徐關(guān)峰，鄭思春

(廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控斜紋夜蛾和家蠶幼蟲的生長

徐關(guān)峰，鄭思春*

(廣州市昆蟲發(fā)育調(diào)控與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

DNA甲基化是真核生物生長發(fā)育過程中基因表達(dá)的一種重要調(diào)控機(jī)制。本研究以鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾Spodopteralitura和模式昆蟲家蠶Bombyxmori為材料，研究了甲基化對(duì)幼蟲生長的影響。研究結(jié)果表明，注射甲基化抑制劑5-Aza-dC后，不正常斜紋夜蛾比對(duì)照增加了36%，家蠶的增加了58.8%，不正常蟲的生長發(fā)育緩慢、體型變小。斜紋夜蛾DNA甲基轉(zhuǎn)移酶Sldnmt1 RNAi獲得了相似的結(jié)果，不正常幼蟲率比對(duì)照增加了35%。檢測(cè)家蠶Bmdnmt1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)Bmdnmt1在5齡期的翅原基、脂肪體、表皮和中腸均有表達(dá)，其表達(dá)量在翅原基中的為最高；在翅原基和脂肪體中，Bmdnmt1的含量在5齡初期比在預(yù)蛹期的要高。初步分析了甲基化抑制劑處理后的家蠶脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)脂肪酶和乙酰輔酶A結(jié)合蛋白的mRNA水平在注射5-Aza-dC后48 h顯著下調(diào)。研究結(jié)果初步表明了DNA甲基化參與調(diào)控了鱗翅目幼蟲的生長發(fā)育，脂肪代謝可能是DNA甲基化調(diào)控的其中一個(gè)通路。

DNA甲基轉(zhuǎn)移酶；功能；斜紋夜蛾；家蠶；幼蟲

DNA甲基化是指DNA鏈上胞嘧啶第5位碳原子和甲基之間的共價(jià)結(jié)合。以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-L-methionine, SAM)作為甲基供體, 在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶 5C位上，形成5-甲基胞嘧啶(Vanyushin, 2006)。DNA甲基化作為一種普遍存在于真核生物中重要的表觀遺傳調(diào)控，在調(diào)控基因表達(dá)和生物體生長發(fā)育過程中具有重要的作用，受到越來越廣泛的關(guān)注。昆蟲綱Insecta不僅是節(jié)肢動(dòng)物門，也是整個(gè)動(dòng)物界種類和數(shù)最多的一個(gè)綱；并且昆蟲形態(tài)復(fù)雜以及具有變態(tài)發(fā)育等特有生理過程，因此研究昆蟲 DNA甲基化的功能具有重要的意義(陳瑋等，2015)。近年來發(fā)現(xiàn)昆蟲DNA甲基化與高等哺乳動(dòng)物有一定的相似性，但也具有其獨(dú)特的特點(diǎn)和功能。目前的研究表明昆蟲DNA甲基化涉及調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育、參與基因印跡、調(diào)控級(jí)型和翅型分化、影響性別決定和介入抗藥性形成等(梁士可等，2014)。較多的研究報(bào)道集中在蜜蜂Apismellifera分化為工蜂和蜂王過程中幼蟲與成蟲的DNA甲基化基因的分析(Kucharskietal., 2008; Shaoetal., 2014)。在東亞飛蝗Locustamiratoriamanilensis中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象，通過不同喂養(yǎng)方式導(dǎo)致的獨(dú)居和群居兩種類型的蝗蟲中，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(Dnmt1)、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶2和DNA甲基結(jié)合蛋白存在顯著的表達(dá)差異(Robinsonetal.，2015)。在白背飛虱Sogatellafurcifera中，DNA甲基化的含量影響了翅的發(fā)育，短翅型的DNA甲基化含量(5.81%)高于長翅型(2.40%)(Zhouetal., 2013)。 DNA甲基化影響卵發(fā)育也有研究報(bào)道，沉默剛孵育的蜜蜂幼蟲中的Amdnmt3基因，出現(xiàn)卵巢發(fā)育完全的蜂后(Kucharskietal., 2008)；鱗翅目家蠶Bombyxmori卵注射BmdnmtdsRNA后，卵中基因甲基化率便發(fā)生變化(Xiangetal., 2013)。上述的研究報(bào)道顯示DNA甲基化多發(fā)生于昆蟲的形態(tài)變化中。昆蟲的幼蟲生長過程中是否存在DNA甲基化調(diào)控仍不清楚，特別是作為農(nóng)業(yè)害蟲主要所在的鱗翅目昆蟲，一直被認(rèn)為其DNA甲基化率較低，對(duì)生長發(fā)育的影響不是很重要。有報(bào)道金小蜂Nasoniavitripennis中被甲基化的基因主要為在整個(gè)發(fā)育過程都表達(dá)的組成型基因，側(cè)面體現(xiàn)DNA甲基化的表觀調(diào)控作用貫穿整個(gè)生長發(fā)育過程(Wangetal., 2013)。因此探討農(nóng)業(yè)害蟲的幼蟲生長過程的DNA甲基化調(diào)控作用，將對(duì)發(fā)現(xiàn)可用于害蟲防治的新途徑提供思路。

