王笑宇，范忠才，周 偉，余奕言，周 濤，李妙齡△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州 646000)

人心房肌細(xì)胞分離方法的改良研究*

王笑宇1，范忠才1，周 偉1，余奕言2，周 濤1，李妙齡2△

(1.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，四川瀘州 646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所，四川瀘州 646000)

目的 探索改良的人心房肌細(xì)胞分離方法。方法 采用兩步酶消化法急性分離人心房肌細(xì)胞，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)記錄小電導(dǎo)鈣激活鉀通道。結(jié)果 該分離方法可獲得數(shù)量較多的心房肌細(xì)胞，竇性心律患者可獲得完整有橫紋細(xì)胞320±30，慢性房顫患者可獲得完整有橫紋細(xì)胞230±20，比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。該方法可獲得大量形態(tài)完整，橫紋清晰的單個人心房肌細(xì)胞，且能在所分離的心房肌細(xì)胞上記錄到典型的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流。結(jié)論 該試驗(yàn)所采用的分離方法簡便，穩(wěn)定有效，可獲得細(xì)胞數(shù)量多和細(xì)胞質(zhì)量好的單個人心房肌細(xì)胞。

電學(xué)；肌細(xì)胞，心臟；人心房??；分離方法；膜片鉗；離子通道

采用單個心肌細(xì)胞進(jìn)行心律失常發(fā)病機(jī)制的研究及抗心律失常藥物靶點(diǎn)的篩選，是目前研究的熱點(diǎn)。這些研究均需要以單個心肌細(xì)胞為研究對象，通過膜片鉗技術(shù)檢測離子通道的電流變化來闡明和證實(shí)。細(xì)胞活性正常是上述研究的根本。因此，分離的心肌細(xì)胞質(zhì)量好是上述研究成功的重要保證。人體標(biāo)本來源珍貴，探索完善的人心房肌細(xì)胞分離方法至關(guān)重要。隨著電生理研究技術(shù)的深入進(jìn)展，國內(nèi)外的學(xué)者都對人心房肌細(xì)胞分離方法作了相應(yīng)的報道，分離方法不斷改善[1-6]，但在實(shí)際操作中分離出符合試驗(yàn)要求的細(xì)胞卻并非易事。現(xiàn)多采用兩步酶解法分離心肌細(xì)胞，但液體pH值、酶濃度、消化時間等報道不一，獲得的心肌細(xì)胞質(zhì)量也有所差異。本實(shí)驗(yàn)室從事心房顫動電生理研究多年，對心肌細(xì)胞分離方法掌握熟練。經(jīng)過理論和實(shí)踐相結(jié)合，能夠優(yōu)化出一種更為有效的適合做膜片鉗試驗(yàn)的細(xì)胞，并在單個心房肌細(xì)胞上可觀察到功能正常的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流(small-conductance calcium-activated potassium channels,ISK)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 選取2015年6月至2016年6月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受體外循環(huán)手術(shù)患者的新鮮右心耳組織。其中，竇性心律(SR)患者15例，慢性房顫(AF)患者13例。所有受試者均簽署知情同意書，術(shù)前均行常規(guī)超聲心動圖檢查。取材獲得西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會同意，所有試驗(yàn)程序遵照國內(nèi)相關(guān)法規(guī)和政策。

1.1.2 主要試劑 V型膠原酶、XXIV型膠原酶、牛血清清蛋白、4-羥乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)、?；撬帷⑾佘?、甘露醇、β-羧基丁酸、SK通道特異性阻斷劑(apamin)均為Sigma公司產(chǎn)品，試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要溶液 試驗(yàn)中所用細(xì)胞分離液，包括(1)心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液(牛黃酸 10 mmol/L,腺苷 5 mmol/L,硫酸鎂8 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,磷酸二氫鉀50 mmol/L,甘露醇100 mmol/L,葡萄糖140 mmol/L,用氫氧化鉀調(diào)pH值至 7.4)；(2)介質(zhì)液(氯化鈉 137 mmol/L,?；撬?10 mmol/L,硫酸鎂 1 mmol/L,磷酸二氫鉀 5 mmol/L,HEPES 5 mmol/L,葡萄糖 10 mmol/L,用氫氧化鉀調(diào)pH值至 7.4)；(3)心肌細(xì)胞KB液 (牛磺酸10 mmol/L,β-羧基丁酸10 mmol/L,磷酸二氫鉀10 mmol/L,氯化鉀 20 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 10 mmol/L,甘露醇5 mmol/L,葡萄糖 25 mmol/L,谷氨酸鉀 70 mmol/L,清蛋白 1 mg/mL,用氫氧化鉀調(diào)pH值至 7.4)；(4)記錄離子通道的浴液(N甲基氨基葡萄糖 140 mmol/L,氯化鉀 4 mmol/L,氯化鎂 1 mmol/L,葡萄糖 5 mmol/L,HEPES 10 mmol/L，用鹽酸調(diào)pH值至 7.4)；(5)電極液 (葡萄酸鉀144 mmol/L,氯化鎂 1.55 mmol/L,HEPES 10 mmol/L,EGTA 5 mmol/L)。

