李光哲, 李玲美, 姚展鵬, 柳福丹

(1. 沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學 化學化工學院, 沈陽 110034)

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乙烯和水楊酸信號轉(zhuǎn)導在擬南芥對聚乙二醇脅迫應(yīng)答中的相互作用

李光哲1, 李玲美2, 姚展鵬1, 柳福丹1

(1. 沈陽師范大學 生命科學學院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學 化學化工學院, 沈陽 110034)

前期研究顯示,乙烯缺失或信號轉(zhuǎn)導阻斷促進植物對干旱脅迫的耐受性。發(fā)現(xiàn)擬南芥乙烯信號轉(zhuǎn)導阻斷突變體對聚乙二醇模擬的干旱脅迫耐受性與水楊酸信號轉(zhuǎn)導相關(guān)。在6%及以上濃度的聚乙二醇脅迫下,擬南芥乙烯不敏感突變體ein2-1植株表現(xiàn)出較野生型植株更強的耐受性,但乙烯和水楊酸信號轉(zhuǎn)導阻斷雙突變體ein2-1/npr1-1植株表現(xiàn)出較野生型植株更加敏感的特性。在聚乙二醇脅迫下,與野生型植株相比,ein2-1植株的相對含水量、光合作用相關(guān)參數(shù)、脯氨酸含量以及抗氧化酶活性更高,而過氧化氫含量和脂質(zhì)過氧化水平更低。然而,上述參數(shù)在ein2-1/npr1-1植株中的表現(xiàn)較野生型植株更差。這些數(shù)據(jù)表明,乙烯不敏感突變介導的聚乙二醇耐受性需要水楊酸信號轉(zhuǎn)導遞體NPR1的生物學作用。

水楊酸; 乙烯; 信號轉(zhuǎn)導; 擬南芥;聚乙二醇

0 引 言

干旱脅迫影響植物生長與發(fā)育的幾乎所有階段,是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要限制因子。在長期進化過程中,陸生植物在多方面發(fā)展了適應(yīng)干旱的機制,如在形態(tài)與結(jié)構(gòu)上的適應(yīng)性變化[1-2],生理和生化代謝方面的適應(yīng)性變化等[3-4]。在植物對干旱應(yīng)答過程中,乙烯和水楊酸起重要的調(diào)節(jié)作用[5]。例如,乙烯生物合成的抑制或信號轉(zhuǎn)導阻斷促進植物對干旱脅迫的耐受性[6]。相反,外施乙烯降低植物對干旱的耐受性[7]。因此,乙烯在植物對干旱脅迫應(yīng)答中起負調(diào)控作用,但對其作用機理仍有待闡明。研究表明,外源水楊酸促進植物對干旱脅迫的耐受性[8]。有研究表明乙烯信號轉(zhuǎn)導與水楊酸信號轉(zhuǎn)導在植物對生物或非生物逆境脅迫應(yīng)答中具有相互作用機制,如對病原體的應(yīng)答[9]和Al3+脅迫的應(yīng)答[10]。然而,在植物對干旱脅迫的應(yīng)答中有關(guān)二者相互作用還未見報道。本文以乙烯信號轉(zhuǎn)導不敏感突變體ein2-1、水楊酸信號轉(zhuǎn)導不敏感突變體npr1-1以及二者的雜交組合ein2-1/npr1-1雙突變體為材料,探討乙烯信號轉(zhuǎn)導與水楊酸信號轉(zhuǎn)導在擬南芥植株對聚乙二醇模擬的干旱脅迫應(yīng)答中可能的相互作用機理。結(jié)果顯示,乙烯不敏感突變介導的聚乙二醇耐受性需要水楊酸信號轉(zhuǎn)導遞體NPR1的生物學作用。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

擬南芥生態(tài)型哥倫比亞(Arabidopsisthalianaecotype Columbia)野生型及其突變體ein2-1、npr1-1和ein2-1/npr1-1種子分別由Dong教授(美國杜克大學)和Pieterse教授(荷蘭烏特勒支大學)提供。種子經(jīng)0.1%(w/v)次氯酸鈉表面消毒5 min,自來水沖洗后置于4 ℃冰箱中處理2 d。播種于自制的培養(yǎng)裝置中,培養(yǎng)基質(zhì)為1/2的Hoagland溶液(pH6.2)。培養(yǎng)條件為:光輻射量100 μmol m-2s-1,光周期為14 h光照、10 h黑暗,溫度為22 ℃(光下)/18 ℃(黑暗),相對含水量為70%。發(fā)芽20 d后移苗至分別含有終濃度為0、3、6和9%(w/v)聚乙二醇6 000的1/2強度Hoagland培養(yǎng)液中。除文中特別說明外,處理7 d后用于生理生化指標測定。與聚乙二醇脅迫處理同步進行土壤脫水處理,方法為土壤中生長20 d后停止?jié)菜L14 d,然后再復水生長5 d。

