韋豪華，張紅玲，李興太

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

芪參補(bǔ)氣藥茶保護(hù)線粒體及其機(jī)制

韋豪華，張紅玲，李興太

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

以黃芪和黨參為原料組方制成芪參補(bǔ)氣藥茶(ACT)，探索ACT對線粒體的保護(hù)作用及其機(jī)制。分別用AlCl3比色法和硫酸苯酚法測定ACT的功能因子總黃酮、總糖及總多糖含量。用Ca2+誘導(dǎo)肝線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)，分光光度法測MPT程度；以Fe2+/維生素C誘發(fā)肝線粒體脂質(zhì)過氧化，采用硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛(MDA)含量；測定ACT對Fe2+螯合能力及還原力的影響。實(shí)驗(yàn)測得ACT總糖含量為(26 ± 1.3)mg·mL-1，總多糖含量為(12.5 ± 0.8)mg·mL-1，總黃酮含量為(121 ± 8.5)μg·mL-1。結(jié)果表明：ACT可抑制Ca2+引起的MPT，可一定程度上抑制線粒體MDA生成，具有較弱的Fe2+螯合能力及一定的還原力。能通過溫和的抗氧化和清除活性氧作用，一定的還原力及抑制MPT來保護(hù)線粒體，從而維持機(jī)體氧化與抗氧化平衡，促進(jìn)機(jī)體健康。

芪參補(bǔ)氣藥茶；黃芪；黨參；線粒體通透性轉(zhuǎn)換；活性氧

近期研究表明，線粒體作為生命活動的樞紐與核心，其最重要功能是通過氧化磷酸化(OXPHOS)提供能量——ATP(85%以上)，其每秒每單位質(zhì)量轉(zhuǎn)換的能量比太陽多10 000倍以上[1]。線粒體又是自由基損傷最敏感的靶部位，也是細(xì)胞內(nèi)自由基的主要來源。線粒體電子傳遞鏈上產(chǎn)生的活性氧(ROS)與衰老有著密切的關(guān)系[2]，ROS引起的核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化是決定健康與壽命的關(guān)鍵因素[3]。中國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，氣主宰整個生命活動，氣與健康的關(guān)系極為密切。中國的中老年人中一半以上表現(xiàn)為氣虛，氣虛又是多種病變的常見病因，氣虛導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著下降，進(jìn)而引發(fā)線粒體的能量代謝障礙，LI Xing Tai提出并用實(shí)驗(yàn)證明了通過改善線粒體能量代謝可以實(shí)現(xiàn)補(bǔ)氣的作用[4]。中藥治療疾病在于以氣調(diào)氣，藥茶蘊(yùn)含著豐富的養(yǎng)生奧秘，藥茶和養(yǎng)生的緊密結(jié)合詮釋了“傳統(tǒng)、自然、簡約、有效”的藥茶養(yǎng)生保健理念。

黃芪和黨參是補(bǔ)氣藥的代表，黃芪有“補(bǔ)藥之長”之稱，黨參能補(bǔ)中益氣，用于神疲、力乏等癥。已有前期實(shí)驗(yàn)證明，黃芪、黨參都能夠明顯增加大鼠肝細(xì)胞的ATP含量[5]；黃芪多糖通過清除活性氧(ROS)、抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)來保護(hù)線粒體，使其不受損傷，同時也能夠提高細(xì)胞的生物能學(xué)，使線粒體的功能得到改善[6-7]，黃芪的補(bǔ)氣效果最好，一般常和黨參一同服用，兩藥結(jié)合補(bǔ)氣效果更加明顯，制成的“芪參補(bǔ)氣藥茶”能在一定程度上清除3種主要線粒體ROS(超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基)[8]，從而推測其可能具有保護(hù)線粒體的作用。本實(shí)驗(yàn)從線粒體的視角研究芪參補(bǔ)氣藥茶的相關(guān)作用機(jī)理，為日后進(jìn)一步對黃芪、黨參的藥用及保健功能的開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD大鼠由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供(合格證號：2007 6A007)。黃芪采自黑龍江大興安嶺林區(qū)，黨參購自大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)保健大藥房。

