常惟丹,鮑長(zhǎng)俊,李 笑,孫麗平
(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)
食用菌對(duì)汞、砷的富集研究進(jìn)展
常惟丹,鮑長(zhǎng)俊,李 笑,孫麗平*
(昆明理工大學(xué)云南省食品安全研究院,云南昆明 650500)
汞、砷作為典型的有毒元素被認(rèn)為是環(huán)境中比較嚴(yán)重的污染物,對(duì)人體的危害是一個(gè)長(zhǎng)期、慢性的過程。與維管植物相比,大型真菌對(duì)一些特定的金屬和類金屬元素具有更強(qiáng)的富集能力,包括毒性元素汞、砷等。本文主要對(duì)食用菌中汞和砷元素含量水平、在菌體各部位的分布、生物富集及其健康風(fēng)險(xiǎn)分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述,特別關(guān)注了野生食用蘑菇中汞和砷的研究發(fā)展現(xiàn)狀。
食用菌,汞,砷,富集,健康風(fēng)險(xiǎn)
食用菌是一類可食用的、子實(shí)體肉眼可見、可徒手采摘的大型真菌。食用菌味道鮮美,同時(shí)具有高蛋白、高礦物質(zhì)、低脂肪、低熱量的特點(diǎn),是公認(rèn)的健康食品,深受消費(fèi)者的喜愛。隨著全球城市化和工業(yè)化的飛速發(fā)展,大量的有害物質(zhì)通過廢氣、廢水、固體廢物、殘留物等形式排放到空氣和水體中,并最終在土壤中沉積。全球范圍的金屬采冶、車輛尾氣、農(nóng)業(yè)化肥使用等造成環(huán)境中金屬和類金屬的嚴(yán)重污染物,這些元素可通過食物鏈遷移至人體,其中典型有害元素如鎘、鉛、汞、砷等可對(duì)人體造成健康危害。自20世紀(jì)70年代,研究者開始關(guān)注大型真菌對(duì)礦質(zhì)元素的富集現(xiàn)象。在后續(xù)研究中,發(fā)現(xiàn)食用菌在富含多種人體必需礦物元素的同時(shí)還可富集甚至超富集有害元素,如鉛、鎘、汞、銀、砷等[1]。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)食用菌中特別是野生食用菌中的金屬元素含量水平、分布狀況、生物富集、食用健康風(fēng)險(xiǎn)等進(jìn)行了廣泛而深入的探討[2-3]。本文主要對(duì)食用菌中汞和砷元素含量水平、在菌體各部位的分布、生物富集及其健康風(fēng)險(xiǎn)分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了簡(jiǎn)要概述,特別關(guān)注了野生食用蘑菇中汞和砷的研究現(xiàn)狀,以期對(duì)食用菌的綜合利用和健康風(fēng)險(xiǎn)提供理論參考。
汞作為一種劇毒元素,在環(huán)境中主要以元素汞、無機(jī)汞和有機(jī)汞的形式存在,其中有機(jī)汞的毒性遠(yuǎn)大于元素汞和無機(jī)汞,而有機(jī)汞中甲基汞易于穿透生物膜且通過食物鏈富集,毒性和危害性最大,當(dāng)人體血液中甲基汞的含量超過0.2 μg/g時(shí)就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀[4]。低劑量的汞對(duì)人體的神經(jīng)系統(tǒng)、運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等都會(huì)造成影響或損害[5]。FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFT)進(jìn)行了汞攝入安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià),規(guī)定總汞每周暫定耐受攝入量(PTWI)為4 μg/kg·bw/week(2011)。
砷是一種類金屬的環(huán)境毒物,砷及其化合物分布范圍非常廣泛,可通過飲食、呼吸和接觸進(jìn)入人體[6]。砷的化合物形態(tài)主要分為兩類,無機(jī)砷和有機(jī)砷。不同形態(tài)砷之間的毒性差異很大,如以有機(jī)砷形式存在的砷甜菜堿幾乎沒有毒性,而無機(jī)砷化物的毒性卻很高,被認(rèn)為是一級(jí)致癌物質(zhì),人體攝入過量無機(jī)砷會(huì)誘發(fā)多種疾病,如癌癥、角質(zhì)化等皮膚病變[7-8]。FAO/WHO食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)(JECFT)規(guī)定砷每周暫定耐受攝入量(PTWI)為15μg/kg·bw/week(1988)。
