和小鼠的相應(yīng)序列相比較，5'UTR相似性為95%、97%和 31%，3'UTR相似性分別為94%、72%、77%。

圖1 山羊FABP3跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.3 山羊FABP3的結(jié)構(gòu)分析 SignalP預(yù)測分析表明，山羊FABP3無信號肽序列（圖略）；而通過TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測則發(fā)現(xiàn)，此序列并無跨膜結(jié)構(gòu)，如圖1，表明山羊FABP3蛋白不是膜蛋白，符合相關(guān)報道的結(jié)果；蛋白質(zhì)疏水性預(yù)測分析結(jié)果表明，F(xiàn)ABP3具有較強(qiáng)的疏水結(jié)構(gòu)，其親水結(jié)構(gòu)（score＜-2.0）和疏水區(qū)域（score＞1.0）同時存在于N端，且分布總體比較均勻，如圖2，按分值大小劃分，其疏水最大值為1.367，最小值為-2.444，分別位于第113和第76 AA處。

2.4 組織表達(dá)和泌乳不同時期表達(dá)分析 以RPS9基因為內(nèi)參基因，通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)山羊FABP3基因在10個不同組織間均有表達(dá)，但差異較大。該基因在心臟組織和小腸中均具有較高的表達(dá)量，其次為在腎臟、脾臟、肝臟和脂肪組織中的表達(dá)量，瘤胃、肺和肌肉組織中的表達(dá)量較低。在干奶期的乳腺組織中表達(dá)量較低，約為肝臟組織的二十八分之一（圖3）。通過熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，干奶期FABP3基因的表達(dá)量最低，伴隨著泌乳的進(jìn)行，F(xiàn)ABP3基因的表達(dá)量逐漸升高，直到泌乳盛期、泌乳中期和泌乳末期FABP3基因的表達(dá)量又逐漸降低。泌乳盛期FABP3基因的表達(dá)量約為干奶期的130倍（P＜0.05），見圖4。

圖2 山羊FABP3的疏水結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖3FABP3基因在山羊10個不同組織的相對表達(dá)分析

圖4FABP3基因在山羊乳腺5個不同泌乳階段的相對表達(dá)分析

3 討 論

3.1 FABP3基因cDNA的克隆及序列和結(jié)構(gòu)分析本研究克隆了北川白山羊FABP3基因的全長，通過同源性分析發(fā)現(xiàn)山羊FABP3基因CDS區(qū)核苷酸和氨基酸序列與牛、人和小鼠的同源性較高，均達(dá)到80%以上，說明FABP3基因在不同物種間功能區(qū)域較為保守。其非翻譯區(qū)與其他物種序列相比差異性較大，說明山羊FABP3基因的調(diào)控機(jī)制可能不同于牛、人及小鼠該基因的調(diào)控機(jī)制。FABP3蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域由疏水氨基酸殘基（20個左右）構(gòu)成，是與質(zhì)膜蛋白結(jié)合的主要部位。ProtScale的預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)ABP3蛋白在113左右的肽段具有較強(qiáng)的疏水性，而在76、100左右的肽段親水性較強(qiáng)， FABP3缺乏20個以上連續(xù)疏水的氨基酸結(jié)構(gòu)，因此推測其可能不具備跨膜結(jié)構(gòu)。SignalP的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果證實FABP3不具有跨膜結(jié)構(gòu)，這與前面ProtScale預(yù)測結(jié)果一致，也與FABP3屬于一種胞內(nèi)蛋白的相關(guān)報道一致。FABP3的這些結(jié)構(gòu)可能與其結(jié)合、運(yùn)載脂肪酸等配體的功能有密切關(guān)系。

3.2 FABP3在不同泌乳時期和不同組織中的表達(dá)譜分析 FABP3在妊娠期就開始表達(dá)，泌乳初期的相對表達(dá)量為1，泌乳盛期的相對表達(dá)量為11.7，隨泌乳停止而表達(dá)量急劇下降。乳腺中存在3種脂肪酸結(jié)合蛋白，F(xiàn)ABP3是其中之一，主要與脂肪酸的攝取和定向轉(zhuǎn)運(yùn)、脂肪酸濃度調(diào)節(jié)和刺激乳中的酪蛋白合成相關(guān)[11]。泌乳盛期乳脂和乳蛋白的合成和需求增加，在盛期FABP3的表達(dá)大量上升是此時乳腺泌乳性能增大的需要。本研究進(jìn)一步證明了FABP3在山羊泌乳期發(fā)揮重要作用，同時與乳腺脂質(zhì)合成密切相關(guān)，在細(xì)胞內(nèi)脂肪轉(zhuǎn)運(yùn)中有重要功能，與在奶牛和小鼠中的研究結(jié)果一致[12]。

FABP3在多種組織中普遍存在，特別是對脂肪酸有高度需求的組織[13]，如泌乳的乳腺、骨骼肌和心肌等組織。在動物未成熟的肌肉組織中，F(xiàn)ABP3的表達(dá)量極微，而當(dāng)細(xì)胞開始吸收脂肪酸補(bǔ)給能源時，F(xiàn)ABP3的表達(dá)量才迅速提高。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在2月齡藏豬心臟組織和肌肉組織中的表達(dá)量最高，其次在腎臟組織中的表達(dá)量較高，在肝臟組織中的表達(dá)量最低[14]。在小鼠中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ABP3基因在心臟中高表達(dá)，在腎臟和肝臟中表達(dá)量較低。FABP3基因在不同的組織和泌乳期mRNA表達(dá)的差異暗示了其可能在脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝方面發(fā)揮不同特異性的功能和作用。

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S827.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-06-054

2017-03-16；

2017-04-18

國家科技支撐計劃（2011BAD28B01）

姚毅（1979-），男，山西河津人，講師，碩士，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：11748276@qq.com * 通訊作者：楊躍奎，E-mail: 1476079908@qq.com