在哺乳動(dòng)物中，從DNA甲基化的建立到維持需要3類DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的共同參與，即DNMT1、DNMT2和DNMT3(又分a和b兩種類型)(Klose and Bird, 2006)。DNMT1稱為維持型甲基化酶，其在DNA進(jìn)行半保留復(fù)制時(shí)，促使新合成的DNA鏈進(jìn)行甲基化(Bestor, 2000; Goll and Bestor, 2005);DNMT3能夠催化DNA從頭甲基化，這一過程主要發(fā)生在生物體發(fā)育的早期階段(Okanoetal., 1999; Katoetal., 2007)；DNMT2起初被認(rèn)為也是一種DNA甲基化酶，但最近的研究表明DNMT2主要是使RNA甲基化(Golletal., 2006)，因此其功能完全不同于DNMT1和DNMT3(柳瑩等，2013；梁士可等，2014)。 在昆蟲中，蜜蜂和環(huán)節(jié)動(dòng)物等基因組中具有dnmt1、dnmt2和dnmt3基因，而在家蠶、沙漠蝗和赤擬谷盜等中只有dnmt1和dnmt2，缺乏dnmt3基因(Lykoetal., 2011)。Mitsudome等(2015)發(fā)現(xiàn)BmDNMT11不僅可以與半甲基化DNA，也可以與無甲基化DNA的結(jié)合，催化DNA甲基化，表明家蠶和沙漠蝗Schistocercagregaria的甲基化形成和維持的機(jī)制有可能不同于哺乳動(dòng)物，推測(cè)家蠶等DNMT1綜合了哺乳動(dòng)物DNMT1和DNMT3的功能。敲除Bmdnmt1后導(dǎo)致家蠶的孵化率降低(Xiangetal., 2013)。在人類和小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，DNMT1的N-末端參與細(xì)胞內(nèi)定位及催化活性的調(diào)節(jié)，包括用于結(jié)合DNA甲基化相關(guān)蛋白(DMAP1)的帶電結(jié)構(gòu)域、核定位信號(hào)(Nuclear localization signal，NLS)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)結(jié)合位點(diǎn)、復(fù)制焦點(diǎn)靶向區(qū)域(Replication focus targeting sequence，RFTS)、鋅離子結(jié)合域CXXC以及2個(gè)涉及運(yùn)送DNMT1至復(fù)制叉的Polybromo結(jié)構(gòu)域BAH(Fatemietal., 2001; Lee and Skalnik, 2005; Youngetal., 2006; Spadaetal., 2007; Songetal., 2012)；C-末端為典型的催化結(jié)構(gòu)。而在昆蟲中，DNMT1的結(jié)構(gòu)大致相近(陳瑋等，2015)。

