趙進輝，李 耀，袁海超，劉木華

(江西農(nóng)業(yè)大學 工學院 生物光電及應用重點實驗室，江西 南昌 330045)

鴨肉中環(huán)丙沙星殘留的表面增強拉曼光譜測定

趙進輝，李 耀，袁海超，劉木華*

(江西農(nóng)業(yè)大學 工學院 生物光電及應用重點實驗室，江西 南昌 330045)

為實現(xiàn)鴨肉中環(huán)丙沙星(CIP)殘留的快速檢測，建立了一種鴨肉中CIP殘留的表面增強拉曼光譜(SERS)快速檢測方法。進行了增強基底的紫外-可見吸收光譜分析和鴨肉中CIP殘留檢測的SERS可行性分析。通過單因素實驗，確定了金膠加入量、含CIP的鴨肉提取液加入量、氯化鈉溶液加入量和吸附時間。在最佳實驗條件下，建立了鴨肉中CIP殘留的SERS檢測的標準工作曲線，決定系數(shù)(R2)為0.987 9，預測樣本中CIP的平均回收率為97.0% ～111.7%。實驗結(jié)果表明，鴨肉中CIP殘留的SERS快速檢測方法是可行的。

環(huán)丙沙星；表面增強拉曼光譜；鴨肉；檢測

環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)是一種第三代喹諾酮類廣譜抗生素，因具有較好的殺菌效果，在禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用。但由于對其的不合理使用，常造成禽肉中CIP殘留超標，可能會對人體產(chǎn)生一定的毒副作用(如胸悶、頭暈、腎臟損傷等)。目前用于CIP殘留的檢測方法主要有分光光度法、高效液相色譜法、電化學法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等[1-5]，但是這些方法不能滿足鴨肉中CIP殘留的快速檢測要求。因此，尋找一種鴨肉中CIP殘留的快速檢測方法是目前亟待解決的問題。

近年來，表面增強拉曼光譜(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)作為一種具有高靈敏性的快速檢測方法已用于獸藥殘留檢測[6]。馬海寬等[7-8]對魚肉中的磺胺甲基嘧啶與磺胺二甲基嘧啶進行了SERS檢測與分析。Zhao等分別對鴨肉中的螺旋霉素[9]和四環(huán)素[10]殘留進行了SERS檢測分析。Ji等[11]應用SERS技術(shù)檢測了豬肉、牛肉、雞等食品中的氯霉素殘留。Han等[12]對自來水、湖水和土壤等樣本中甲硝唑和羅硝唑進行了SERS檢測分析。但尚未見基于SERS技術(shù)的鴨肉中CIP的殘留檢測報道。本研究以金納米顆粒作為增強試劑，建立了一種鴨肉中CIP殘留的SERS快速檢測方法。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

實驗用麻鴨購于江西農(nóng)業(yè)大學菜市場；CIP標準品(純度約為99.0%)購于南昌精科科學儀器有限公司；氯金酸(HAuCl4·3H2O，M=393.83，其中金含量為≥49.0%，Sigma-Aldrich公司)；乙酸乙酯、檸檬酸三鈉(分析純，汕頭西隴化工股份有限公司)；氯化鈉、無水硫酸鈉為分析純(天津市永大化學試劑有限公司)；實驗用水為自制超純水。

1.2 儀器設備

QE65000便攜式拉曼光譜儀(海洋光學有限公司)；T10型實驗室超純水機(湖南科爾頓水務有限公司；DL-1電子萬用爐(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；JJ-2B型組織搗碎勻漿機(江蘇省金壇市金南儀器廠)；JK-50B 型超聲波清洗器(合肥金尼克機械有限公司)；FA1004B型電子天平(精度為0.1 mg，上海上平儀器有限公司)；HSC-24B型氮吹儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司)；VORTEX-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器有限公司)；JW-1024低速離心機(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器責任有限公司)；石英進樣瓶(北京成騰器材有限公司)；石英比色皿(1 cm光程)。