1.2 方法

1.2.1 人體心房肌細(xì)胞的分離

1.2.1.1 準(zhǔn)備工作 (1)打開水浴箱，保證水浴箱的溫度恒定為37 ℃左右；(2)制備酶液Ⅰ(蛋白酶5～6 U/mL，膠原酶150 U/mL，牛血清清蛋白1 mg/mL，總量5 mL，用酶介質(zhì)液配制),制備酶液Ⅱ(膠原酶150 U/mL，清蛋白1 mg/mL，總量20 mL，用酶介質(zhì)液配制)分裝于4個玻璃小瓶中(室溫)；(3)心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液充氧約20 min，充氧飽和后轉(zhuǎn)移入20 mL玻璃小瓶后置于冰桶中送往手術(shù)室，剩余心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液放置于4 ℃以備后續(xù)洗滌組織塊用。

1.2.1.2 轉(zhuǎn)運(yùn)組織 參考李妙齡等[1]的方法并加以改進(jìn)，將體外循環(huán)手術(shù)中切除的右心耳組織置于充氧飽和冰冷的心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液中。轉(zhuǎn)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該越快越好,不超過10 min為佳。如果轉(zhuǎn)運(yùn)過程不可避免時間延長，那么保存液的溫度應(yīng)維持在4 ℃[2]。

1.2.1.3 洗滌組織 (1)將組織與心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液置入10 cm直徑的培養(yǎng)皿中，洗滌血液和油脂，剔除心肌組織外膜及脂肪組織；(2)200～600 mg組織足夠用于分離細(xì)胞[2]；(3)在4 ℃心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液中將組織剪成1 mm3左右的小塊。(4)整個過程保證持續(xù)充氧，不超過3 min。

1.2.1.4 消化組織 分兩步組成：(1)將剪碎的組織塊置于酶液Ⅰ中進(jìn)行消化，整個酶消化過程均要處于水浴箱內(nèi)(37 ℃左右)。若室溫較低可能影響酶消化細(xì)胞，因而保持較高室溫。整個過程持續(xù)充氧。一般需要消化30～50 min，消化時間因酶量、組織塊大小、組織性質(zhì)、溫度而不同。一般在20 min左右用巴氏吸管吸取酶液于倒置相差顯微鏡下觀察，出現(xiàn)單個有橫紋心肌細(xì)胞時，可終止酶液Ⅰ消化。向酶液Ⅰ中加入酶介質(zhì)液，吹打洗滌后去除上清液，重復(fù)該步驟1～2次。(2)將組織塊置于酶液Ⅱ中消化，保持37 ℃并持續(xù)充氧，這一過程氧氣保持低速、平穩(wěn)，不宜充氧過快，避免氣流損傷細(xì)胞。消化3～4 min有細(xì)胞出現(xiàn)，一般在5～8 min時出現(xiàn)大量細(xì)胞，低倍視野(×100)下約10個細(xì)胞，且細(xì)胞橫紋清楚，可終止酶消化。消化時間依情況而定，一般不超過10 min。在有細(xì)胞的前提下，消化時間寧短勿長，時間過長細(xì)胞易受損，不適合膜片鉗試驗(yàn)。酶液Ⅱ消化后，用酶介質(zhì)液洗滌輕柔吹打，收集上清液，將組織塊再轉(zhuǎn)移至酶液Ⅱ。酶液Ⅱ消化重復(fù)3次，且消化時間越來越短。

