李富強(qiáng) 王 偉 馮 濤 尹曉剛 鄧 倩 劉榮志

1)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽(yáng) 473000 2)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室 南陽(yáng) 473000

注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注線(xiàn)粒體ATP酶活性的影響

李富強(qiáng)1)王 偉2)馮 濤1)尹曉剛1)鄧 倩1)劉榮志2)

1)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽(yáng) 473000 2)南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室 南陽(yáng) 473000

目的 探討注射用丹參多酚酸對(duì)大鼠腦缺血再灌注線(xiàn)粒體ATP酶活性的影響。方法 將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=18)：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)、丹參多酚酸組(Salvianolate 組)。HE染色法觀察大腦神經(jīng)元的組織病理學(xué)變化；TTC染色檢測(cè)腦梗死體積；分光光度計(jì)發(fā)法線(xiàn)粒體丙二醛含量和線(xiàn)粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織紅染，未見(jiàn)梗死灶；丹參多酚酸組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死程度、腦梗死面積較缺血再灌注組明顯減輕；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組線(xiàn)粒體丙二醛含量下降(P<0.05)和線(xiàn)粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高(P<0.05)。結(jié)論 注射用丹參多酚酸對(duì)缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機(jī)制與提高線(xiàn)粒體ATP酶活性有關(guān)。

缺血再灌注；丹參多酚酸；線(xiàn)粒體；ATP酶

能量衰竭在缺血性腦血管病發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。線(xiàn)粒體是細(xì)胞能量合成中心，線(xiàn)粒體ATP酶調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體內(nèi)Na+、Ca2+、Mg2+離子濃度，維持線(xiàn)粒體功能[1]。線(xiàn)粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，引起細(xì)胞凋亡或壞死，因此保護(hù)線(xiàn)粒體功能是缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)。注射用丹參多酚酸(salvianolate)是從中藥丹參中提取的水溶成分，其主要成分是丹酚酸B，可以通過(guò)減少血黏度和機(jī)體炎癥反應(yīng)，提高腦梗死患者神經(jīng)功能[2]。本研究通過(guò)大鼠缺血再灌注模型探討注射用丹參多酚酸的腦保護(hù)作用是否與線(xiàn)粒體ATP酶相關(guān)，為明確保護(hù)機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型制備：健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，由鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將54只雄性SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=18)：假手術(shù)組、注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組。模型制備：采用改良Zea Longa法制備大鼠右側(cè)中動(dòng)脈缺血再灌注模型。假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程中，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動(dòng)脈但不插入線(xiàn)栓。注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組線(xiàn)栓待缺血2 h后，緩慢抽出線(xiàn)栓再灌注24 h。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)右側(cè)Horner征、眼裂變小、瞳孔縮小和左側(cè)軀體運(yùn)動(dòng)障礙評(píng)定為模型成功。丹參多酚酸組于缺血2 h再灌注24 h后連續(xù)7 d給予10 mg/kg尾靜脈注射，1次/d。假手術(shù)組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。末次給藥6 h后功能評(píng)分后取腦。

1．1．2 主要試劑與儀器：注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20110011)，顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠(chǎng))；氯化三苯基四氮唑(TTC，批號(hào)：030227，北京化學(xué)試劑公司)；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)，Kendro Labrotary)；石蠟切片機(jī)、倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；丙二醛試劑盒及ATP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 腦梗死體積測(cè)定：大鼠腦組織應(yīng)用冰箱—20 ℃冷凍20 min后取出，沿視交叉向前冠狀位平行依次切片2 mm×5片。將切好的腦片放置在2% TTC磷酸緩沖液中，恒溫箱37 ℃避光孵育30 min后，4%多聚甲醛固定。數(shù)碼相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)，應(yīng)用圖像分析軟件計(jì)算腦梗死體積百分比。梗死體積百分比=(左側(cè)正常腦組織體積-右側(cè)正常腦組織的體積)/左側(cè)正常腦組織體積×100%，以此作統(tǒng)計(jì)分析。

