聶利波，王占彬，史敦勝，宋洋洋，李 旺

枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構(gòu)建

聶利波，王占彬，史敦勝，宋洋洋，李 旺*

（河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003）

目的：以枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）為宿主，構(gòu)建纖維素酶基因整合表達(dá)載體，獲得能夠表達(dá)纖維素酶并且降解纖維素的工程菌。方法：通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）從B. subtilis LN基因組中克隆同源片段M1、M2基因片段，以質(zhì)粒pGEM-T為載體，將同源片段M1、M2、啟動(dòng)子P43和葡萄糖苷酶基因CelKg連接在一起構(gòu)建整合載體pGEM-Kmpgmt，并采用雙交換同源重組的方式將其轉(zhuǎn)化進(jìn)入B. subtilis LN基因組中。結(jié)果：通過(guò)PCR和雙酶切驗(yàn)證整合載體構(gòu)建完成，并成功整合到野生型B. subtilis LN中，獲得重組菌B. subtilis Kpg。剛果紅染色結(jié)果顯示重組菌對(duì)羧甲基纖維素鈉有降解作用。改良培養(yǎng)基37 ℃條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，重組菌B. subtilis Kpg生長(zhǎng)至18 h時(shí)上清液中纖維素酶活力比野生型B. subtilis LN提高了115%。

同源重組；纖維素酶基因；枯草芽孢桿菌

纖維素是植物組織中最豐富的組成成分之一，但在飼料中的利用率較低。以秸稈丟棄和焚燒為例，既造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，又浪費(fèi)了大量的飼料資源[1-2]。但是除牛羊等反芻動(dòng)物外，大多數(shù)畜禽對(duì)纖維素的利用率都很低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，纖維素酶的生物轉(zhuǎn)化為纖維素的利用提供新的方式。既可以高效轉(zhuǎn)化纖維素類底物，創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)利潤(rùn)[3-5]，又可以為飼料資源的開(kāi)發(fā)開(kāi)辟新的方向，緩解了目前飼料資源緊張的局面[6-7]。此外，纖維素酶作為一種綠色添加劑，在提高飼料轉(zhuǎn)化率的同時(shí)，也降低了對(duì)環(huán)境的影響。

為提高纖維素酶的活性，常借助分子技術(shù)構(gòu)建高表達(dá)載體來(lái)改善酶活力。在以往載體構(gòu)建的相關(guān)研究中，通常將外源基因直接以質(zhì)粒的形式，轉(zhuǎn)入受體菌來(lái)構(gòu)建重組菌。但是由于質(zhì)粒存在不穩(wěn)定性，在細(xì)胞分裂過(guò)程中會(huì)引起質(zhì)粒的丟失和分配不均，影響外源基因的表達(dá)[8]。同源重組技術(shù)可以將外源基因整合到宿主基因組中，避免了導(dǎo)入整個(gè)質(zhì)粒帶來(lái)的不確定性，并且改善了工程菌遺傳的穩(wěn)定性[9]。在宿主選擇方面，為了獲得高活性的外源酶產(chǎn)物，最初忽略了宿主的安全性。但是，隨著人們安全意識(shí)的提高和在飼料中使用方便性的要求，越來(lái)越多的動(dòng)物益生菌作為基因工程的宿主來(lái)使用[10]。

本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物消化道的野生型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）LN為宿主菌，利用同源重組的方式，將外源纖維素酶基因整合到宿主中構(gòu)建重組菌，以期提高纖維素酶活力并為將來(lái)在飼料實(shí)踐中使用提供材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌E.coli DH5α 天根生化科技（北京）有限公司；pGEM?-T Easy Vector載體 美國(guó)Promega公司；pGEM-P43質(zhì)粒（含啟動(dòng)子P43基因）、pGEM-M1質(zhì)粒（含同源片段M1基因）、pGEM-M2質(zhì)粒（含同源片段M2基因）、pGEM-Kg質(zhì)粒（含葡萄糖苷酶基因CelKg基因）、野生型B. subtilis LN 河南科技大學(xué)生物飼料與精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存。