1.2.1.5 保存細(xì)胞 3次消化收集的酶液500 r/min離心5 min后去除上清液，加入KB液于4 ℃保存?zhèn)溆茫?1 h后可用于電生理試驗(yàn)。

1.2.1.6 心肌細(xì)胞的計數(shù) 選取SR組心房肌8例和AF組心房肌8例進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，吸取相同體積的KB液的細(xì)胞懸液于倒置相差顯微鏡下，每組獲得的心房肌細(xì)胞在低倍鏡下(×100)觀察并計數(shù)。

1.2.1.7 心肌細(xì)胞形態(tài)的鑒定 在細(xì)胞計數(shù)的同時，按細(xì)胞形態(tài)分為桿狀有橫紋的細(xì)胞，橫紋不清晰細(xì)胞及收縮成團(tuán)的細(xì)胞。

1.2.1.8 心肌細(xì)胞的活力檢測 采用臺盼藍(lán)染色方法鑒定心肌細(xì)胞的活力，試驗(yàn)中應(yīng)用0.5 mL心房肌細(xì)胞懸液加入0.5 mL的臺盼藍(lán)溶液,充分混勻后在室溫下靜置5 min后用吸管吸取少量細(xì)胞懸液,注入計數(shù)板小室內(nèi)。在倒置相差顯微鏡下觀察心房肌細(xì)胞核染色情況。如細(xì)胞核未被染色,提示心肌細(xì)胞存活；如細(xì)胞核被染成藍(lán)色,提示心肌細(xì)胞死亡。用SR組4例和AF組4例測定的平均值計算細(xì)胞存活率,心房肌細(xì)胞活力(%) =(細(xì)胞總數(shù)-著色細(xì)胞數(shù))/細(xì)胞總數(shù)×100 %。

1.2.2 電生理記錄 吸取細(xì)胞懸液靜置于浴槽中，10 min后待細(xì)胞貼壁后加全細(xì)胞浴液灌流5～10 min。于倒置相差顯微鏡下尋找呈桿狀、細(xì)胞膜完整、橫紋清楚、無收縮、貼壁良好的心房肌細(xì)胞進(jìn)行電生理試驗(yàn)。試驗(yàn)電極采用軟質(zhì)玻璃管，經(jīng)橫式拉制儀(P-97，shutter公司,美國)拉制而成。充灌電極液后電極阻抗2～5 MΩ。采用膜片鉗放大器(EPC 10.0，HEKA公司，德國)記錄電流信號，用Patch master軟件采集數(shù)據(jù)存儲于計算機(jī)中。采樣頻率為10 kHz，低通濾波頻率為2 kHz。

2 結(jié) 果

2.1 人心房肌細(xì)胞的計數(shù) 從心臟外科體外循環(huán)所取的心房肌組織約70～90 mg，SR組可獲得完整有橫紋細(xì)胞320±30，AF組可獲得完整有橫紋細(xì)胞230±20，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，均適合于做膜片鉗試驗(yàn)，見圖1。

2.2 心肌細(xì)胞活力的鑒定 SR組與AF組分離的心房肌細(xì)胞，分別為(74.5±4.9)%和(71.9±3.7)%，兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖1。

A:兩組分離獲得的細(xì)胞數(shù)；B:兩組分離的細(xì)胞的存活率。

圖1 兩組分離的細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞存活率比較

2.3 心肌細(xì)胞形態(tài)的鑒定 該方法分離的細(xì)胞多呈桿狀，有分支，兩端鈍圓，橫紋清晰。細(xì)胞直徑10～30 μm，細(xì)胞長度約50～120 μm。分離的細(xì)胞按形態(tài)可分為以下幾類：第1類，細(xì)胞膜光滑完整，折光性強(qiáng)，橫紋清楚，無收縮，是試驗(yàn)首選，該類細(xì)胞占60%～70%；第2類，細(xì)胞膜光滑，折光性好，有橫紋，不收縮，但細(xì)胞表面有1處或多處凹陷，這類細(xì)胞也能封接并記錄電流，占10%；第3類，細(xì)胞膜不光滑，細(xì)胞不完整有破損，折光性差，無橫紋，易收縮，占5%～10%；第4類，另有細(xì)胞收縮成團(tuán)，約占10%。后兩類細(xì)胞不符合試驗(yàn)要求。4 ℃低溫保存的細(xì)胞可存活大于12 h，具有正常的細(xì)胞電生理特性。從SR組和AF組心房組織分離獲得的單個心房肌細(xì)胞，SR組細(xì)胞橫紋清晰，折光性好，AF組細(xì)胞的橫紋欠清晰，見圖2。