斜紋夜蛾Spodopteralitura為鱗翅目夜蛾科農(nóng)業(yè)害蟲，在中國除青海和新疆未明外，各省(自治區(qū))都有發(fā)現(xiàn)。幼蟲取食甘薯、棉花、芋、蓮、田菁、大豆、煙草、甜菜和十字花科和茄科蔬菜等近300種植物的葉片，間歇性猖獗為害，本文選取其幼蟲以及鱗翅目模式昆蟲家蠶進(jìn)行研究。本研究獲得了3948 bp斜紋夜蛾Sldnmt1 cDNA，并進(jìn)行了Sldnmt1功能研究：分別在斜紋夜蛾的Sldnmt1催化保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物合成dsRNA，于幼蟲期注射Sldnmt1 dsRNA干擾該基因，以及注射甲基化抑制劑，皆導(dǎo)致約40%幼蟲的生長不正常。家蠶幼蟲注射甲基化抑制劑獲得了與斜紋夜蛾相似的結(jié)果。通過表達(dá)譜分析，確定了家蠶Bmdnmt1在幼蟲期的翅原基和脂肪體中比在預(yù)蛹期具有相對(duì)較高的表達(dá)量。研究結(jié)果表明了在鱗翅目昆蟲的幼蟲存在DNA甲基化調(diào)控。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

斜紋夜蛾Spodopteralitura：中山大學(xué)昆蟲研究所提供，蟲源來源于廣州的一塊蔬菜田，在實(shí)驗(yàn)室中人工傳代50代以上。卵孵化后于25℃用人工培養(yǎng)基進(jìn)行飼養(yǎng)。

家蠶Bombyxmori品系P50：蠶卵由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)所提供。蠶卵在26℃±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期14 h ∶10 h(光 ∶暗)的恒溫培養(yǎng)箱中孵化，孵化后幼蟲在相同環(huán)境中用桑葉(采摘自廣州寶桑園和華南農(nóng)業(yè)大學(xué)蠶學(xué)桑園實(shí)習(xí)基地)進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 生物信息學(xué)分析

用軟件Primer premier 5.0(PREMIER Biosoft International，美國)設(shè)計(jì)引物；用在線軟件Primer-blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)分析引物的特異性。用在線軟件Conserved Domain Architecture Retrieval Tool(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=rps)分析蛋白結(jié)構(gòu)域。

1.3 RNA干擾

Sldnmt1的互補(bǔ)雙鏈RNA按T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒(Promega, USA)提供方法進(jìn)行合成。先用cDNA擴(kuò)增合成雙鏈RNA所需的模板DNA鏈，步驟如下：預(yù)熱94℃ 3 min后，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35次循環(huán)，最后72℃ 10 min充分?jǐn)U增。隨后按照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒說明書合成和純化所需的dsRNA。合成的dsRNA溶解在不含RNA酶的水中，gfp dsRNA作為對(duì)照并按相同方式進(jìn)行合成。相關(guān)引物見表1。

表1 本研究中dsRNA合成所用引物表

RNA雙鏈注射：選取斜紋夜蛾剛進(jìn)入5齡幼蟲注射已合成的dnmt1雙鏈RNA。幼蟲先在冰上放置30 min，從幼蟲第2胸節(jié)將30 μg dsRNA注入到體腔，50-60頭蟲為一份樣，共3個(gè)重復(fù)。留取20-25頭用于形態(tài)觀察，其余在注射后24 h和72 h收集整蟲，提取RNA進(jìn)行基因敲除分析。

1.4 RNA提取及cDNA制備

按照Trizol試劑盒(Invitrogen, California, USA)說明書提取總RNA。 對(duì)于所有的樣品，取2 μg總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。合成步驟如下：取2 μg總RNA，混合5×M-MLV緩沖液、dNTP混合液、RNase抑制劑和DNAse I，于37℃ 30 min，然后75°C 10 min，隨后加入RTase M-MLV(RNaseH-)和Oligo(dT)18引物，于37℃ 60 min，然后70℃ 15 min。

