趙東曉 陳弘磊 孟冠敏 李芳瓊 王偉

低濃度雷公藤甲素聯(lián)合順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響

趙東曉1陳弘磊2孟冠敏2李芳瓊2王偉2

目的探討低濃度雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響，及其逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的可能機(jī)制。方法將人肝癌細(xì)胞HepG2分為順鉑單用組和雷公藤甲素加順鉑聯(lián)合用藥組。順鉑單用組分別用濃度為0、2.5、5、10、20、40μg/mL的順鉑處理，聯(lián)合用藥組同時(shí)聯(lián)合低濃度雷公藤甲素（12.5ng/mL）處理HepG2。CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖的抑制率；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞內(nèi)P糖蛋白的表達(dá)。結(jié)果順鉑單用組各濃度（0、2.5、5、10、20、40μg/mL）對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞活力24h的抑制率分別為0、（4.0±1.0）%、（9.7±1.1）%、（29.4±2.4）%、（47.5±2.5）%、（62.9±1.2）%，聯(lián)合用藥組24h抑制率分別為（4.7±1.0）%、（37.1±3.1）%、（44.1±3.5）%、（57.9±3.0）%、（66.9±2.0）%、（74.9±2.0）%，兩組比較，細(xì)胞活力抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡后發(fā)現(xiàn)，順鉑單用組（0、5、10、40μg/mL）誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞早期凋亡率分別為（4.3±0.3）%、（8.4±0.3）%、（9.6±0.3）%、（32.3±2.0）%，而聯(lián)合用藥組細(xì)胞早期凋亡率分別增加至（9.6±0.4）%、（16.2±0.2）%、（23.2±0.5）%、（53.0±3.6%），兩組比較，細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；PE單染檢測(cè)P糖蛋白后發(fā)現(xiàn)，順鉑單用組（0、5、10、40μg/mL）細(xì)胞內(nèi)P糖蛋白表達(dá)率分別為（37.3±0.4）%、（34.2±0.5）%、（30.1±1.1）%、（34.2±2.3）%，無(wú)明顯變化，而聯(lián)合用藥組P糖蛋白的表達(dá)率分別降低至（25.0±1.8）%、（18.6±0.7）%、（8.9±0.3）%、（1.8±0.1）%，兩組P糖蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥可以顯著抑制人肝癌HepG2的增殖并誘導(dǎo)凋亡，同時(shí)調(diào)節(jié)HepG2的順鉑耐藥性，其作用機(jī)制可能與P糖蛋白下調(diào)相關(guān)，從而對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2發(fā)揮抗腫瘤作用。

肝癌細(xì)胞；HepG2；雷公藤甲素；順鉑；耐藥；P糖蛋白

肝癌是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見(jiàn)惡性腫瘤。肝癌患者對(duì)于化療藥物的耐藥是導(dǎo)致治療失敗、影響肝癌治愈率和遠(yuǎn)期生存率的主要原因[1]。順鉑作為肝癌的基本化療藥，是一種作用于細(xì)胞周期的非特異性藥物，但易產(chǎn)生耐藥性，其有效率只有20%～40%[2]。研究證明，由多藥耐藥蛋白P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）介導(dǎo)的藥物泵出增多、細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低在多種抗腫瘤藥物耐藥中存在，順鉑耐藥也與P-gp的表達(dá)有著一定的關(guān)系[3]。雷公藤甲素（triptolide，TP）是從雷公藤中提取的活性較高的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物，具有良好的抗炎和抗腫瘤效果，它與目前臨床應(yīng)用的一些抗腫瘤藥物具有協(xié)同效應(yīng)，可以多靶點(diǎn)、多途徑、交叉發(fā)揮抗腫瘤作用[4-5]。聯(lián)合用藥可以降低化療藥的使用量，且在保證療效的同時(shí)，減少化療后的不良反應(yīng)，提高癌癥患者的生活質(zhì)量。本文研究低濃度雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2活性的影響，并探討其聯(lián)合用藥能否降低或逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞HepG2的順鉑耐藥性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株及其培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，生長(zhǎng)于含有10%小牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基；置37℃濕度飽和，含有5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器雷公藤甲素購(gòu)于上海源葉生物有限公司，純度＞98%（批號(hào)YY90104）；順鉑購(gòu)于南京制藥廠有限公司（批號(hào)H20103216）；胎牛血清購(gòu)于杭州四季青生物工程有限公司（批號(hào)141013）；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司（批號(hào)1694270）；胰蛋白酶購(gòu)于吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司（批號(hào)15111801）；雙抗（青霉素和鏈霉素混合液）購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司（批號(hào)：20150624-078）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）購(gòu)于東仁化學(xué)科技（上海）有限公司（批號(hào)GC762）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司（批號(hào)00101507）；PE Mouse Anti-Human P-glycoprotein購(gòu)于BD pharmingen公司（批號(hào)4269786）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口，純度為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力將HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，待細(xì)胞完全貼壁后，順鉑單用組分別加入順鉑0、2.5、5、10、20、40μg/mL，聯(lián)合用藥組再分別加12.5ng/mL的雷公藤甲素，共12個(gè)組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔總體積200μL，培養(yǎng)24、48h，另設(shè)對(duì)照組不加藥物培養(yǎng)。之后每孔加入20μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)3h，酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD）值。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率按以下公式計(jì)算：抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-藥物組OD值）/對(duì)照組OD值× 100%。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè)在HepG2細(xì)胞中加入0、5、10、40μg/mL的順鉑或12.5ng/mL的雷公藤甲素單獨(dú)及聯(lián)合用藥，對(duì)照組不加藥物，培養(yǎng)24h。收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)將Annexin-V和PI加入細(xì)胞中孵育20min后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡。凋亡率為Annexin-V陽(yáng)性細(xì)胞占所有細(xì)胞的比例。