1.1.2 試劑

質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；限制性內(nèi)切酶、DNA聚合酶、DNA連接酶 美國(guó)NEB公司；蛋白胨、酵母粉、羧甲基纖維素鈉 洛陽(yáng)博冠商貿(mào)有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

高速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；臺(tái)式冷凍離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher Scienti c公司；基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀 西安天隆科技有限公司；DYY-10C型電泳儀北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；雙人凈化工作臺(tái) 浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)和合成

根據(jù)GenBank中啟動(dòng)子P43基因和同源片段M1、M2基因的序列，按照通常引物的設(shè)計(jì)原則，利用Vector NTI分析軟件分別設(shè)計(jì)含有對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)的引物P4326F/ P4326R（P43基因）、M1tF/M1tR（M1基因）和M2tF/ M2tR（M2基因）。引物由上海生工生物工程股份公司合成（表1）。

表 1 引物名稱與序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2 方法

1.2.1 含M1、P43、CelKg、M2基因pGEM-T重組載體的構(gòu)建

通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)，分別利用引物P4326F/P4326R、M1tF/M1tR和M2tF/M2tR從相應(yīng)的質(zhì)粒pGEM-P43、pGEM-M1和pGEM-M2中擴(kuò)增獲得啟動(dòng)子P43和同源片段M1、M2基因。通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段純化回收。PCR回收產(chǎn)物分別使用對(duì)應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NcoⅠ、SacⅡ（P43基因）ApaⅠ、AatⅡ（M1基因）SalⅠ、BstXⅠ（M2基因）進(jìn)行雙酶切，并將產(chǎn)物回收。雙酶切回收產(chǎn)物依次插入質(zhì)粒pGEM-Kg中，構(gòu)建整合載體pGEM-Kmpgmt。將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)VectorNTI軟件和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)其序列進(jìn)行分析。

1.2.2 野生型B. subtilis LN感受態(tài)的制備

野生型B. subtilis LN感受態(tài)的制備過(guò)程參考野生型枯草芽孢桿菌N4的spizizen轉(zhuǎn)化法[11]。

1.2.3 含M1、P43、CelKg、M2基因重組菌B. subtilis Kpg的構(gòu)建

將構(gòu)建好的pGEM-Kmpgmt質(zhì)粒10 μg與500 μL的B. subtilis感受態(tài)混合，37 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)40 min，然后加入500 μL LB液體培養(yǎng)基37 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)30 min，使菌體復(fù)蘇。取100 μL菌液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)14～16 h。從LB固體培養(yǎng)基上挑取單菌落為模板，以P4326F/P4326R為引物，利用PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，將顯現(xiàn)有500 bp的單菌落樣品進(jìn)行保菌，記作B. subtilis Kpg。

1.2.4 重組菌B. subtilis Kpg的分離鑒定

將重組菌B. subtilis Kpg稀釋103倍后取10 μL滴于含1%剛果紅的羧甲基纖維素（carboxyl methyl cellulose，CMC）培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)16 h，觀察是否有透明圈的出現(xiàn)。將出現(xiàn)透明圈的菌落涂布于LB固體培養(yǎng)基上，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，通過(guò)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.2.5 重組菌B. subtilis Kpg纖維素酶活性的分析

從CMC培養(yǎng)基挑取透明圈直徑最大的菌種，接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃、210 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，分成6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，按1∶100（V/V）接種于5 mL種子培養(yǎng)基中37 ℃、210 r/min進(jìn)行培養(yǎng)。野生型B. subtilis LN作為對(duì)照組同樣處理。在12、18、24、30、36、48 h時(shí)分別取3 mL菌液4 ℃、5 000 r/min離心30 min，上清液即為粗酶液。取粗酶液1 mL加入羧甲基纖維素酶底物溶液2 mL，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）染液沸水浴10 min，迅速用流水冷卻至室溫后定容至25 mL[12]。以不加酶液的相同底物為對(duì)照，測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處OD值。