硫代巴比妥酸(TBA)、1,1,3,3-四乙氧基丙烷(TEP)(美國Sigma公司)；釕紅(RR)、Ferrozine(英國Alfa Aesar公司)；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清白蛋白(荷蘭Boehringer Mannheim 公司)；三羥甲基氨基甲烷(Tris)(美國Gibco公司)；N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)(德國Merck公司)；4-嗎啉丙烷磺酸(MOPS)(北京索萊寶科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外-可見分光光度計(日本島津公司)；Polystat 34恒溫水浴鍋(美國Techne公司)；Beckman Coulter Avanti J-E高速低溫離心機(jī)(Beckman JA-25.50 轉(zhuǎn)子，美國Beckman公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精密實(shí)業(yè)有限公司)；DY89-1型電動玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝科器研究所)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 芪參補(bǔ)氣藥茶(ACT)的制備

分別稱取干燥的黃芪粉末和黨參飲片各25.0 g，再加入500 mL去離子水浸泡60 min。具體制備方法詳見參考文獻(xiàn)[8]。

1.3.2 ACT總黃酮、總糖和總多糖含量的測定

以蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用AlCl3比色法測定ACT的總黃酮含量[9]；利用Sevage試劑[氯仿:正丁醇(4:1)]除去ACT中的蛋白，經(jīng)濃縮后加入無水乙醇使其體積分?jǐn)?shù)為80%，通過離心處理后所得到的沉淀依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚分別洗滌，最后得到的沉淀即為ACT的總多糖，經(jīng)真空干燥處理后，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，ACT的總糖和總多糖含量采用硫酸苯酚法來測定[10]。

1.3.3 鼠肝線粒體的制備

用差速離心法分離大鼠肝線粒體[11]，具體制備方法詳見參考文獻(xiàn)[12]。然后用牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，利用Bradford法來測定線粒體的蛋白含量[13]。

1.3.4 線粒體通透性轉(zhuǎn)換(MPT)的測定

在線粒體溫育介質(zhì)(1 mmol·L-1Pi-Tris、250 mmol·L-1蔗糖、5 mmol·L-1谷氨酸-Tris、10 mmol·L-1Tris-MOPS、2.5 mmol·L-1蘋果酸-Tris，25 ℃、pH 7.4)中加入150 μmol·L-1的Ca2+，然后再加入ACT(模型組不加)或釕紅(0.5 μmol·L-1，模型組不加)，接著加入0.5 mg線粒體啟動實(shí)驗(yàn)，得到最終體積為2 mL。在0、2、5、10、20、30 min通過監(jiān)測線粒體懸液在波長為540 nm處吸光度的下降程度來測定MPT[14-15]。

1.3.5 MDA含量的測定

采用TBA顯色法測定MDA的含量[16]。反應(yīng)體系含有0.25 mmol·L-1FeSO4和0.6 mmol·L-1的維生素C(VC)(正常組不加FeSO4和VC)，以及不同濃度的ACT(模型組不加)和0.5 mg的線粒體蛋白，再用pH 7.4、0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(PBS)補(bǔ)充體積到2 mL(空白參照管不加ACT和線粒體)，經(jīng)37 ℃水浴60 min，取出后再加入20%三氯乙酸(TCA)0.5 mL終止反應(yīng)，接著分別倒入離心管后以5 000×g離心10 min，最后取上清液2 mL，再加入 0.67%的硫代巴比妥酸(TBA)1 mL，100 ℃煮沸10 min，用空白參照管調(diào)零, 在波長為532 nm處測定其吸光度A，以TEP(1,1,3,3-四乙氧基丙烷)作為外標(biāo)，經(jīng)線性回歸分析后計算MDA的含量。ACT的作用以MDA的抑制率(IR)按式(1)表示。

IR/%=(MDA含量模型-MDA含量ACT)/(MDA含量模型-MDA含量正常)×100。

(1)

1.3.6 亞鐵離子螯合能力的計算

試管中依次加入不同濃度的EDTA溶液(0.6 mg·mL-1)或ACT溶液、0.1 mL 2.25 mmol·L-1Ferrozine、0.1 mL 0.375 mmol·L-1FeSO4溶液，然后用Hepes緩沖液補(bǔ)充體積到3 mL，經(jīng)旋渦混合器混勻后，室溫放置20 min，在波長562 nm處測定其吸光度A，以EDTA作為陽性對照，結(jié)果用螯合率來表示[17]，按式(2)計算。 螯合率/%=[(A對照-AACT或EDTA)/A對照]×100。