1.2 植物生長及相對含水量的測定

為了評價聚乙二醇對植株生長的影響,延長脅迫處理至14 d。將植株置于80 ℃的烘箱中干燥48 h,稱重得植株干重。植株相對干重表示為聚乙二醇處理的植株干重占各自未處理植株干重的百分比。相對含水量的測定:收集各處理的植株,用濾紙吸干表面水分,稱重得鮮重(FW),然后將植株浸入冰中預冷的水中靜置10 h,取出后用濾紙吸干表面的水分并稱重得水飽和重量(HW),再將植株置入80 ℃的烘箱中干燥48 h,稱重得干重(DW)。相對含水量(RWC)=(FW-DW)/(HW-DW)×100%。

1.3 生理生化指標測定

凈光合速率的測定采用便攜式光合測量儀(LI-6200, LI-COR, Lincoln, NE, USA),配用擬南芥專用葉室(LI-6400-17),測量過程中的環(huán)境溫度為25 ℃,光照度為150 μmolm-2s-1。葉綠素熒光參數(shù)的測定采用便攜式熒光測量儀(Handy-PEA, Hansatech, Norfolk, UK),具體操作方法與結(jié)果計算見文獻[11]。過氧化氫含量的測定方法見文獻描述[11]。丙二醛含量的測定見文獻描述[12]。

抗氧化酶的提取:收集新鮮葉片,在研缽中加液氮研磨成粉末,懸浮于5 ml冰浴中預冷的抽提液中。抽提液的組成為:50 mM磷酸緩沖液(pH 7.8),0.1 mM EDTA,1%(v/v) Triton X-100和4%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮。懸浮液于冰浴中靜置10 min,于4 ℃、12 000 g離心15 min,上清液即為粗酶提取液,用于測定超氧化物歧化酶[13]、過氧化物酶[14]和過氧化氫酶[15]活性。抗氧化酶同工酶凝膠電泳方法見文獻[16]。還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽以及脯氨酸含量的測定見文獻[11]。

本文中的數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗的平均值,表示為平均值±標準差。顯著性差異(P<0.05)分析采用one-way ANOVA,SAS軟件(SAS Institute, Cary, NC, USA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物生長與相對含水量

聚乙二醇以劑量-效應(yīng)關(guān)系抑制所有供試植株的生長,然而在6%及以上濃度下,ein2-1植株表現(xiàn)出比野生型植株更強的耐受性,而ein2-1/npr1-1植株比野生型更加敏感(圖1a)。雖然npr1-1植株也表現(xiàn)出比野生型對聚乙二醇脅迫更高的敏感性,但其敏感程度遠低于ein2-1/npr1-1植株(圖1a)。聚乙二醇處理引起供試植株葉片卷曲、某些成熟葉片萎蔫、脫綠、甚至死亡(圖1b)。在土培實驗中,脫水14天導致所有植株嚴重萎蔫,但接下來復水5 d后,ein2-1植株完全恢復到正常,野生型和npr1-1植株有大部分恢復,而ein2-1/npr1-1植株中只有一小部分恢復(圖1b)。聚乙二醇脅迫降低了所有供試植株的相對含水量(圖1c),且在基因型之間的變化趨勢與上述的植株生長變化趨勢完全一致,表明聚乙二醇引發(fā)的相對含水量降低是抑制植株生長的主要因素。這些數(shù)據(jù)顯示,乙烯信號轉(zhuǎn)導阻斷介導的植物對聚乙二醇耐受性機制依賴于水楊酸信號轉(zhuǎn)導遞體NPR1的生物學作用。

(a) 聚乙二醇脅迫14 d后的植株相對生物量;(b) 3%聚乙二醇處理14 d后植株表型(上)和土壤脫水處理14 d后復水處理5 d的植株表型(下);(c) 在供試濃度的聚乙二醇處理7 d后各種基因型植株的相對含水量。圖中每一個數(shù)據(jù)均為3次獨立實驗的平均值±標準差,n=3,不同的小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05),下同。