1 個(gè)酶活力單位（U/mL）定義為50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶粗酶液在1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉生成1 μg葡萄糖的酶量，酶活力（X）根據(jù)以下公式計(jì)算：

式中：N為酶樣所稀釋的倍數(shù)；k為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；t為反應(yīng)時(shí)間/min；V為酶樣體積/mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 整合載體pGEM-Kmpgmt質(zhì)粒的構(gòu)建

圖 1 載體構(gòu)建路線Fig. 1 Route for vector construction

將啟動(dòng)子P 4 3與同源片段M 1、M 2依次和含有葡萄糖苷酶基因C e l K g的載體p G E M-K g連接（圖1），每次均利用藍(lán)白斑篩選，挑菌提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。通過(guò)酶切結(jié)果顯示，利用NcoⅠ、SacⅡ雙酶切后，菌落3獲得大小約為477 bp和4 697 bp的兩個(gè)片段（圖2）；利用ApaⅠ、AatⅡ雙酶切后，菌落1、菌落3均獲得大小約為500 bp和5 170 bp的兩個(gè)片段（圖3）；利用SalⅠ、BstXⅠ雙酶切后，菌落1獲得大小約為500 bp和5 700 bp的兩個(gè)片段（圖4）。將連接成功的菌種保菌以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過(guò)以上酶切結(jié)果顯示，在連接產(chǎn)物中成功地檢測(cè)到相應(yīng)的目的基因，證明每一步都達(dá)到預(yù)期的結(jié)果。將構(gòu)建好的載體pGEM-Kmpgmt測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示啟動(dòng)子P43和同源片段M1、M2均已成功克隆到載體pGEM-Kg上。

圖 2 質(zhì)粒pGEM-Kpgt雙酶切檢驗(yàn)（NcoⅠ、SacⅡ）Fig. 2 Identification by double restriction-enzyme digestion of plasmid pGEM-Kpgt (Nco Ⅰ, SacⅡ)

圖 3 質(zhì)粒pGEM-Kmpgt雙酶切檢驗(yàn)（ApaⅠ、AatⅡ）Fig. 3 Verification by double restriction-enzyme digestion of plasmid pGEM-Kmpgt (Apa Ⅰ, AatⅡ)

圖 4 質(zhì)粒pGEM-Kmpgmt雙酶切檢驗(yàn)（SalⅠ、BstXⅠ）Fig. 4 Verification by double restriction-enzyme digestion by plasmid pGEM-Kmpgmt (Sal Ⅰ, BstXⅠ)

2.2 重組菌B. subtilis Kpg的構(gòu)建

圖 5 重組菌的PCR鑒定Fig. 5 Identification of recombinant B. subtilis by PCR method

將構(gòu)建好的載體pGEM-Kmpgmt通過(guò)化學(xué)轉(zhuǎn)化的方式轉(zhuǎn)入B. subtilis LN感受態(tài)中，涂板后挑菌以P4326F/ P4326R為引物進(jìn)行菌落PCR。在挑取的7 種菌里，菌落1、2、3、6均可以擴(kuò)增出基因片段P43（圖5）。啟動(dòng)子P43并非來(lái)源于B. subtilis LN，重組質(zhì)粒pGEM-Kmpgmt進(jìn)入細(xì)胞后，由于同源臂的作用，與受體菌自身基因組發(fā)生雙交換，順利將其整合到B. subtilis LN基因組內(nèi)，所以能從中擴(kuò)增出大小約為500 bp的片段。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明構(gòu)建的載體pGEM-Kmpgmt已通過(guò)同源重組的方式將葡萄糖苷酶基因CelKg和啟動(dòng)子P43整合到了B. subtilis LN的基因序列中。

2.3 重組菌B. subtilis Kpg纖維素降解能力的檢測(cè)