1．2．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物取材及HE染色標(biāo)本的制備：4%多聚甲醛(4 ℃)將大鼠灌流固定斷頭取腦后，將腦組織浸入4%多聚甲醛(4 ℃預(yù)冷)中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋。將包埋好的腦組織在恒溫切片機(jī)上沿冠狀面連續(xù)切片，片厚約5 μm，展片、撈片后置于載玻片上放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0 ℃烤箱中烘烤30 min常規(guī)脫蠟，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至純水，Harris蘇木素染色15 min，自來(lái)水沖洗；1%鹽酸乙醇分化3～5 s，自來(lái)水沖洗返藍(lán)；伊紅染色1 min，自來(lái)水沖洗。脫水、透明、中性樹(shù)膠封片。

1．2．3 腦組織線(xiàn)粒體的提取：麻醉后迅速處死動(dòng)物取腦，去除腦膜、小腦、嗅球、腦干后，留取右側(cè)大腦半球，冰鹽水沖去血液，應(yīng)用緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.25 mol/L Sucrose，0.01 mol/L EGTA)制成10%勻漿。低溫高速離心機(jī)(溫度4 ℃)以650 g離心力離心20 min后，取上清液再以 7 700 g離心力離心20 min后，取沉淀物加入線(xiàn)粒體保存液充分震蕩，反復(fù)吹打，得到線(xiàn)粒體懸浮液。上述操作均4 ℃下進(jìn)行[3]。Lowry法檢測(cè)蛋白濃度。

1．2．4 線(xiàn)粒體丙二醛及ATP酶測(cè)定：丙二醛監(jiān)測(cè)采用硫代巴比妥酸(TBA)方法。丙二醛(結(jié)構(gòu)OHC-CH2-CHO)與硫代巴比妥酸反應(yīng)后產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。ATP酶即三磷酸腺苷酶，ATP酶分解ATP為ADP和無(wú)機(jī)磷，無(wú)機(jī)磷在660 nm處有最大吸收峰。具體檢測(cè)步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

2 結(jié)果

2．1 腦梗死體積 假手術(shù)組雙側(cè)腦組織均勻紅染，未發(fā)現(xiàn)梗死灶；IR組和丹參多酚酸組可見(jiàn)右側(cè)大腦半球不同范圍的蒼白色梗死灶。丹參多酚酸組腦梗死體積顯著小于IR組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 3組腦梗死體積測(cè)定、丙二醛及Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶比較 (±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組比較，*P<0.05

2．2 光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組神經(jīng)元胞質(zhì)呈深紅色，胞核呈藍(lán)色。細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清楚，核大而圓，核膜、核仁清晰可見(jiàn)。缺血再灌注組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，呈缺血性改變的錐體細(xì)胞，胞體腫脹變形成多角形、核固縮；丹參多酚酸組干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變程度均較缺血再灌注組輕，間質(zhì)水腫明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰，可見(jiàn)少量神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常、核固縮或消失(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化(HE染色 ×200)A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：丹參多酚酸處理組

2．3 丙二醛測(cè)定 丹參多酚酸治療組顯著抑制缺血再灌注后線(xiàn)粒體膜損傷。與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸治療組丙二醛含量(0.901±0.472)顯著減少(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組丙二醛含量(1.501±0.149)顯著增多(P<0.05)。

2．4 線(xiàn)粒體ATP酶的影響 缺血再灌注組Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶與假手術(shù)組相比明顯下降(P<0.05)；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組能提高線(xiàn)粒體ATP酶活性(P<0.05)。見(jiàn)表1。