表1 汞含量分布表(mg·kg-1 干重)
續(xù)表
注:●,表示樣本中汞含量分布范圍。
2.1 汞
研究表明,不同品種的食用菌中汞含量水平具有顯著差異性[9-10]。表1對(duì)近年來報(bào)道的食用菌中汞含量水平進(jìn)行了總結(jié),數(shù)據(jù)來自于波蘭、捷克、德國(guó)、西班牙、土耳其、中國(guó)、斯洛伐克、意大利、尼日利亞和塞爾維亞等10個(gè)國(guó)家。在89種食用菌分類中,汞含量小于1 mg/kg(以干重計(jì),dw)的有63種,含量在1~5 mg/kg dw之間的有52種,在5~10 mg/kg dw之間有14種,而在10~20 mg/kg dw之間的只有6種。對(duì)汞表現(xiàn)出超富集能力的品種有草原黑蘑(Agaricusarvensis)、銅色牛肝菌(Boletusaereus)、美味牛肝菌(Boletusedulis)、褐紅蓋牛肝菌(Boletuspinopilus)、香杏麗菇(Calocybegambosa)和紫丁香蘑(Lepistanuda),其子實(shí)體內(nèi)汞含量均高于10 mg/kg dw。由表1數(shù)據(jù)可知,蘑菇屬(Agaricus)、牛肝菌屬(Boletus)和大環(huán)柄菇屬(Macrolepiota)的食用菌中具有較高的汞含量,而紅菇屬(Russula)、乳牛肝屬(Suillus)以及絨蓋牛肝菌屬(Xerocomus)的食用菌中汞含量較低;同時(shí),野生菌子實(shí)體中汞含量分布較為分散,草原黑蘑(A.arvensis)子實(shí)體中汞含量在2~20 mg/kg dw之間均有分布;美味牛肝菌(B.edulis)菌柄和菌蓋中汞含量范圍分別為1~20 mg/kg dw,0.5~10 mg/kg dw;這可能與樣品采集地域分布廣和采集時(shí)間相關(guān)。楊天偉等[12]分別采集了玉溪江川(2012年)和玉溪大營(yíng)街(2014年)的雙色牛肝菌(B.bicolor),發(fā)現(xiàn)其菌蓋、菌柄中汞含量分別為0.89、0.66 mg/kg和5.50、2.50 mg/kg,差異十分顯著。
2.2 砷
對(duì)來自中國(guó)、塞爾維亞、意大利和西班牙等4個(gè)國(guó)家,共計(jì)35種食用菌子實(shí)體中砷含量進(jìn)行總結(jié),如表2所示,大多數(shù)食用菌中砷含量較低,砷含量小于1 mg/kg dw的有22種;在1~5 mg/kg dw之間的有10種;部分食用菌中砷含量較高,在5~20 mg/kg dw之間的有5種;砷含量大于20 mg/kg dw的有4種,分別為紫蠟?zāi)?Laccariaamethystea)、紅蠟?zāi)?Laccarialaccata)、橘紅蠟?zāi)?Laccariafraterna)和酒色蠟?zāi)?Laccariavinaceoavellanea)。大量數(shù)據(jù)表明蠟?zāi)?Laccaria)對(duì)砷有較強(qiáng)的富集能力,發(fā)現(xiàn)砷含量最高的是在采礦區(qū)的紫蠟?zāi)?L.amethystea),為1420 mg/kg dw[13];Falandysz等[3]報(bào)道,橘紅蠟?zāi)?L.fraterna)中砷含量高達(dá)270 mg/kg dw。大紅菇(Russulaalutacea)和印度塊菌(TuberindicumCookeetMassee)中砷含量也較高,分別為11.68 mg/kg dw、11.86 mg/kg dw[22]。此外,據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3],毛頭鬼傘(Coprinuscomatus)和梨形馬勃(Lycoperdonpyriforme)對(duì)砷也具有極強(qiáng)的富集能力。對(duì)表2分析發(fā)現(xiàn),雖然大多數(shù)食用菌對(duì)砷無富集作用,其在菌體中含量較低,但在部分食用菌中,砷的含量較高;美味牛肝菌(B.edulis)、紫蠟?zāi)?L.amethystea)和變綠紅菇(Russulavirescens)子實(shí)體中砷含量分布較分散,可能是由于產(chǎn)地環(huán)境不同而導(dǎo)致菌體中砷含量存在差異。