將上一步獲得的重組菌1、2、3、6進(jìn)行剛果紅染色，菌落周?chē)a(chǎn)生透明圈，證明其具有分解纖維素的能力[13]（圖6）。重組菌透明圈的直徑均大于野生型B. subtilis LN，其中重組菌3的透明圈直徑最大。LB固體培養(yǎng)基上，這4 種菌落都呈微黃色，中間凸起，表面光滑，周?chē)胁灰?guī)則的褶皺，符合B. subtilis的菌體形態(tài)特征。在1 000 倍的顯微鏡下觀察菌體呈桿狀，均有芽孢出現(xiàn)，和野生型B. subtilis LN形態(tài)相同，革蘭氏染色鏡檢呈陽(yáng)性（圖7）。

圖 6 重組菌與野生菌的剛果紅染色Fig. 6 Congo red staining of wild-type and recombinant B. subtilis

圖 7 重組菌與野生菌的革蘭氏染色Fig. 7 Gram staining of wild-type and recombinant B. subtilis

2.4 重組菌B. subtilis Kpg纖維素酶活性的分析

圖 8 重組菌與野生菌纖維素酶活力Fig. 8 Cellulase activities of wild-type and recombinant B. subtilis

從CMC-剛果紅培養(yǎng)基中挑取重組菌3，進(jìn)行纖維素酶活力分析，以野生型B. subtilis LN為對(duì)照。繪制葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出k為0.722 7。通過(guò)酶活力公式計(jì)算出各時(shí)間段重組菌3和野生型B. subtilis LN的酶活力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在37 ℃、210 r/min條件下，重組菌3在各時(shí)間段纖維素酶活力均高于同時(shí)間段野生型B. subtilis LN，在18 h時(shí)重組菌3的纖維素酶活力最大，達(dá)到55.22 U/mL，相對(duì)于野生型B. subtilis LN酶活力提高了115%（圖8）。將重組菌3記作B. subtilis Kpg。

3 討 論

葡萄糖苷酶基因CelKg源自于B. subtilis K的基因組，全長(zhǎng)為1 686 bp。通過(guò)NCBI對(duì)其進(jìn)行序列分析，葡萄糖苷酶基因CelKg與已經(jīng)報(bào)道的B. subtilis纖維素酶基因CP002468.1、CP003329.1、CP003695.1、AP012495.1、AP012496.1的基因序列相似度達(dá)到99%；其編碼的氨基酸序列與已知B. subtilis的葡萄糖苷酶基因ZP12669813.1、YP004205293.1、YP007428400.1、YP007464110.1、YP007208039.1編碼的氨基酸序列相似性達(dá)到99%[14]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)剛果紅染色結(jié)果顯示，重組菌B. subtilis Kpg的表達(dá)產(chǎn)物對(duì)羧甲基纖維素鈉有降解作用，即葡萄糖苷酶基因CelKg能在宿主B. subtilis LN內(nèi)順利表達(dá)。啟動(dòng)子P43是B. subtilis胞苷脫氨酶基因的啟動(dòng)子，屬于組成型啟動(dòng)子，與RNA聚合酶σ43（σA）和σ37（σB）的識(shí)別區(qū)相互重疊[15]。B. subtilis的DNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，σA主要參與營(yíng)養(yǎng)期基因的起始轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期晚期和穩(wěn)定期早期時(shí)由σB負(fù)責(zé)基因的起始轉(zhuǎn)錄[16]。張婷婷等[17]將啟動(dòng)子P43插入載體Peb-bgaB前段后導(dǎo)入B. subtilis，發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子P43在細(xì)菌生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)便開(kāi)始表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性，隨著細(xì)菌的不斷生長(zhǎng)，P43活性不斷提高，到達(dá)平穩(wěn)期時(shí)其活性逐漸趨于平穩(wěn)。本實(shí)驗(yàn)中，重組菌B. subtilis Kpg在18 h纖維素酶活性最高，當(dāng)細(xì)菌生長(zhǎng)至36、40、48 h時(shí)，重組菌B. subtilis Kpg和野生型B. subtilis LN纖維素酶活性都趨于平穩(wěn)并逐漸降低，但是重組菌B. subtilis Kpg相對(duì)同時(shí)期的野生型B. subtilis LN纖維素酶活性卻提高了147%、121%、160%，與張婷婷等[17]實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