2.2 過氧化氫與丙二醛含量、抗氧化酶活性

隨著聚乙二醇濃度的加大,所有供試基因型植株的過氧化氫和丙二醛含量隨之增加(圖2)。然而,ein2-1突變體的增加幅度顯著低于野生型植株,而ein2-1/npr1-1植株則高于野生型,尤其是在6%及以上濃度的聚乙二醇脅迫下(圖2)。

在聚乙二醇脅迫下,野生型、npr1-1和ein2-1植株的超氧化物歧化酶和過氧化物酶增加,但ein2-1/npr1-1植株的上述2種酶活性則降低,這些酶活性的增加或降低均與聚乙二醇的供試濃度呈正相關(guān)(圖2)。隨著聚乙二醇濃度增加,野生型、ein2-1/npr1-1和npr1-1植株的過氧化氫酶活性逐漸降低,但ein2-1植株的過氧化氫酶活性在3%和6%聚乙二醇脅迫下增加,只有在9%的聚乙二醇脅迫下才低于對照(圖2e)。聚乙二醇引發(fā)的抗氧化酶活性的變化也反映在它們的同工酶表達水平上(圖2f)。在所有供試基因型中共檢測到4條超氧化物歧化酶同工酶帶,其中npr1-1植株含有帶Ⅱ～Ⅳ,不含帶Ⅰ,而其他3種基因型植株含有所有4條帶。帶強度的變化趨勢與上述通過分光光度計檢測的酶活性變化趨勢基本一致。在每一種供試基因型中均檢測到4條過氧化物酶同工酶帶,其中帶Ⅲ為主帶,其在同一種基因型或在不同基因型之間的變化趨勢與其分光光度計測得的變化趨勢基本一致。在本研究中,只檢測到1條過氧化氫酶同工酶帶,其強度的變化趨勢也與溶液測得的的酶活性大體上一致。聚乙二醇以依賴于供試濃度的方式降低所有基因型的還原型谷胱甘肽含量以及還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽的比值(圖3),同樣,這2個指標的變化趨勢與聚乙二醇脅迫下植物生長變化趨勢一致(圖1a)。

上述數(shù)據(jù)表明,ein2-1介導的聚乙二醇耐受性與其增加的抗氧化酶活性進而清除過量活性氧含量有關(guān)。已有研究顯示,擬南芥乙烯不敏感突變體ein2-1表現(xiàn)出較野生型植株對重金屬Cd脅迫更強的耐受性,且與降低的氧化脅迫傷害相關(guān)[17]。課題組前期的研究表明,該突變體明顯增強了對Al3+脅迫的耐受性,且與提高的抗氧化能力相關(guān)[10]。這些結(jié)果預示著在逆境脅迫條件下,乙烯信號轉(zhuǎn)導加強了植株的氧化脅迫傷害。在有關(guān)水楊酸的研究中,有報道表明,植株對干旱脅迫的耐受性與內(nèi)源水楊酸水平和/或信號轉(zhuǎn)導相關(guān)[11,18-19]。水楊酸介導植物對干旱脅迫耐受性的機理可能與氣孔關(guān)閉、提高的抗氧化能力或降低的氧化脅迫傷害等相關(guān)[11,19-21]。很明顯,本研究結(jié)果表明,作為水楊酸信號轉(zhuǎn)導途徑中唯一的正調(diào)節(jié)因子,NPR1-1在ein2-1介導的抗氧化防衛(wèi)應(yīng)答中起正調(diào)節(jié)作用。

(a) 葉片過氧化氫含量; (b) 葉片丙二醛含量; (c) 葉片超氧化物歧化酶活性; (d) 葉片過氧化物酶活性;(e) 葉片過氧化氫酶活性; (f) 3種抗氧化酶同工酶表達圖譜,其中蛋白質(zhì)加樣量為每泳道10 μg,加樣量對照以考馬斯亮藍G-250染色顯示。