表2 砷含量分布表(mg·kg-1 干重)
注:●,表示樣本中砷含量分布范圍。
食用菌中重金屬元素的含量存在顯著差異,一些研究對(duì)食用菌的富集能力進(jìn)行探究,發(fā)現(xiàn)其對(duì)重金屬的吸附能力與食用菌種類、子實(shí)體部位、基質(zhì)性質(zhì)以及元素形態(tài)等密切相關(guān)。此外,大型真菌對(duì)重金屬的攝取和元素在子實(shí)體中的存在形態(tài)取決于諸如基質(zhì)pH、溫度、初始金屬離子濃度、初始生物量、配體和可能存在競(jìng)爭(zhēng)的金屬離子等其他因素[26]。
3.1 食用菌品種對(duì)汞砷富集能力的影響
食用菌對(duì)于金屬元素的富集能力,主要以生物富集系數(shù)BCF(子實(shí)體中金屬濃度/基質(zhì)中金屬濃度)為考察指標(biāo)。大型真菌的BCF與其種類相關(guān)。Falandysz等[3]認(rèn)為,即使土壤中汞含量較低,一些食用菌中汞含量還是較其他綠色植物高。美味牛肝菌(B.edulis)、紅絨蓋牛肝菌(X.chrysenteron)、網(wǎng)紋馬勃(L.perlatum)、多數(shù)傘菌屬真菌以及部分粘蓋屬牛肝菌(Suillus)等顯示出對(duì)汞元素較強(qiáng)的富集能力,其BCF值均大于1[9,27-28];Liu等[22]采集4個(gè)地區(qū)的大紅菇(R.alutacea),BCF均大于1,表明大紅菇(R.alutacea)子實(shí)體對(duì)砷也具有一定的富集能力。但一些食用菌不易富集汞元素,如雞油菌(C.cibarius),在不同基質(zhì)背景值下,其BCF值均小于1[29],這可能是由于雞油菌質(zhì)地緊密,只有菌褶而無菌管且子實(shí)體較小;此外,側(cè)耳(P.ostreatus)及大部分鬼傘科真菌對(duì)砷元素?zé)o富集作用[3,30-31]。
3.2 食用菌子實(shí)體部位對(duì)汞砷的富集能力的影響
食用菌中汞砷含量與子實(shí)體部位相關(guān)。相關(guān)研究表明牛肝菌屬(Boletus)、疣柄屬(Leccinum)菌蓋中汞含量顯著高于菌柄[3,10]。菌蓋中蛋白質(zhì)、氨基酸含量及營(yíng)養(yǎng)指數(shù)高于菌柄,而菌柄中碳水化合物、多糖類含量高于菌蓋。汞、砷元素更易在菌蓋中富集,可能是由于菌柄和菌蓋中物質(zhì)成分存在差異,重金屬元素更易在菌蓋中和蛋白質(zhì)等物質(zhì)形成螯合物而富集[32]。Falandysz等[10]對(duì)采集的疣柄屬(Leccinum)6個(gè)品種共計(jì)204個(gè)樣本分析發(fā)現(xiàn),菌蓋和菌柄中BCF值分別為2.3~35,1.3~10。Zhang等[25]研究發(fā)現(xiàn)酒色蠟?zāi)?L.vinaceoavellanea)中菌蓋對(duì)砷的富集能力強(qiáng)于菌柄,BCF值分別為29.1、10.9。楊天偉等[12]對(duì)牛肝菌屬85個(gè)樣本中汞含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)92%的樣品中Q(C/S)>1(Q(C/S):同一牛肝菌菌蓋、菌柄總汞含量比),表明多數(shù)樣品中菌蓋對(duì)汞的富集能力強(qiáng)于菌柄。
3.3 生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)汞砷富集能力的影響
礦質(zhì)元素污染物具有很強(qiáng)的擴(kuò)散能力,可以受風(fēng)向、水紋等影響。很多研究表明,接近污染地區(qū)的野生食用菌(礦區(qū)、公路兩側(cè)等)都有較高的有害金屬富集系數(shù)[33]。食用菌中汞砷的吸附與其生長(zhǎng)環(huán)境及土壤背景值相關(guān)。Koch等[31]對(duì)金礦附近野生菌樣品分析,原本對(duì)砷無富集作用的真菌,如白黃小脆柄菇(P.candolleana)、褐疣柄牛肝菌(L.scabrum),在土壤背景值較高時(shí),其子實(shí)體中砷含量可達(dá)14、8.3 mg/kg dw,表現(xiàn)出對(duì)砷元素較強(qiáng)的吸附能力。此外,從表1和表2中可以看出,同一品種的食用菌,在不同地區(qū),汞砷的含量差異顯著。由此可見,生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)食用菌內(nèi)汞砷元素的含量有非常重要影響。