本實(shí)驗(yàn)選用的同源片段M1、M2均來(lái)自于B. subtilis LN的基因組中。在同源重組過(guò)程中，選擇合理的整合位點(diǎn)，可以減輕突變引起的破壞，且最小程度地影響目的蛋白的結(jié)構(gòu)和功能[18]。此外，同源片段的長(zhǎng)度對(duì)重組效率也很關(guān)鍵。聶宇等[19]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同源片段達(dá)到50 bp時(shí)鋅指核酸酶就可以完成對(duì)同源重組的介導(dǎo)，當(dāng)同源片段增長(zhǎng)時(shí)，介導(dǎo)能力就越強(qiáng)，整合效率也就越高。但當(dāng)同源臂過(guò)長(zhǎng)，整合效率不再提高，反而會(huì)增加基因突變，對(duì)目的基因的表達(dá)產(chǎn)生影響[20]。在B. subtilis進(jìn)行同源重組時(shí)，要求同源片段的長(zhǎng)度至少為400～500 bp，這樣才能保證重組的成功[21]。同源片段M1、M2長(zhǎng)度各為500 bp，盡可能的減少片段過(guò)長(zhǎng)引起的突變或過(guò)短造成的整合效率偏低。這兩段基因所在的位置在B. subtilis LN基因組中并無(wú)明確的意義，因此在此處進(jìn)行同源重組，并不會(huì)給葡萄糖苷酶基因CelKg的表達(dá)和整個(gè)基因組的穩(wěn)定遺傳帶來(lái)不良影響。

圖 9 雙交換同源重組Fig. 9 Double crossover homologous recombination

芽孢桿菌質(zhì)粒在復(fù)制過(guò)程中對(duì)結(jié)構(gòu)的重新排列比較敏感，常常產(chǎn)生不穩(wěn)定的單鏈DNA，這樣會(huì)引起目的基因的不表達(dá)或丟失[22]。劉暉[23]將3 種來(lái)源不同纖維素酶基因以質(zhì)粒的形式分別導(dǎo)入B. subtilis中，在獲得3 株重組菌中，只有兩株能夠表達(dá)目的蛋白，剩下一株沒(méi)有表達(dá)或表達(dá)量很低。為避免這種情況，Duncan等[24]首次使用同源重組的方式，從B. subtilis噬菌體中克隆出胸腺嘧啶合成酶基因thy，以大腸桿菌質(zhì)粒為載體，構(gòu)建新型重組質(zhì)粒。依靠φ3Tthy基因兩側(cè)序列與芽孢桿菌染色體具有一定的同源性，成功的轉(zhuǎn)化進(jìn)B. subtilis 突變體。近幾年，同源重組技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在乳酸菌、酵母菌、B. subtilis、癌細(xì)胞等微生物方面[25-28]。本實(shí)驗(yàn)在Duncan的實(shí)驗(yàn)方法和原理的基礎(chǔ)上稍加改進(jìn)設(shè)計(jì)同源重組技術(shù)路線（圖9），將外源基因及相關(guān)表達(dá)原件成功整合到野生型B. subtilis LN基因組中。證明了同源重組技術(shù)在野生型B. subtilis基因組上的可行性，同時(shí)也確保了目的基因CelKg在宿主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的遺傳。