2.3 細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)的檢測(cè)細(xì)胞分組、培養(yǎng)、加藥同細(xì)胞凋亡檢測(cè)步驟，不同加藥處理的細(xì)胞均培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞，按照說(shuō)明書(shū)加入10μL PE Mouse Anti-Human P-glycoprotein后孵育15min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)P-gp百分比。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（） 表示，應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，采用非配對(duì)雙邊t檢驗(yàn)以及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)順鉑和低濃度雷公藤甲素對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞均具有不同程度的抑制增殖作用，低濃度（12.5ng/mL）雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥后對(duì)細(xì)胞的抑制增殖作用更強(qiáng)，隨著順鉑濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制率呈明顯上升趨勢(shì)。順鉑單用組與聯(lián)合用藥組細(xì)胞活力抑制率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），順鉑和雷公藤甲素兩藥聯(lián)用有較好的協(xié)同作用，見(jiàn)表1～2。

表1 兩組HepG2腫瘤細(xì)胞抑制作用比較（）

表1 兩組HepG2腫瘤細(xì)胞抑制作用比較（）

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素

組別順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組孔數(shù)3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 DDP濃度（μg/mL）0 0 2.5 2.5 5 5 1 0 10 20 20 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5 24h抑制率（%）0 4.7±1.0** 4.0±1.0 37.1±3.1** 9.7±1.1 44.1±3.5** 29.4±2.4 57.9±3.0** 47.5±2.5 66.9±2.0** 62.9±1.2 74.9±2.0** 48h抑制率（%）0 18.5±2.0** 16.1±3.9 58.1±2.1** 36.9±3.4 69.1±1.2** 59.4±2.3 77.5±1.2** 67.4±2.7 83.9±2.0** 78.9±2.1 90.3±1.2**

表2 CCK-8方差分析表

3.2 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)采用Annexin V/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況，Annexin V+/PI（-）表示早期凋亡細(xì)胞，Annexin V+/PI（+）表示晚期凋亡細(xì)胞。用濃度分別為5、10、40μg/mL的順鉑對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2作用24h后均可引起HepG2細(xì)胞的凋亡（P<0.01）；加入12.5ng/mL的雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥24h后，人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡比單獨(dú)順鉑用藥更顯著，兩組細(xì)胞凋亡率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表3～4。

表3 兩組HepG2細(xì)胞凋亡率比較（）

表3 兩組HepG2細(xì)胞凋亡率比較（）

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素

組別順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組孔數(shù)DDP濃度（μg/mL）3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 5 5 1 0 10 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5早期凋亡率（%）4.3±0.3 9.6±0.4** 8.4±0.3 16.2±0.2** 9.6±0.3 23.2±0.5** 32.3±2.0 53.0±3.6**晚期凋亡率（%）0.8±0.2 0.8±0.1 1.0±0.1 3.5±0.5** 2.1±0.1 4.8±0.8** 7.0±0.2 10.7±0.5**