3.4 土壤中元素的種類及形態(tài)對(duì)汞砷富集的影響
目前,自然界已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的砷化合物超過50種,大型真菌在砷元素循環(huán)、有機(jī)物分解及植物共生中起著重要作用,在蘑菇中發(fā)現(xiàn)的有As(III)、As(V)、甲基胂酸(MMA)、二甲基胂酸(DMA)、三甲胂氧化物(TMAO)、砷甜菜堿(AsB)和砷膽堿(AsC)[2,35-37]。子實(shí)體中砷的主要存在形式是二甲基胂酸,約占總砷含量的70%,甲基胂酸、三甲胂氧化物和有機(jī)砷是次要存在形式。然而,蘑菇中也含有無機(jī)形式的砷元素,如砷酸鹽等。在受污染的樣本中,無機(jī)砷約占總砷含量的98%[38]。Niedzielski等[36]認(rèn)為,砷的形態(tài)與砷元素在食用菌中的吸收、轉(zhuǎn)移、積累密切相關(guān)。
食用菌對(duì)重金屬元素具有極強(qiáng)的吸附能力,重金屬含量的超標(biāo)會(huì)對(duì)人體健康造成一定的風(fēng)險(xiǎn)。GB 2762-2012《食品中污染物限量》規(guī)定,食用菌中汞限量標(biāo)準(zhǔn)為0.1 mg/kg,砷限量標(biāo)準(zhǔn)為0.5 mg/kg。重金屬對(duì)人體的健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法常用的有兩種,靶標(biāo)危害系數(shù)法(Target hazard quotients,THQ)和每周耐受攝入量(provisional tolerable weekly intake,PTWI)。
4.1 靶標(biāo)危害系數(shù)法(Target hazard quotients,THQ)
靶標(biāo)危害系數(shù)法[39](Target hazard quotients,THQ)是假定污染物吸收劑量等于攝取劑量,如果該值小于1,說明暴露人群無明顯的健康風(fēng)險(xiǎn),反之,則存在健康風(fēng)險(xiǎn)。
單一重金屬風(fēng)險(xiǎn):
n種重金屬復(fù)合風(fēng)險(xiǎn):
EF:暴露頻率(d/a),ED:暴露區(qū)間(a),FIR:食物攝入率(g/d),C:食物中重金屬含量(mg/kg),RFD:參比劑量(RFD(As)=3×10-4mg/kg/d,RFD(Hg)=3×10-4mg/kg/d),WAB:人體平均體重(kg),TA:平均暴露時(shí)間(d)。
4.2 每周耐受攝入量(provisional tolerable weekly intake,PTWI)
M:每周攝入食用菌的質(zhì)量(kg);C:食用菌中某種重金屬的含量(mg/kg);WAB:人體平均體重(kg);參比JECFT規(guī)定的PTWI(Hg):4 μg/kg·bw/week,PTWI(As):15 μg/kg·bw/week。
劉燁潼等[40]采用靶標(biāo)危害系數(shù)法對(duì)經(jīng)食用菌途徑攝入的重金屬進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)分析,7種食用菌中重金屬的THQ值均小于1,認(rèn)為對(duì)當(dāng)?shù)鼐用裆眢w健康產(chǎn)生危害的風(fēng)險(xiǎn)較低。Falandysz等[10]對(duì)云南省疣柄屬(Leccinum)野生菌研究發(fā)現(xiàn),子實(shí)體中汞含量較高,但季節(jié)性食用野生菌可認(rèn)為是安全的。