(2)

1.3.7 總還原力的計算

試管中加入不同濃度的ACT溶液、0.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液和0.5 mL 0.2mol·L-1PBS(pH 6.6)，用超純水將體積補(bǔ)足至1.5 mL，在經(jīng)過50 ℃水浴20 min，冷卻后再加1.0 mL 10% TCA溶液，在轉(zhuǎn)速為3 000 r·min-1的條件下離心10 min，取上清1.5 mL，加入0.1% 的FeCl3溶液0.1 mL，再加0.4 mL超純水補(bǔ)足體積至2 mL，混勻后靜置10 min，最后在波長700 nm處測定其吸光度A，吸光度越大即還原力越強(qiáng)[18]。以2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)為陽性對照。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 ACT的總黃酮、總糖與總多糖的含量

多糖為黨參的主要功能因子，研究表明，黨參多糖含量的高低可作為黨參的質(zhì)量評價指標(biāo)。黃芪主要含多糖、黃酮和皂苷等活性成分，具有清除活性氧、抗氧化、抗衰老等活性，多糖和黃酮為其主要功能因子。黃芪和黨參都含較多的糖類物質(zhì)，是人類營養(yǎng)所需，均可能參與機(jī)體的能量代謝。因此，本實(shí)驗(yàn)測定了ACT的總黃酮、總糖及總多糖含量作為制定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的依據(jù)。取ACT 200 μL，測定得到ACT總黃酮含量、總糖含量與總多糖含量分別為(121±8.5)μg·mL-1、(26±1.3)mg·mL-1和(12.5±0.8)mg·mL-1。

2.2 ACT對鼠肝MPT的影響

線粒體是細(xì)胞內(nèi)具有雙層膜結(jié)構(gòu)的重要細(xì)胞器，其外膜的通透性良好。線粒體內(nèi)膜的非特異的通透性變大即為MPT。許多研究表明，線粒體上存在一種位于線粒體內(nèi)外膜間的由多種蛋白質(zhì)組成的非選擇性的復(fù)合孔道，即線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔 (MPTP)。MPTP作為線粒體內(nèi)外信息交流的中心樞紐，其開放的狀態(tài)決定了線粒體功能的發(fā)揮。MPTP被打開之后，線粒體內(nèi)膜的通透性非特異性增大，這時，線粒體就會發(fā)生MPT。線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔長時間打開，會導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡或壞死[19]。此外，MTPT對細(xì)胞內(nèi)各種離子濃度的變化十分敏感,尤其對在細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)有重要作用的Ca2+濃度的變化極其敏感， MPTP大量開啟會導(dǎo)致膜電位的崩解及細(xì)胞的凋亡。MPT能夠誘導(dǎo)破壞內(nèi)膜的通透性屏障，從而破壞膜電位和pH梯度[20]。有實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng) Ca2+濃度為150 μmol·L-1時，就會引起可檢測的MPT，Ca2+積累之后再加入釕紅(RR)，便可以阻止Ca2+再分布[21]。本實(shí)驗(yàn)中，Ca2+誘導(dǎo)明顯的MPT，其效應(yīng)幾乎被0.5 μmol·L-1釕紅完全抑制，低劑量(3mg·mL-1)ACT早期抑制MPT不顯著，但隨時間的增加作用變得明顯，高劑量(6 mg·mL-1)時抑制效應(yīng)增強(qiáng)，見表1。

表1 ACT對肝線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響±s，n=6)

注：與模型組比較,“*”表示有顯著差異(P< 0.05)，“**”表示有較顯著差異(P< 0.01),下表同。

脂質(zhì)過氧化(Lipid Peroxidation，LPO)會導(dǎo)致膜通透性增加，進(jìn)而引起MPT。發(fā)生LPO時，線粒體膜的受損會導(dǎo)致Ca2+的通透性增加進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。ACT抑制MPT作用與其抑制脂質(zhì)過氧化及清除ROS作用密切相關(guān)，說明其抑制MPT可能是通過清除ROS及抗氧化作用，從而保護(hù)線粒體。