3.3 P糖蛋白（P-gp）的表達(dá)用濃度分別為5、10、40μg/mL的順鉑對(duì)耐順鉑人肝癌細(xì)胞HepG2作用24h后，隨著順鉑濃度的增加，P-gp的表達(dá)沒(méi)有發(fā)生明顯變化。加入濃度為12.5ng/mL雷公藤甲素后，與順鉑聯(lián)合用藥24h，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度檢測(cè)P-gp表達(dá)。結(jié)果表明，雷公藤聯(lián)合順鉑聯(lián)合用藥可以降低P-gp表達(dá)，并且隨著順鉑濃度的增加，P-gp表達(dá)逐漸減弱，兩組間細(xì)胞P-gp表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見(jiàn)表5～6。

表4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)方差分析表

表5 兩組HepG2細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)率比較（

表5 兩組HepG2細(xì)胞內(nèi)P-gp表達(dá)率比較（

注：與順鉑單用組比較，**P<0.01；DDP：順鉑；TP：雷公藤甲素；P-gp：多藥耐藥蛋白；P-gp：P糖蛋白

組別順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組順鉑單用組聯(lián)合用藥組P-gp表達(dá)（%）37.3±0.4 25.0±1.8** 34.2±0.5 18.6±0.7** 30.1±1.1 8.9±0.3** 34.2±2.3 1.8±0.1**孔數(shù)DDP濃度（μg/mL）3 3 3 3 3 3 3 3 0 0 5 5 1 0 10 40 40 TP濃度（ng/mL）0 12.5 0 12.5 0 12.5 0 12.5

表6 P-gp表達(dá)方差分析表

4 討論

肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝癌患者對(duì)于化療藥物的耐藥是導(dǎo)致治療失敗、影響肝癌治愈率和遠(yuǎn)期生存率的主要原因。順鉑是肝癌的基本化療藥，長(zhǎng)期大劑量應(yīng)用順鉑常造成嚴(yán)重的腎損傷，且肝癌細(xì)胞逐漸耐藥，失去對(duì)順鉑的敏感性[6]。

雷公藤甲素對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用，能明顯抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲，其與順鉑聯(lián)合用藥可以逆轉(zhuǎn)某些癌細(xì)胞的順鉑耐藥性，如膀胱癌[7]、卵巢癌[8]、胰癌[9]和胃癌[10]等，增強(qiáng)其治療效率。而順鉑和雷公藤甲素的抗癌機(jī)制不同，它們從不同方面影響腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡，由于兩藥都有毒副作用，故我們考慮是否能通過(guò)兩藥聯(lián)用，在減少劑量的同時(shí)不減弱療效，有效解決順鉑的耐藥現(xiàn)象?？紤]到當(dāng)藥物作用時(shí)間太長(zhǎng)或者藥物濃度太高時(shí)，細(xì)胞存活率普遍較低，無(wú)法體現(xiàn)藥物的作用效果，故在藥物聯(lián)合用藥中，選用順鉑的濃度為5、10、40μg/mL，雷公藤甲素濃度為12.5ng/mL。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，無(wú)論作用24h還是48h，聯(lián)合用藥對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用均比順鉑單藥用藥顯著增強(qiáng)，表明低劑量的雷公藤甲素可以加強(qiáng)順鉑對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒作用（P<0.01）。

腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的耐受是也是腫瘤多藥耐藥的重要機(jī)制之一。腫瘤細(xì)胞的抗藥性可阻止腫瘤細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致癌細(xì)胞的生存和治療失敗[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥能夠引起肝癌HepG2細(xì)胞的凋亡，呈現(xiàn)出明確的濃度依賴性，與順鉑單藥用藥比較，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果說(shuō)明，雷公藤甲素對(duì)HepG2細(xì)胞化療耐受的抑制作用可能是通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡實(shí)現(xiàn)的。

膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是介導(dǎo)各種腫瘤及細(xì)菌多藥耐藥的最經(jīng)典機(jī)制，也是目前研究較透徹的機(jī)制之一，其中P-gp外排泵的研究最為深入和廣泛。P-gp能夠轉(zhuǎn)運(yùn)諸如蒽環(huán)類、長(zhǎng)春堿類、紫杉烷類以及表鬼臼毒素類等多數(shù)抗腫瘤藥物，在多種人類腫瘤中引起了先天性與獲得性的多藥耐藥作用[13-15]。因此，下調(diào)P-gp的功能與表達(dá)可以對(duì)P-gp相關(guān)的腫瘤多藥耐藥作用產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)，進(jìn)而增加腫瘤對(duì)化療藥物的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，單用順鉑對(duì)P-gp的表達(dá)沒(méi)有明顯影響，而加入濃度為12.5ng/mL的雷公藤甲素與順鉑聯(lián)合用藥24h后，P-gp的表達(dá)隨著藥物濃度的增加明顯減弱，說(shuō)明雷公藤甲素可以逆轉(zhuǎn)順鉑的耐藥現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。P-gp低表達(dá)可能是雷公藤甲素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2逆轉(zhuǎn)順鉑耐藥的機(jī)制之一。

本研究證實(shí)低濃度雷公藤甲素聯(lián)合順鉑可明顯抑制肝癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)肝癌化療多藥耐藥，其作用機(jī)制與抑制P-gp的表達(dá)相關(guān)。提示雷公藤甲素可能提高順鉑肝癌治療療效，為雷公藤甲素成為新型抗腫瘤藥提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但中醫(yī)藥抗腫瘤是多靶點(diǎn)、多途徑的，是否還存其它靶點(diǎn)，有待今后進(jìn)一步研究。

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（收稿：2016-08-30修回：2016-11-20）

Effect of Low Concentration of Triptolide Combined with Cisplatin on the Activity of Liver Cancer HepG2 Cells

ZHAO Dongxiao1,CHEN Honglei2,MENG Guanmin2,LI Fangqiong2,WANG Wei2.
1 College of Medical Technology,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China;2 Department of Clinical Laboratory, Tongde Hospital of Zhejiang Province,Hangzhou(310012),China

ObjectiveTo investigate the synergistic effect of combination regimen of triptolide and cisplatin and to explore its chemo-resistance reversal mechanism in human liver cancer cell line HepG2.MethodsThe HepG2 cells were divided to two groups:cisplatin group（2.5,5,10,20,40μg/mL）and triptolide（12.5ng/mL）combined cisplatin group.The CCK-8 test was used to estimate the inhibition of cell proliferation.Flow cytometry was applied to analyze the cell apoptosis and the expression of P-glycoprotein.ResultsCompared with the single cisplatin treated group, triptolide combined with cisplatin depressed the proliferation of HepG2 cells significantly.Cell viability inhibitory rate of HepG2cells in cisplatin group were0,（4.0±1.0）%,（9.7±1.1）%,（29.4±2.4）%,（47.5±2.5）%,（62.9±1.2）%, and combination therapy increased the inhibition rate to（4.7±1.0）%,（37.1±3.1）%,（44.1±3.5）%,（57.9±3.0）%,（66.9±2.0）%,（74.9±2.0）%,with a significant difference among them（P<0.01）.Triptolide combined with different doses of cisplatin（0,5,10,40μg/mL）significantly induced cell apoptosis in HepG2.The rate of cell apoptosis was increased from（4.3±0.3）%,（8.4±0.3）%,（9.6±0.3）%,（32.3±2.0）%to（9.6±0.4）%,（16.2±0.2）%,（23.2±0.5）%,（53.0±3.6）%,respectively,with a significant difference among them（P<0.01）.After combined use of triptolide,theexpression of P-glycoprotein was decreased from（37.3±0.4）%,（34.2±0.5）%,（30.1±1.1）%,（34.2±2.3）%in cisplatin group to（25.0±1.8）%,（18.6±0.7）%,（8.9±0.3）%,（1.8±0.1）%,with a significant differenceamong groups（P<0.01）.ConclusionTriptolide combined with cisplatin could substantially suppress proliferation,induce apoptosis on HepG2 cellsand modulate cisplatin resistance of the human liver cancer cell line HepG2.The mechanism maybe related to the decrease of P-glycoprotein expression.

liver cancer cell;HepG2;triptolide;cisplatin;drug resistance;P-glycoprotein

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014F10014）

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院（杭州310053）；2浙江省立同德醫(yī)院檢驗(yàn)科（杭州310012）

王偉，Tel：13857101427；E-mail：wangweihz8@163.com