3 討論

大腦是高耗能器官，線(xiàn)粒體通過(guò)三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞合成能量——ATP。能量衰竭是腦缺血神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素，若線(xiàn)粒體損傷持續(xù)不能緩解，能量合成障礙導(dǎo)致線(xiàn)粒體穩(wěn)態(tài)改變，引起細(xì)胞死亡。缺血缺氧發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，尤其是再灌注時(shí)大量活性氧產(chǎn)生，損害線(xiàn)粒體細(xì)胞膜，線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)性破壞加重線(xiàn)粒體損傷，導(dǎo)致ATP合成減少、ATP降解增加[4]。線(xiàn)粒體能量障礙引起存在于線(xiàn)粒體膜上依靠ATP能量的Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低；Na+/K+ATP酶不能維持線(xiàn)粒體內(nèi)K+梯度優(yōu)勢(shì)，引起Na+內(nèi)流，Na+過(guò)度引起Na+/Ca2+交換，Ca2+進(jìn)入線(xiàn)粒體，引起鈣超載；Ca2+ATP酶和Mg2+ATP酶依靠ATP能量將Ca2+泵出維持線(xiàn)粒體鈣平衡；線(xiàn)粒體損傷時(shí)線(xiàn)粒體膜破壞，ATP衰竭，Ca2+不能泵出，引起線(xiàn)粒體鈣超載[4]。線(xiàn)粒體鈣超載影響三羧酸循環(huán)中依賴(lài)Ca2+調(diào)節(jié)的蛋白酶導(dǎo)致ATP合成受阻，而且激活依賴(lài)鈣離子降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞災(zāi)難性損傷[5]。本研究表明，缺血再灌注后線(xiàn)粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低、丙二醛含量升高，受損神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，核固縮，神經(jīng)元細(xì)胞減少。

注射用丹參多酚酸是采用柱層析技術(shù)提取的丹參水溶成分，其主要有效成分是丹酚酸B。實(shí)驗(yàn)研究表明，丹參多酚酸通過(guò)上調(diào)高爾基磷酸化蛋白-3表達(dá)，激活A(yù)kt和mTOR磷酸化途徑減少TUNEL細(xì)胞起到腦保護(hù)作用[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸治療改善進(jìn)展性能改善神經(jīng)功能評(píng)分，提高肢體功能恢復(fù)[7]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組線(xiàn)粒體丙二醛含量升高，線(xiàn)粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低，提示線(xiàn)粒體功能障礙；HE切片上可以看到神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，核固縮，神經(jīng)元細(xì)胞減少，TTC染色可見(jiàn)腦梗死體積明顯增加。丹參多酚酸組丙二醛含量減少，Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高，與缺血再灌組相比，腦梗死體積明顯較少，HE接片神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰。

綜上所述，注射用丹參多酚酸可能通過(guò)提高線(xiàn)粒體ATP酶活性，保護(hù)線(xiàn)粒體而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

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(收稿2017-01-12)

Effect of salvianolate injection on ATPase activity of mitochondria in rats with cerebral ischemia reperfusion

LiFuqiang*，WangWei，F(xiàn)engTao，YinXiaogang，DengQian，LiuRongzhi

*DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege，Nanyang473000，China

Objective To explore the effect of salvianolate injection on ATPase activity of mitochondria in rats with cerebral ischemia reperfusion．Methods Totally 54 male Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into three groups：sham-operation group，ischemia-reperfusion(I/R)group and salvianolate group，eighteen rats in each group．Histopathological changes of cerebral neurons were observed by HE staining，volume of cerebral infarction were measured by staining with triphenyltetrazolium chloride(TTC)and activities of Na+/K+ATPase，Ca2+ATPase and Mg2+ATPase of mitochondria were measured by spectrophotometer．Results The sham group showed red cerebral tissues，which indicated no infarction．Compared with those in ischemia-reperfusion group，degeneration degree of neurons and volume of cerebral infarction were significantly reduced，malondialdehyde(MDA)content was decreased and the activities of Na+/K+ATPase，Ca2+ATPase and Mg2+ATPase of mitochondria in salvianolate group were increased(allP<0.05)．Conclusion Salvianolate has a neuroprotective effect on focal cerebral ischemia reperfusion in rats，whose mechanism may be associated with increased ATPase activity of mitochondria．

Ischemia reperfusion；Salvianolate；Mitochondria；ATPase

R-332

A

1673-5110(2017)09-0023-04