2.3 ACT對鼠肝線粒體MDA的影響

脂質(zhì)在Fe2+作用下可以氧化分解產(chǎn)生MDA。用Fe2+/VC處理之后，肝線粒體中的MDA(LPO的終產(chǎn)物)顯著增多，見表2。

表2 ACT對鼠肝線粒體MDA生成的影響

MDA可被ACT以濃度依賴性的方式抑制，雖然其作用不是很強(qiáng)，但還具有一定的抗氧化活性。研究表明，LPO已被認(rèn)為是線粒體膜功能降低的重要原因之一。LPO可破壞膜結(jié)構(gòu)導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞損害。線粒體發(fā)生LPO或生成超氧化物是脂肪酸誘導(dǎo)線粒體功能障礙、ATP耗竭及細(xì)胞死亡的觸發(fā)因素[23]。LPO可通過對線粒體膜、膜蛋白及線粒體DNA的作用最終導(dǎo)致線粒體損傷。因此，ACT有可能通過與內(nèi)源性抗氧化劑共同(如協(xié)同)作用，以維持或重新建立氧化還原平衡，具有一定的抗衰老作用。

2.4 ACT對Fe2+螯合能力的影響

Fenton反應(yīng)是指Fe2+和H2O2反應(yīng)生成羥自由基的反應(yīng)。具有螯合Fe2+活性的藥物可以有效降低導(dǎo)致LPO的過渡金屬催化劑的濃度、阻止ROS的產(chǎn)生和由此所引起的氧化損傷。因此，F(xiàn)e2+的螯合能力與抗氧化有十分密切的關(guān)系，見表3。

表3 ACT 對Fe2+螯合能力的影響

在Fe2+螯合測定體系中，ACT在較低質(zhì)量濃度時，作用并不是很顯著，但隨其質(zhì)量濃度的逐漸升高，對Fe2+的螯合能力也隨之增強(qiáng)，當(dāng)其質(zhì)量濃度為8.0 g·L-1時，螯合率可達(dá)19.94%。但與EDTA相比，可以發(fā)現(xiàn)其螯合Fe2+的能力較低。

2.5 ACT對還原力的影響

研究表明，物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，其抗氧化性就越強(qiáng)。物質(zhì)抗氧化活性的一個重要表現(xiàn)是其還原力的大小，在氧化還原反應(yīng)中，物質(zhì)提供電子而自身發(fā)生氧化的能力即為還原力。還原力大的物質(zhì)可以很好的提供電子，提供的電子不僅可以讓Fe3+還原為Fe2+，還能夠與自由基發(fā)生反應(yīng)，最終使自由基成為更加穩(wěn)定的物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)通過還原Fe3+來測定ACT的還原力，由表4可知，A700nm隨著還原力的增加而增加，ACT的還原力隨濃度的增加而增強(qiáng)，但遠(yuǎn)沒有BHT強(qiáng)。

表4 ACT 對還原力的影響

注：組間相同字母表示無顯著性差異(P≥0.05)；組間不同字母表示有顯著性差異(P<0.05)。

3 討 論

線粒體是機(jī)體進(jìn)行各項(xiàng)生命活動關(guān)鍵細(xì)胞器，為機(jī)體提供大部分的能量，保證機(jī)體的生命活力。細(xì)胞中的ROS主要源于線粒體，所有需氧生物在代謝過程中都會產(chǎn)生ROS。ROS對氧化應(yīng)激、基因表達(dá)以及細(xì)胞凋亡等重要細(xì)胞過程的調(diào)控具有重要的作用。細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，或可以說體內(nèi)氧化與還原處于平衡時，生命才能維持健康。ROS被認(rèn)為是多種病理的影響因素。然而，近幾十年的研究表明了ROS在眾多正常生理調(diào)節(jié)過程中的關(guān)鍵作用。事實(shí)上，持續(xù)暴露于高濃度的ROS中可引起蛋白質(zhì)，膜脂質(zhì)和核酸殘基的氧化損傷，但低至中等的ROS水平可調(diào)節(jié)生長、凋亡和其他細(xì)胞信號通路[24]。線粒體作為細(xì)胞活動的控制中心，不僅是細(xì)胞呼吸鏈和OXPHOS的中心，也是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心。線粒體作為一種必要的調(diào)節(jié)器調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物能學(xué)，它所產(chǎn)生的ROS不但驅(qū)動氧化還原的敏感事件，而且還應(yīng)答ROS介導(dǎo)的細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的變化[25]。線粒體實(shí)現(xiàn)其生理功能主要是通過調(diào)整ROS的生成以及能量代謝[26]。由此可見，保護(hù)好線粒體對健康而言非常重要。