1.5 QPCR分析

按照2×SYBRPremix EXTaqTM(TaKaRa, Dalian, China)試劑盒說明書進(jìn)行qPCR分析。在dnmt1的催化區(qū)域中的非dsRNA 設(shè)計(jì)區(qū)域，分別設(shè)計(jì)Sldnmt1和Bmdnmt1的qPCR引物。所有基因的相對(duì)表達(dá)量以RP49為內(nèi)參。ABI7300 Real-time PCR系統(tǒng)程序如下：變性95°C 10 s后，95°C 10 s，60°C 31 s，循環(huán)40次(Applied Biosystems, Foster City, CA)。通過2-ΔΔCt的方式進(jìn)行計(jì)算(Livak & Schmittgen, 2001)，所有的數(shù)據(jù)為3次生物學(xué)重復(fù)。定量PCR引物見表2。

表2 本研究中qPCR所用引物表

1.6 DNA甲基化抑制劑注射

選取剛進(jìn)入5齡的家蠶和斜紋夜蛾幼蟲，分別注射水溶的DNA甲基化抑制劑5-aza-dC，(Sigma, USA)。幼蟲先在冰上放置30 min，從幼蟲第2胸節(jié)注入60 μg 抑制劑到體腔，60-80為一份樣，共3個(gè)重復(fù)。對(duì)照則選取相同幼蟲注射等量的ddH2O。除了留取20頭用于形態(tài)觀察，其余在注射后12 h、24 h和48 h收集整蟲，提取RNA進(jìn)行相關(guān)基因分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

所有的數(shù)據(jù)均為平均±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，n=3。結(jié)果的意義由方差分析得出。*為P<0.05;**為P<0.01;***為P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 斜紋夜蛾Sldnmt1 cDNA的獲得及其結(jié)構(gòu)分析

本研究從NCBI網(wǎng)站上得到家蠶DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1序列(Bmdnmt1 GenBank編號(hào)：AB194008.1)，繼而根據(jù)家蠶Bmdnmt1序列比對(duì)斜紋夜蛾幼蟲頭部和中腸的轉(zhuǎn)錄組(未發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)在斜紋夜蛾幼蟲頭部及中腸都存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1。如圖1所示，斜紋夜蛾SlDNMT1的ORF序列，由1311個(gè)氨基酸組成。

將家蠶和斜紋夜蛾與其他昆蟲的DNMT1氨基酸序列進(jìn)行比較表明，昆蟲DNMT1的氨基酸為1300-1500個(gè)。如臍橙螟DanausplexippusDNMT1(GenBank 編號(hào)：EHJ76342.1)為1428個(gè)氨基酸，大紅斑蝶PapiliomachaonDNMT1(GenBank編號(hào)：KPJ15240.1)為1363個(gè)氨基酸。各物種DNMT1氨基酸序列相似度高于70%(表3)，表明了不同昆蟲DNMT1可能具有相似功能。進(jìn)一步用軟件分析它們的蛋白結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)除了N-端略有差異外，氨基酸序列基本保守。N-端包含了與DNA相結(jié)合的鋅離子結(jié)合域(zinc finger CXXC)，以及2個(gè)與運(yùn)送DNMT1至復(fù)制叉相關(guān)的Polybromo結(jié)構(gòu)域(BAH)；C-端為催化結(jié)構(gòu)域(SAM_MT_C5)和具有6個(gè)保守的DNA結(jié)合活性基序(motif Ⅰ、motif Ⅳ、motif Ⅵ、motif Ⅷ、motif Ⅸ、motif Ⅹ)(圖2)。Motif Ⅰ和motif Ⅹ折疊在一起，形成SAM的結(jié)合位點(diǎn)；motif Ⅳ中的脯氨酸和半胱氨酸，為 C-端催化結(jié)構(gòu)提供甲醇基(陳瑋等，2015)。