B. subtilis作為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有完整的表達(dá)分泌機(jī)制，表達(dá)蛋白在胞內(nèi)合成后，直接分泌到發(fā)酵液中，方便對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的收集和分離提純。雖然與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)的研究還并不完善，但在分泌蛋白表達(dá)活性和蛋白純化方面要明顯優(yōu)于大腸桿菌[29]。楊韻霏等[30]構(gòu)建含細(xì)菌麥芽糖淀粉酶基因的B. subtilis重組菌，發(fā)現(xiàn)重組菌酶活最高為296.64 U/mL。利用相同來(lái)源的淀粉酶基因在大腸桿菌表達(dá)，淀粉酶活力僅為227.82 U/mL，再次驗(yàn)證了B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)相對(duì)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的高效性[31]。張懿翔等[32]在B. subtilis A5中進(jìn)行透明顫菌血紅蛋白基因vgb的整合表達(dá)，通過(guò)高密度培養(yǎng)，脫膠酶的表達(dá)量提高了29.5%，脫膠效果也明顯改善。本實(shí)驗(yàn)中，B. subtilis表達(dá)系統(tǒng)也實(shí)現(xiàn)了葡萄糖苷酶基因CelKg的高效表達(dá)，重組菌B. subtilis Kpg粗酶液中纖維素酶活力最高為55.22 U/mL，與野生型B. subtilis LN相比其活力提高了115%。除此之外，B. subtilis還具有抗逆性性強(qiáng)、易儲(chǔ)存的優(yōu)勢(shì)，且生長(zhǎng)迅速，有較好的發(fā)酵基礎(chǔ)和生產(chǎn)技術(shù)。作為益生菌運(yùn)用到飼料中，一方面方便加工保存，提高活菌效果，另一方面能夠發(fā)揮B. subtilis對(duì)動(dòng)物腸道健康和免疫能力的改善，提升和改善動(dòng)物產(chǎn)品品質(zhì)[33-36]。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組菌B. subtilis Kpg，驗(yàn)證了野生型B. subtilis整合表達(dá)的可行性，將來(lái)在構(gòu)建其他酶系的重組菌時(shí)，只需將葡萄糖苷酶基因CelKg敲除換成相應(yīng)的酶基因就可以獲得穩(wěn)定遺傳的重組B. subtilis，豐富和改善B. subtilis的功能和作用。

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Construction of Cellulose Gene Integration Vector of Bacillus subtilis

NIE Libo, WANG Zhanbin, SHI Dunsheng, SONG Yangyang, LI Wang*
(College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471003, China)

Aim: To obtain an engineered bacterial strain able to express cellulose-degrading enzymes through constructing an integration vector using Bacillus subtilis as the host. Methods: The homologous fragments M1 and M2 were cloned by polymerase chain reaction (PCR) from the genome of B. subtilis LN. The glucosidase gene CelKg, homologous fragments M1 and M2 and the strong promoter P43 were ligated to the pGEM-T vector by T4 DNA Ligase to construct the integrated vector pGEM-Kmpgmt. The vector was then transformed to B. subtilis LN by double crossover homologous recombination method. Results: The integration vector was successfully constructed and integrated into the genome of B. subtilis LN, as veri ed by PCR. Congo red staining indicated that the recombinant B. subtilis could obviously degrade sodium carboxymethyl cellulose in the medium. The cellulase activity from the culture supernatant harvested after 18 h culture of the recombinant strain in a modi ed medium at 37 ℃ with shaking was increased by 115% as compared with the wild-type B. subtilis LN.

homologous recombination; cellulase; Bacillus subtilis

10.7506/spkx1002-6630-201710006

Q784

A

1002-6630（2017）10-0031-06

聶利波, 王占彬, 史敦勝, 等. 枯草芽孢桿菌纖維素酶基因整合載體的構(gòu)建[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(10): 31-36.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710006. http://www.spkx.net.cn NIE Libo, WANG Zhanbin, SHI Dunsheng, et al. Construction of cellulose gene integration vector of Bacillus subtilis[J]. Food Science, 2017, 38(10): 31-36. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710006. http://www.spkx.net.cn

2016-08-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101744）；河南省重大科技專項(xiàng)（131100110300）

聶利波（1991—），男，碩士研究生，主要從事動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：nielibo1991@163.com

*通信作者：李旺（1976—），男，副教授，博士，主要從事分子營(yíng)養(yǎng)和飼料生物技術(shù)研究。E-mail：liwang@haust.edu.cn