為避免化學(xué)溶劑的帶入，本實(shí)驗(yàn)用水作為溶劑來提取藥茶的總活性成份，綜合利用了其中的各種營養(yǎng)物質(zhì)，既符合傳統(tǒng)的飲茶和用藥習(xí)慣，又符合傳統(tǒng)藥茶養(yǎng)生的保健理念。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪參補(bǔ)氣藥茶能一定程度抑制鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化，對3種主要ROS的清除作用亦不是很強(qiáng)，對Fe2+螯合能力也較弱，但具一定還原力，這就說明其抗氧化的作用比較溫和，這可能對維持機(jī)體氧化還原的平衡有一定作用。ROS與Ca2+均可以誘發(fā)MPTP的開放，MPTP的開放不僅會使ROS濃度大幅升高，而且也會使線粒體膜通透性增大，從而導(dǎo)致Ca2+的釋放；胞漿內(nèi)Ca2+濃度的大量升高會作為第二信使，啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，導(dǎo)致ROS的濃度升高。ROS水平升高會誘發(fā)線粒體的膜電位降低及細(xì)胞凋亡。對于研究者而言，日后所關(guān)注的重點(diǎn)是怎樣控制線粒體內(nèi) ROS的生成、改善線粒體的生物能學(xué)以及防護(hù)線粒體的氧化損傷[27]。ACT能夠抑制MPT的發(fā)生，進(jìn)而抑制了細(xì)胞的凋亡，這就充分說明其對健康具有一定的益處。ACT能通過相對溫和的抗氧化作用、一定的還原力及抑制MPT來保護(hù)線粒體，保證機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡，這將是ACT促進(jìn)生命健康的可能機(jī)制。

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(責(zé)任編輯 趙環(huán)宇)

Mitochondrial Protection of Astragalus membranaceus/Codonopsis pilosula Qi-invigorating Herbal Tea and Its Underlying Mechanism

WEI Hao-hua, ZHANG Hong-ling, LI Xing-tai

(School of Life Science, Dalian Minzu University, Dalian Liaoning 116605, China)

Astragalusmembranaceus/CodonopsispilosulaQi-invigorating herbal tea (ACT) was prepared fromAstragalusmembranaceusandCodonopsispilosula. Mitochondrial protective activity of ACT and the underlying mechanism were investigated. Total flavonoids, total carbohydrates and total polysaccharides, which are the functional factors of ACT, were determined by AlCl3colorimetry and sulfuric acid/phenol method respectively. Rat liver mitochondrial permeability transition (MPT) was induced by Ca2+overloadinvitroand spectrophotometric method was used to measure it. Lipid peroxidation of liver mitochondria was induced by Fe2+/Vitamin Cinvitro. Thiobarbituric acid (TBA) colorimetry was used to measure the content of malondialdehyde (MDA). Effects of ACT on Fe2+chelation and reducing power were determined. The contents of total carbohydrates, total polysaccharides and total flavonoids of ACT were (26±1.3) mg·mL-1, (12.5±0.8) mg·mL-1and (121±8.5) μg·mL-1respectively. The results showed that ACT could inhibit mitochondria from permeability transition. ACT which also could inhibit mitochondrial MDA production has weak Fe2+chelation ability and could increase reducing power in some degree. The protective effects of ACT on mitochondrial injury were achieved by mild antioxidation and reactive oxygen species scavenging activity, reducing power and inhibiting MPT. Therefore, the balance of oxidation and antioxidant (redox balance) was maintained, which may be the underlying mechanism of mitochondrial protection and the health benefits for ACT.

Astragalusmembranaceus/CodonopsispilosulaQi-invigorating herbal tea;Astragalusmembranaceus;Codonopsispilosula; mitochondrial permeability transition; reactive oxygen species

2017-02-05

遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(201602192)；大連市科技計劃項(xiàng)目(2013E15SF131)

韋豪華(1994-)，男，廣西河池人，大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究生，主要從事中藥生化藥理學(xué)研究。

李興太(1966-)，男，山東菏澤人，副教授，博士，主要從事中藥線粒體生物能學(xué)與生化藥理學(xué)研究，E-mail: xtli@dlnu.edu.cn。

2096-1383(2017)03-0216-06

R285.5

A