2.2 采用RNAi方法研究dnmt1對(duì)斜紋夜蛾幼蟲生長的影響

由于昆蟲DNMT1結(jié)構(gòu)都由鋅指結(jié)構(gòu)、Polybromo結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域組成，因此選擇重要功能區(qū)域(催化區(qū)域)合成dnmt1 dsRNA，進(jìn)行dnmt1功能分析。結(jié)果表明：注射Sldnmt1 dsRNA 72-96 h后的斜紋夜蛾與對(duì)照相比，部分幼蟲發(fā)育滯后，蟲體體型偏小(圖3)。斜紋夜蛾這類體型偏小幼蟲增加了35%(表4)。定量PCR證明注射dsRNA的斜紋夜蛾中Sldnmt1表達(dá)量明顯下降，表明斜紋夜蛾RNAi后幼蟲發(fā)育不正?？赡苁荢ldnmt1表達(dá)受到干擾的緣故。

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圖1 斜紋夜蛾DNA甲基轉(zhuǎn)移酶 1全長氨基酸序列

Fig.1 The amino sequence ofSpodopteralituraDNA methyltransferase 1

圖2 昆蟲DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(DNMT1)氨基酸和蛋白結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of amino acid and protein structure of insect DNA methyl transferase 1 (DNMT1)

2.3 利用DNA甲基化抑制劑研究Dnmt1對(duì)斜紋夜蛾和家蠶幼蟲生長的影響

5-氮-2′脫氧胞苷(5-Aza-dC)是一種真核生物的DNA甲基化抑制劑，已被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療和科研實(shí)驗(yàn)。 5-Aza-dC通過磷酸化后直接摻入DNA，抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶，引起DNA低甲基化(Dastjerdietal., 2014; Zhouetal., 2015; Andersetal., 2016)。對(duì)鱗翅目農(nóng)業(yè)害蟲斜紋夜蛾和模式昆蟲家蠶進(jìn)行甲基化抑制劑處理，結(jié)果表明注射5-Aza-dC36 h后的部分家蠶和斜紋夜蛾出現(xiàn)了發(fā)育不良和幼蟲體型較小的癥狀(圖4)。其中斜紋夜蛾發(fā)育不良的幼蟲比對(duì)照增加了36%(表4)，結(jié)果與Sldnmt1 RNAi的結(jié)果相似(圖3)；不正常家蠶增加了58.8%(表4)，表明DNA甲基化對(duì)家蠶幼蟲生長的影響大于對(duì)斜紋夜蛾的，同時(shí)也證明了DNA甲基化在家蠶等鱗翅目昆蟲中確實(shí)對(duì)幼蟲的生長起到調(diào)控作用。

表3 不同昆蟲物種DNMT1氨基酸序列一致性比較

注：不同物種DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1分別為：BmDNMT1，家蠶 ；AtDNMT1，臍橙螟； DpDNMT1，大紅斑蝶； PmDNMT1，金鳳蝶；PpDNMT1，玉帶鳳蝶；PxDNMT1，柑橘鳳蝶；SlDNMT1，斜紋夜蛾。Note: Different species of Methyltransferase 1: BmDNMT1,Bombyxmori; AtDNMT1,Amyeloistransitella; DpDNMT1,Danausplexippus; PmDNMT1,Papiliomachaon; PpDNMT1,Papiliopolytes; PxDNMT1,Papilioxuthus; SlDNMT1,Spodopteralitura.

圖3 Sldnmt1 RNAi后部分斜紋夜蛾性狀圖(左)和Sldnmt1表達(dá)分析(右)Fig.3 The phenotype (left) and Sldnmt1mRNA level (right) of Spodoptera litura after Sldnmt1 RNAi

實(shí)驗(yàn)Experiment注射物質(zhì)Injectedmaterials斜紋夜蛾(%)Slitura家蠶(%)Bmoridnmt1RNAidsgfp(對(duì)照Control)4-dsSldnmt139-DNA甲基化抑制劑DNAmethylationinhibitor水Water(對(duì)照Control)11595?Aza?dC47647

注：每份樣品蟲數(shù)目為18-25條。Note: The number of per sample is 18-25.