A:SR組;B：AF組。

圖2 急性分離的人心房肌細(xì)胞(×400)

2.4 急性分離人心房肌細(xì)胞記錄的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道電流 本試驗(yàn)中電極內(nèi)液的游離鈣離子濃度為5×10-7mol/L，保證SK通道的激活。形成全細(xì)胞模式后，保持電位在-60 mV，指令電壓從-130 mV去極化到+60 mV，持續(xù)200 ms，階躍10 mV，可記錄到一內(nèi)向整流電流,在此基礎(chǔ)上加入SK通道特異性阻斷劑apamin后電流明顯減小，加藥前后相減的電流為SK通道電流。當(dāng)指令電壓在-130 mV時的電流幅值為-434 pA，加入Apamin后電流幅值為-270 pA，-130 mV的SK通道電流為-164 pA。給藥前后的電流-電壓關(guān)系曲線見圖3，該電流具有明顯的內(nèi)向整流特性。

A：加apamin前;B:加apamin(100 nmol/L)后;C:SK通道的電流-電壓關(guān)系曲線。

圖3 人心房肌細(xì)胞上記錄到的小電導(dǎo)鈣激活鉀通道

3 討 論

采用人體心房樣本進(jìn)行試驗(yàn)具有較好的臨床價值。人心房肌細(xì)胞的分離雖有較多的報道，但真正獲得質(zhì)量好活性正常的人心房肌細(xì)胞依然很有難度，因此獲得功能正常的人心房肌細(xì)胞成為了后續(xù)很多試驗(yàn)的瓶頸。本文研究者從事心房肌細(xì)胞研究二十余年，通過該分離方法的改進(jìn)，可以獲得質(zhì)量好，數(shù)量多的單個人心房肌細(xì)胞。分離細(xì)胞經(jīng)常會遇到以下問題：細(xì)胞形態(tài)好，但耐鈣能力差，在含鈣的細(xì)胞外液中收縮死亡；耐鈣但貼壁不良好，無法滿足試驗(yàn)要求。

以上現(xiàn)象都與細(xì)胞質(zhì)量不良和功能受損密切相關(guān)，本文提出的分離方法借鑒國內(nèi)外科研者分離方法，依靠大量實(shí)踐，從以下幾方面嚴(yán)格控制條件[7]：(1)整個試驗(yàn)過程均需要氧飽和，轉(zhuǎn)運(yùn)組織至實(shí)驗(yàn)室這一過程由于無法充氧，要保證心肌轉(zhuǎn)運(yùn)液充氧充足；酶解細(xì)胞過程需維持在37 ℃；嚴(yán)格控制細(xì)胞分離液的pH值，分離液pH控制在7.2～7.4[8]；本試驗(yàn)采用德國產(chǎn)的純水儀(Millipore),符合試驗(yàn)要求：水電導(dǎo)在1 μs/cm以下。(2)分離時應(yīng)盡量剔除結(jié)締組織和脂肪組織，實(shí)踐表明油脂和結(jié)締組織影響酶解細(xì)胞的效果。組織塊以1 mm3左右大小較佳，太大不利于酶消化。(3)酶濃度、類型、批次、保存溫度、溶解程度都與分離效果有關(guān)[9-10]。根據(jù)不同年齡段的患者酶量作適當(dāng)調(diào)整，調(diào)整幅度不超過10%。一般中老年患者酶量高于青年及幼兒患者。膠原酶的選擇可能是分離細(xì)胞最關(guān)鍵的一步了。Worthington V型膠原酶已經(jīng)成功分離出人心房肌細(xì)胞[11-17]。盡管Ⅱ性膠原酶也能分離出大量有活性符合試驗(yàn)要求的細(xì)胞，但根據(jù)實(shí)踐還是推薦V型。即使在一個單一的膠原酶類型中也有不同批次表現(xiàn)出的顯著酶活性不同。這些不同就要求研究者仔細(xì)挑選批次并測試不同批次以獲得完美的分離過程。Worthington生化公司有在線可用的批次挑選工具。(http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php)[18]。(4)嚴(yán)格控制消化時間，消化時間因酶量、組織塊大小、患者年齡、溫度有所不同。酶解過程中可能轉(zhuǎn)瞬就會出現(xiàn)細(xì)胞，特別是酶液Ⅱ消化過程，出現(xiàn)大量細(xì)胞應(yīng)立即中止，避免過度消化而致細(xì)胞狀態(tài)不好。(5)吹打細(xì)胞應(yīng)輕柔，特別是酶液Ⅱ消化階段和離心后，盡量保持細(xì)胞的完整性。(6)早在1970年就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)肌細(xì)胞在含鈣環(huán)境中分解，所有的細(xì)胞會攣縮或沒有活性。因此分離細(xì)胞要在無鈣中完成。但是生理濃度的鈣離子重新引入會引起鈣快速內(nèi)流而致細(xì)胞死亡。這被稱為“鈣離子悖論現(xiàn)象”。改善分離環(huán)境包括通過添加?；撬峤档蚿H到7.0，，還有將分離的細(xì)胞保存在配有EGTA的保存液中，這些都可以防止上述現(xiàn)象發(fā)生。