1.3 實驗方法

采用檸檬酸三鈉還原法制備金膠納米粒子[13]。將2 mL 1%的氯金酸加至500 mL燒杯中，用水定容至200 mL，用電子萬用爐將其加熱至沸騰，加1 mL 1%的檸檬酸三鈉。繼續(xù)加熱約8 min直至溶液顏色變紫紅色后，冷卻至室溫，4 ℃保存。

將5 g 搗碎的鴨肉和6.5 g無水硫酸鈉加至50 mL離心管中，然后加入15 mL乙酸乙酯并渦旋1 min，超聲振蕩10 min，離心(3 000 r/min) 5 min，取上清液。重復提取1次，合并2次提取液，將其用氮氣吹干后加入與氮吹前等量的水，再用快速濾紙過濾得到鴨肉提取液。稱取5 mg的CIP標準品溶于一定體積的鴨肉提取液中，超聲溶解定容后得到含100 mg/L CIP的鴨肉提取液加標樣本，然后用鴨肉提取液將其稀釋，得到含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標樣本。

將10 mg CIP標準品超聲溶解于100 mL水中，得到100 mg/L的CIP標準儲備液，然后將其用水稀釋得不同濃度的CIP標準品溶液。

稱取0.528 g的氯化鈉溶于100 mL水中，得到0.1 mol/L的氯化鈉溶液。

向2 mL的石英進樣瓶中依次加入金膠500 μL、含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標樣本15 μL和氯化鈉溶液120 μL，混合均勻后放入樣品池中進行SERS光譜采集。其中，拉曼光譜儀的參數(shù)設置為：光譜儀激光功率500 mW，激光波長785 nm，積分時間10 s，積分平均2次，并選擇波段為400～1 800 cm-1的SERS光譜進行研究。

通過單因素分析，優(yōu)化如下4個實驗條件：金膠加入量，含CIP的鴨肉提取液加入量，氯化鈉溶液加入量和吸附時間。于最佳實驗條件下，分別采集不同濃度的CIP標準品溶液和含不同濃度CIP的鴨肉提取液加標溶液的SERS光譜。上述所有樣本的光譜均采集3次，取3次測量的平均值進行數(shù)據(jù)分析。在鴨肉中CIP殘留的標準工作曲線建立與預測前，先用自適應迭代重加權(quán)懲罰最小二乘算法扣除熒光等背景信號。

2 結(jié)果與討論

2.1 增強基底的紫外-可見吸收光譜

將500 μL自制金膠加1 mL水稀釋，得到如圖1a所示的紫外-可見吸收光譜，從曲線a可知，本研究自制金膠的最大吸收峰約在542 nm處，半峰寬約為84 nm。將500 μL金膠、15 μL鴨肉提取液加標樣本與120 μL氯化鈉溶液混合，再加入1 mL超純水稀釋，采集得到的紫外-可見吸收光譜如圖1b所示，由圖可見，金膠和CIP分子吸附后，引起了金納米溶膠的粒徑發(fā)生變化，相比曲線a，其最大吸收峰發(fā)生8 nm紅移，峰形變得更寬。這可能是因為CIP分子吸附金膠粒子后，改變了金膠納米粒子表面的等離子共振而引起的[14]。

圖1 紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 UV-visible absorption spectra a.gold colloid；b.gold colloid + duck meat extract containing CIP(5 mg/L)+NaCl

圖2 不同溶液的SERS光譜Fig.2 SERS spectra of different solutions a.duck meat extract；b.ultrapure water；c.conventional Raman spectrum of duck meat extract containing CIP (5 mg/L)；d.CIP solution(5 mg/L)；e.duck meat extract containing CIP(5 mg/L)