2.4 家蠶Bmdnmt1表達(dá)譜分析

以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)了dnmt1影響幼蟲的生長發(fā)育，為了查明dnmt1如何發(fā)揮作用，本研究調(diào)查了家蠶5齡期Bmdnmt1表達(dá)的組織分布。采用定量PCR方法檢測(cè)Bmdnmt1在不同組織的mRNA水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從組織而言，家蠶5齡期各個(gè)組織均有Bmdnmt1表達(dá)，以翅原基中的表達(dá)量為最高；從發(fā)育時(shí)間而言，在翅原基和脂肪體中以5齡初期含量較高，在表皮中以游走期較高，而中腸中則表達(dá)比較平穩(wěn)。結(jié)果表明了鱗翅目昆蟲dnmt1在幼蟲期確有表達(dá)。

圖4 DNA甲基化抑制劑處理36 h后斜紋夜蛾(上)和家蠶(下)表型分析Fig.4 The phenotypes of Spodoptera litura (above) and Bombxy mori (below) treated with DNA mehylation inhibitor for 36 h

圖5 Bmdnmt1在家蠶不同組織中的表達(dá)情況Fig.5 The expression of Bmdnmt1 in different tissues of Bombxy mori 注：A，翅原基；B，脂肪體；C，表皮；D，中腸。5L，5齡；W，游走期；PP，預(yù)蛹期；數(shù)字，天數(shù)。Note: A, Wing disc; B, Fat body;C, Epidermis; D, Midgut; 5L, Fifth instar larvae; W, Wandering stage; PP, Prepupal stage; Numbers, Days of development.

2.5 DNA甲基化調(diào)控家蠶幼蟲脂肪代謝

由于DNA甲基化抑制劑和RNAi實(shí)驗(yàn)的結(jié)果皆表明，DNA甲基化可能通過調(diào)控營養(yǎng)代謝來影響幼蟲的生長。為此，本研究初步分析了注射DNA甲基化抑制劑(5-Aza-dC)后的家蠶翅中與脂肪代謝有關(guān)的基因：脂肪酶(lipase)(GenBank 編號(hào)：XP_004931923.1)和乙酰輔酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA binding protein)(GenBank 編號(hào)：NM_001043557.1)。發(fā)現(xiàn)這兩基因在注射了抑制劑48 h后的表達(dá)都呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。因此， DNA甲基化抑制劑處理導(dǎo)致的脂肪代謝受阻，可能是昆蟲生長延緩的其中一個(gè)原因。

圖6 DNA甲基化抑制劑注射5齡家蠶后脂肪酶和乙酰輔酶A結(jié)合蛋白mRNA水平分析Fig.6 The analysis of the mRNA levels of acyl-CoA binding protein and lipase in Bombxy mori larvae injected with DNA methylation inhibitor

3 結(jié)論與討論

DNA甲基化是真核生物生長發(fā)育過程中基因表達(dá)的一種重要調(diào)控機(jī)制。它在昆蟲中被證實(shí)參與了多種發(fā)育過程， 如蜜蜂卵期敲除Amdnmt3后，新孵出的蜜蜂多呈現(xiàn)出蜂王的特征(Kucharskietal.，2008)；獨(dú)居型蝗蟲和群居型蝗蟲的Lmdnmt1、Lmdnmt2和Lmmbd2/3等以及DNA甲基化相關(guān)基因的表達(dá)水平存在顯著差異(Robinsonetal., 2015)；家蠶卵期敲除Bmdnmt1基因后，家蠶孵化率明顯下降(Xiangetal., 2013)。但是至今仍沒有關(guān)于DNA甲基化對(duì)昆蟲幼蟲生長調(diào)控研究報(bào)道。本研究選取農(nóng)業(yè)重要害蟲斜紋夜蛾，針對(duì)鱗翅目昆蟲中重要DNA甲基化酶基因dnmt1(柳瑩等，2013)，采用了RNAi方法，證明dnmt1參與調(diào)控幼蟲期的生長(圖3)。同時(shí)還采用甲基化專一抑制劑(5-aza-dC)進(jìn)行了相似的實(shí)驗(yàn)。5-aza-dC在小鼠、大鼠和人體等哺乳動(dòng)物體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都證明可以顯著抑制DNA基因組的甲基化含量(Fülleretal.，2015; Songetal.，2016; Wangetal.，2016)。5-aza-dC注射結(jié)果表明，抑制劑有效的抑制了斜紋夜蛾以及家蠶的DNA甲基化形成，導(dǎo)致幼蟲出現(xiàn)不同比例的生長顯著滯緩，個(gè)體變小等性狀，進(jìn)而驗(yàn)證了基因組甲基化調(diào)控家蠶和斜紋夜蛾等鱗翅目昆蟲幼蟲的生長。