本試驗(yàn)參考李妙齡等[1]的方法，進(jìn)行了改進(jìn)。本方法的優(yōu)點(diǎn)在于省略了EGTA脫鈣的過程，也不需要過濾。酶用量少，對細(xì)胞損傷小。每次用蛋白酶2.5 mg，膠原酶4.5 mg。消化時間縮短，一般酶液Ⅰ消化30～40 min，酶液Ⅱ不超過10 min。酶液Ⅰ出現(xiàn)有橫紋細(xì)胞就終止消化，保證了細(xì)胞的質(zhì)量，這是實(shí)踐總結(jié)。分離出的細(xì)胞有收縮成團(tuán)的，但60%～70%符合試驗(yàn)要求，在含鈣細(xì)胞外液中能夠存活，可保存12 h左右。

細(xì)胞的完整性和正常的生理功能是試驗(yàn)的基礎(chǔ)，應(yīng)用該方法分離出的細(xì)胞可封接并且能記錄到ISK電流，表明這種方法是能分離出符合膜片鉗要求的細(xì)胞，具有可重復(fù)性，有利于心肌細(xì)胞相關(guān)疾病的電生理試驗(yàn)研究。

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An improved method for isolation of human atrial cardiomyocytes*

WangXiaoyu1,FanZhongcai1,ZhouWei1，YuYiyan2,ZhouTao1，LiMiaoling2△

(1.DepartmentofCardiology,theAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000,China; 2.KeyLaboratoryofMedicalElectrophysiology,MinistryofEducationofChina,InstituteofCardiovascularResearch,SouthwestMedicalUniversity,Luzhou,Sichuan646000，China)

Objective To study an improved isolated method of single human atrial myocytes.Methods Enzyme digestion method was used to isolate single myocytes from human atrial and whole-cell patch clamp technique was used to record small conductance calcium activated potassium current.Results This method obtained a large number of atrial myocytes.The total amount of atrial myocytes in SR group was 320±30 while AF group was 230±20 and the difference was statistically significant(P<0.01).In this study,a large number of simple and striated single atrial myocytes were obtained，and a typical small-conductance calcium-activated potassium channel current was recorded on the isolated atrial myocytes.Conclusion The established isolated method is simple,stable and effective.We can acquire a large amount of single atrial myocytes with good quality.

electricity;myocytes,cardiac;human atria myocytes；isolated method;patch-clamp technique;ionic channel

術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.023

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81470022);四川省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(16ZA0192)；瀘州市-瀘州醫(yī)學(xué)院聯(lián)合項(xiàng)目(20140975)。 作者簡介：王笑宇(1990-)，在讀碩士，主要從事心血管內(nèi)科方面研究?！?/p>

，E-mail:limiaolingcc@163.com。

R972.4

A

1671-8348(2017)14-1941-03

2017-02-08

2017-03-26)