2.2 鴨肉中CIP殘留檢測的SERS可行性分析

分別采集鴨肉提取液樣本、水、CIP標準品溶液和含CIP的鴨肉提取液樣本的SERS，以及含CIP的鴨肉提取液樣本的普通拉曼光譜，并將所得數(shù)據(jù)繪制成如圖2所示的曲線。由曲線b可知，水的SERS光譜基本未呈現(xiàn)明顯的峰強；對比CIP標準品溶液的SERS數(shù)據(jù)(曲線d)，可以看出CIP標準品溶液在位于1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1處均出現(xiàn)較明顯且突出的SERS峰，且1 262 cm-1處的SERS峰強度最大，可考慮將此處SERS峰作為檢測CIP的參考特征峰。比較光譜曲線d和e可知，在含CIP的鴨肉提取液樣本的SERS曲線中，1 142，1 195，1 262，1 331，1 390 cm-1處得到與曲線d類似的譜峰，而對比鴨肉提取液樣本的SERS數(shù)據(jù)，曲線a在這些位置未出現(xiàn)SERS峰，進一步驗證了以1 262 cm-1處所得拉曼峰作為檢測鴨肉中CIP的特征峰是可靠的?？疾熳灾平鹉z的增強效果，比較曲線c和e可以看出，未加基底所得含CIP的鴨肉提取液樣本的拉曼光譜基本為一條平滑曲線；在加入金膠和氯化鈉后測得的拉曼光譜曲線e上所得峰值明顯增多，且特征峰的峰強也有較大增強，說明了金膠基底對拉曼光譜的增強作用。

2.3 金膠加入量對SERS信號的影響

以金膠作為SERS光譜的增強基底，金膠的加入量直接影響鴨肉中CIP的SERS增強效果。本研究分別以不同加入量的金膠(200，300，500，700，900 μL)與15 μL鴨肉提取液加標樣本(5 mg/L)和120 μL氯化鈉溶液混合，采集這些樣本的SERS光譜數(shù)據(jù)，考察不同的金膠加入量對特征峰1 262 cm-1處SERS信號強度的影響。結(jié)果顯示，1 262 cm-1處SERS信號強度隨金膠加入量的增加呈先增強后減弱的趨勢，在金膠加入量為500 μL時SERS特征峰的峰強最強，獲得較佳的SERS信號強度。因此，確定金膠的加入量為500 μL。

2.4 含CIP的鴨肉提取液加入量對SERS信號的影響

含CIP的鴨肉提取液的加入量會影響鴨肉提取液中CIP 的SERS特征峰強度。本研究在500 μL金膠中，分別加入5，10，15，20，30 μL含CIP的鴨肉提取液(CIP濃度5 mg/L)和120 μL氯化鈉溶液，混合后采集SERS光譜。結(jié)果顯示，1 262 cm-1處SERS信號強度隨含CIP的鴨肉提取液加入量的增加呈先增強后減弱的趨勢，其加入量為15 μL時特征峰的峰強最大。此外，含CIP的鴨肉提取液加入量不同時，所得特征峰的峰強最大差值超過10 000 a.u.，很好地說明特征峰峰值受到含CIP的鴨肉提取液加入量的影響很大。因此確定實驗中含CIP的鴨肉提取液最佳加入量為15 μL。

2.5 氯化鈉溶液加入量對SERS信號的影響

氯化鈉的加入量會影響金膠納米粒子的凝聚程度，在SERS光譜中起活化和誘導作用，會對SERS信號的增強產(chǎn)生一定的影響。本實驗以500 μL自制金膠作為增強基底，選取15 μL含5 mg/L CIP 的鴨肉提取液加標樣本，再分別加入50，70，100，120，150 μL的氯化鈉溶液，采集其各自的SERS光譜。實驗結(jié)果顯示，氯化鈉溶液加入量為120 μL時，1 262 cm-1處特征峰的峰強達到最高。繼續(xù)增大氯化鈉溶液加入量時，過量的氯化鈉分子可能會引發(fā)金膠納米粒子的團聚，使得特征峰峰強降低。由此確定氯化鈉溶液的加入量為120 μL。