Falandysz等[3]認(rèn)為,美味牛肝菌(B.edulis)和高大環(huán)柄菇(M.procera)對(duì)汞元素具有強(qiáng)富集能力,食用過量會(huì)造成一定的健康風(fēng)險(xiǎn)。以高大環(huán)柄菇(M.procera)為例,其菌蓋中汞含量為1.3~7.0 mg/kg dw,新鮮食用菌水分含量約為90%,因此新鮮食用菌中汞含量認(rèn)為是0.13~0.7 mg/kg,當(dāng)攝取的菌蓋質(zhì)量為300~500 g時(shí),會(huì)攝入39~210 μg或65~350 μg的汞;以每周食用一次計(jì)算,當(dāng)PTWI為300 μg時(shí),即每日Hg攝入量為0.7 μg/kg/d(成人體重60 kg計(jì)算);而參比劑量RFD值為0.3 μg/kg/d,因此,攝入量明顯高于RFD值,會(huì)對(duì)人體健康造成潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)。楊天偉等[12]對(duì)云南省牛肝菌屬85個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)定,若每周食用300 g菌蓋,多數(shù)牛肝菌的Hg攝入量低于PTWI,而美味牛肝菌(B.edulis)、絨柄牛肝菌(B.tomentipes)等12個(gè)樣品汞攝入量高于PTWI;若食用300 g菌柄,則只有2個(gè)樣品的汞攝入量高于PTWI。Krasińska等[18]認(rèn)為,每次攝入異色疣柄牛肝菌(L.versipelle)300 g新鮮菌蓋,其汞攝入量為0.0195 mg,即0.325 μg/kg bw(成人體重60 kg計(jì)算)。假定人體Hg攝入無其他來源,且每日均有食用,則攝入量明顯高于RFD值。但由于食用菌具有季節(jié)性,因此可認(rèn)為由食用菌攝取的汞含量只有PTWI的20%~60%,每周食用一次異色疣柄牛肝菌(Leccinumversipelle)是安全的。
Rieder等[41]認(rèn)為甲基汞比無機(jī)汞更易富集在生物體中。Falandysz等[3]研究發(fā)現(xiàn)大型真菌菌體中甲基汞含量占總汞含量的2%~60%。甲基汞和總汞在大型真菌中的富集系數(shù)分別為19.3,7.6[41]。雖然甲基汞對(duì)生物體的毒性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無機(jī)汞,但是食用菌中的汞一般是以無機(jī)汞的形態(tài)存在,因此對(duì)人體的危害較小。
Dimitrijevic等[16]研究表明,黃柄牛肝菌(B.appendiculatus)和桃紅牛肝菌(B.regius)中砷含量分別為1.66 mg/kg dw和1.64 mg/kg dw,而JECFA規(guī)定的As攝入量為0.9 mg(以體重60 kg計(jì)),因此黃柄牛肝菌和桃紅牛肝菌對(duì)人體健康具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。Melgar等[2]對(duì)西班牙6種野生菌和2種人工栽培菌研究表明,當(dāng)?shù)鼐用衩磕陻z入野生菌大約為2 kg(5.5 g/人/天),由于食用野生菌而攝入的砷對(duì)人體健康危害是極低的。
文獻(xiàn)報(bào)道,不同品種蘑菇中砷的存在形態(tài)不同[3,11],砷化合物毒性排序?yàn)锳s(III)>As(V)>MMA>DMA>TMAO>AsB。多種大型真菌中砷以砷甜菜堿的形式存在,如翹鱗肉齒菌(S.imbricatus)、林地蘑菇(A.silvaticus)等,與其他砷類化合物相比,砷甜菜(AsB)堿毒性較小,被認(rèn)為是無毒性的;紫星裂盤菌(S.coronaria)中砷主要以甲基胂酸(MMA)形式存在,MMA是人類致癌物之一,短期接觸可導(dǎo)致胃腸炎,長(zhǎng)期接觸可能會(huì)造成肝腎功能損傷;二甲基胂酸(DMA)則是紅蠟?zāi)?L.laccata)和草菇(V.volvacea)中砷的主要存在形式,雖然DMA毒性比MMA低,但是也會(huì)對(duì)人體健康造成一定影響;而在粉褶菌屬中砷以砷酸鹽和亞砷酸鹽的形式存在[30]?,F(xiàn)行《食品中污染物限量》,汞、砷的限量是以總汞和總砷的含量為衡量標(biāo)準(zhǔn)設(shè)立,而不同形態(tài)之間汞、砷的毒害性并沒有設(shè)立相關(guān)限量。由于野生食用菌的生長(zhǎng)環(huán)境具有不可控性,因此,在今后相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的建立時(shí)可增加對(duì)不同形態(tài)的汞、砷化合物進(jìn)行限量,建立汞、砷污染物不同形態(tài)的限量機(jī)制。