聚乙二醇脅迫顯著促進所用供試植株的脯氨酸積累,尤其是在6%及以上脅迫濃度下(圖3c)。同樣,ein2-1植株的脯氨酸積累量是所有供試基因型中最高的,而雙突變體ein2-1/npr1-1則明顯低于野生型植株。已有許多研究表明,在干旱脅迫下,細胞中脯氨酸含量與相對含水量呈正相關(guān)。例如,在干旱脅迫下,棉花耐受性品種的相對含水量顯著高于其敏感性品種,同時,前者脯氨酸含量較后者高10倍以上[22]。相似的結(jié)果也在擬南芥野生型及其干旱耐受性轉(zhuǎn)基因系中發(fā)現(xiàn)[23]。本研究的數(shù)據(jù)進一步證明脯氨酸積累在植株對聚乙二醇應(yīng)答過程中起正調(diào)節(jié)作用。除了具有重要的滲透調(diào)節(jié)作用外,在細胞中脯氨酸也是一致重要的自由基清除劑和信號轉(zhuǎn)導分子,參與活性氧脫毒、保護細胞膜以及穩(wěn)定酶和蛋白質(zhì)的功能[24]。在植物對逆境脅迫的應(yīng)答中,脯氨酸的生物合成受水楊酸或乙烯的調(diào)控,或正調(diào)節(jié)或負調(diào)節(jié)[24-26]。本研究結(jié)果顯示,在聚乙二醇脅迫下,乙烯不敏感突變體ein2-1植株的脯氨酸高積累需要有NPR蛋白的存在,因為在npr1-1遺傳背景下,ein2-1介導的脯氨酸積累量被顯著逆轉(zhuǎn)。

隨著聚乙二醇脅迫濃度的增大,所有供試基因型植株的凈光合速率、最大光化學效率和實際光化學效率均逐漸降低(圖3d～圖3f)。相似地,與野生型植株相比,ein2-1植株受影響較小,而ein2-1/npr1-1植株降低幅度更大,npr1-1植株處于中間水平。在干旱脅迫下,光合速率是受影響最大的生物學過程之一,其中有氣孔因素和非氣孔因素[27]。非氣孔因素的影響主要包括光和器官受損、光反應(yīng)和暗反應(yīng)相關(guān)的酶活性失活等[28]。在脅迫條件下,葉綠素熒光參數(shù)如最大光化學效率和實際光化學效率是衡量光系統(tǒng)II受損傷程度的重要指標[29]。很明顯,本研究表明,ein2-1對聚乙二醇的耐受性與其維持較高水平的葉綠素熒光參數(shù)有關(guān),這同樣依賴于NPR1的生物學功能。

(a) 還原型谷胱甘肽含量; (b) 還原型與氧化型谷胱甘肽比值; (c) 脯氨酸含量;(d) 凈光合速率; (e) 最大光化學效率; (f) 實際光化學效率。

3 結(jié) 論

本研究揭示了乙烯信號轉(zhuǎn)導不敏感突變介導的擬南芥植株對聚乙二醇脅迫耐受性依賴于水楊酸信號轉(zhuǎn)導中間遞體NPR1的存在,具體反映在植株的生長、抗氧化防衛(wèi)應(yīng)答、脯氨酸積累以及光合作用相關(guān)過程等。進一步在分子水平上的研究將有助于闡明乙烯與水楊酸信號轉(zhuǎn)導相互作用機制。

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Interaction between ethylene-and salicylic acid-signaling in Arabidopsis response to polyethylene glycol stress

LI Guangzhe1, LI Lingmei2, YAO Zhanpeng1, LIU Fudan1

(1. College of Life Sciences, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. College of Chemistry and Chemical Engineering, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

Early researches have demonstrated that ethylene (ET) deficiency or signaling insensitivity improves plant tolerance to drought stress. Here, we report that ET-mediated plant response to polyethylene glycol (PEG)-simulated drought stress could be connected to salicylic acid (SA) signaling. Under exposure to 6% (w/v) and higher concentrations of PEG, Arabidopsisein2-1 plants (ET insensitivity) exhibited a significant tolerance, whereas theein2-1/npr1-1 plants (double mutant with both ET-and SA-signaling insensitivity ) suffered a severe damage, as compared with wild-type (WT) plants. Under the stress conditions,ein2-1 plants had a higher level in relative water content, photosynthesis-related performance, proline content, and antioxidative capacity, but a lower level in H2O2production and lipid peroxidation. However, these not only were reversed, but even worse inein2-1/npr1-1 plants than in WT plants. This suggested that the NPR1 functions were required forein2-1-mediated Arabidopsis tolerance to drought stress.

salicylic acid; ethylene; signaling; Arabidopsis; polyethylene glycol

1673-5862(2017)02-0214-06

2017-03-09。

國家自然科學基金資助項目(31570502)。

李光哲(1966-),男,吉林蛟河人,沈陽師范大學教授,博士。

Q89

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.02.018