2.6 吸附時間對SERS信號的影響

吸附時間的長短直接影響到鴨肉提取液中CIP分子在金納米顆粒活性表面的數(shù)量，進而影響到鴨肉提取液中CIP的SERS特征峰強度[9-10]。本研究在金膠、待測液和氯化鈉最佳加入量條件下考察了吸附時間的影響。結(jié)果顯示，在1 min反應時間后，隨著時間的增長，1 262 cm-1處的拉曼峰強度逐步變小。表明在1 min時1 262 cm-1處的拉曼峰強度最強，由此說明鴨肉提取液中CIP分子在與金膠反應1 min時可達到較佳的活性熱點，此時的光譜增強效果較佳。在1 min后，金膠納米粒子與待測液的分子可能出現(xiàn)了聚沉現(xiàn)象，使得1 262 cm-1處拉曼峰強度降低。由此確定最佳吸附時間為1 min。

2.7 鴨肉中CIP檢測的SERS定量分析

采集CIP濃度在0.2～7.0 mg/L范圍內(nèi)的鴨肉提取液加標樣本的SERS信號，根據(jù)特征峰1 262 cm-1處測得的峰強，分析了鴨肉提取液中CIP濃度與1 262 cm-1處特征峰強度之間的關系，并以鴨肉提取液中CIP的濃度(x，mg/L)為橫坐標，特征峰處測得的SERS強度(y)為縱坐標繪制工作曲線，得回歸方程為y=2 589.3x-894.39，決定系數(shù)(R2)為0.987 9。表明鴨肉提取液中的CIP濃度在0.2～7.0 mg/L范圍內(nèi)與1 262 cm-1處峰強呈良好的線性關系。

為了考察SERS技術(shù)檢測鴨肉提取液中CIP殘留量的可靠性，利用所得標準工作曲線方程，對CIP濃度為1.5，3.0，4.0，4.5，6.0 mg/L的樣本進行預測。根據(jù)回收率實驗結(jié)果，得到預測樣本中CIP的平均回收率分別為99.1%，111.7%，97.0%，97.8%，98.6%，說明采用該方法檢測鴨肉中CIP殘留量準確有效，有利于實現(xiàn)鴨肉中CIP殘留的快速檢測。

3 結(jié) 論

本研究進行了增強基底的紫外-可見吸收光譜分析以及鴨肉中CIP殘留檢測的SERS可行性分析，為鴨肉中CIP殘留的SERS檢測提供了依據(jù)。通過單因素分析，確定了金膠加入量、含CIP的鴨肉提取液加入量、氯化鈉溶液加入量及最佳吸附時間。在最佳實驗條件下建立了鴨肉中CIP殘留的SERS檢測的標準工作曲線，得到R2為0.987 9，預測樣本中CIP的平均回收率為97.0%～111.7%。

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Detection of Ciprofloxacin Residues in Duck Meat Using Surface Enhanced Raman Spectroscopy

ZHAO Jin-hui，LI Yao，YUAN Hai-chao，LIU Mu-hua*

(Optics-Electrics Application of Biomaterials Lab，College of Engineering,Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China)

A rapid detection method of surface enhanced Raman spectroscopy(SERS) was established for the detection of ciprofloxacin (CIP) residues in duck meat.UV-visible absorption spectrum of SERS enhanced substrate and the feasibility of SERS detection of CIP residues in duck meat were analyzed.The addition amount of gold colloid， addition amount of duck meat extract containing CIP，addition amount of sodium chloride solution and the adsorption time were optimized by the single factor analysis.The calibration curve for the method was obtained in the optimum experiment condition.The determination coefficient was 0.987 9.The average recoveries of CIP in the prediction samples were between 97.0% and 111.7%.The experiment results indicated that the SERS method was feasible for the detection of CIP residues in duck meat.

ciprofloxacin(CIP)；surface enhanced Raman spectroscopy(SERS)；duck meat；detection

2016-12-11；

2017-01-15

國家自然科學基金項目(31660485)；江西省科技廳對外科技合作計劃項目(20132BDH80005)；江西省科技廳科技支撐項目(20121BBG70058)；江西省教育廳科技計劃項目(GJJ12244)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.023

O657.3；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0701-04

*通訊作者：劉木華，博士，教授，研究方向：光譜分析與檢測，Tel:0791-83813260，E-mail：suikelmh@sohu.com