食用菌具有悠久的食用歷史,是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高的美味健康食品。相比較于栽培食用菌,野生食用菌歷來是美食家的嗜好品,更是消費(fèi)者喜歡的嘗鮮食品。野生菌生長(zhǎng)環(huán)境復(fù)雜,其對(duì)有害金屬元素和類金屬元素的富集和其質(zhì)量安全問題已引起社會(huì)的廣泛關(guān)注。目前,國(guó)內(nèi)外關(guān)于食用菌汞、砷的研究集中在其總含量的測(cè)定,關(guān)于菌體中不同形態(tài)汞、砷的研究較少,此外,還應(yīng)建立以毒性強(qiáng)弱為基準(zhǔn),不同形態(tài)的汞、砷污染物的限量標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明,微生物在重金屬形態(tài)轉(zhuǎn)化機(jī)制中起重要作用,而微生物對(duì)食用菌重金屬富集作用的相關(guān)研究非常少,今后應(yīng)注重對(duì)汞、砷污染具有潛在生物修復(fù)能力微生物的研究。此外,土壤基質(zhì)中其他金屬元素對(duì)汞、砷吸附機(jī)理的影響研究較少,還有待進(jìn)一步研究。
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Research progress in the enrichment of mercury and arsenic by edible fungi
CHANG Wei-dan,BAO Chang-jun,LI Xiao,SUN Li-ping*
(Yunnan Institute of Food Safety,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China)
Mercury and arsenic,as two typical toxic elements in the environment,are considered to be the most common pollutants which harm the human body through a long-term,chronic poisoning process. Compared with vascular plants,macro fungi showed significant accumulating capacity to metals and some metalloids,including mercury,arsenic,and so on. This paper reviewed the levels of mercury and arsenic in the edible mushrooms and their distribution in the fruiting body,and focused on the bioaccumulation and health risk assessment.
edible mushroom;mercury;arscenic;bioaccumulation;health risk
2016-10-21
常惟丹(1990-),女,在讀碩士,研究方向:食品營(yíng)養(yǎng)與安全,E-mail:changweidan08023@163.com。
*通訊作者:孫麗平(1981-),女,博士,教授,研究方向:食品質(zhì)量與安全控制,E-mail:kmlpsun@163.com。
國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21267013);云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)項(xiàng)目(2015HB023)。
TS201.1
A
1002-0306(2017)09-0374-07
10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.064