但是，在本實(shí)驗(yàn)中，不論是RNAi還是甲基化抑制劑(5-aza-dC)的注射實(shí)驗(yàn)，都只得到35%-60%昆蟲發(fā)生了性狀變化，而非全部家蠶或斜紋夜蛾出現(xiàn)不正常的表型。分析其中一個(gè)原因可能是在幼蟲時(shí)期表達(dá)量相對(duì)不高，因?yàn)椴还茉诶ハx還是哺乳動(dòng)物，dnmt1雖然在各時(shí)期的組織都有一定量的表達(dá)，但其主要的表達(dá)高峰期為受精卵、卵巢和睪丸等與生殖相關(guān)組織, 因而dnmt1對(duì)卵巢以及胚胎的早期發(fā)育起到至關(guān)重要的作用(Tayloretal., 2009; Fujiharaetal., 2012; Huanetal., 2015; Robinsonetal., 2015)。但本實(shí)驗(yàn)也證明了，雖然Bmdnmt1在幼蟲時(shí)期表達(dá)量可能不高，但依然能調(diào)控幼蟲的生長。

為了解dnmt1在幼蟲期各組織的表達(dá)情況，本研究用Real-time PCR檢測(cè)了家蠶5齡幼蟲到化蛹前各組織中Bmdnmt1的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)家蠶Bmdnmt1在其5齡到化蛹時(shí)期各個(gè)組織均有不同程度的表達(dá)，在翅原基和脂肪體中以5齡初期含量較高，在表皮游走期較高，而中腸中則表達(dá)比較平穩(wěn)。因此，DNA甲基化并不是幼蟲期最低，但有組織的差別。同時(shí)Bmdnmt1在各組織都有表達(dá)，表明BmDNMT1對(duì)幼蟲期家蠶的各組織生長發(fā)育都有調(diào)控作用, 這與其他物種的報(bào)道相似。Robinson等人(2016)也驗(yàn)證了在蝗蟲中卵、成蟲頭部、神經(jīng)、卵巢和睪丸都存在Lmdnmt1、Lmdnmt2和Lmmbd2/3等基因的表達(dá)，其中卵巢和睪丸組織的表達(dá)量最高。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果從側(cè)面反映了dnmt1在昆蟲各組織及時(shí)期都存在表達(dá)，從而參與調(diào)控各時(shí)期各組織的生長發(fā)育。

鑒于斜紋夜蛾和家蠶在注射甲基化抑制劑后都出現(xiàn)發(fā)育不良等性狀，推測(cè)甲基化可能調(diào)控了昆蟲幼蟲期生長發(fā)育所必須的營養(yǎng)和能量代謝。為此首先采用Real-time PCR檢測(cè)了一些與能量代謝相關(guān)的基因，主要包括脂肪和甾醇類代謝相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)在脂肪代謝通路占重要地位的脂肪酶(lipase)和乙酰輔酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA binding protein)有不同程度的表達(dá)下調(diào)。脂肪酶廣泛存在于動(dòng)植物中，它在生物體中發(fā)揮水解、底物結(jié)合以及輔助因子等作用，對(duì)于脂類消化、吸收、運(yùn)輸及新陳代謝起著關(guān)鍵作用。在昆蟲中，脂肪體是昆蟲貯存能源的主要組織，脂肪酶廣泛存在于動(dòng)物脂肪體中，通過催化甘油三酯水解成游離脂肪酸和甘油，在經(jīng)過進(jìn)一步的生化反應(yīng)為生物的其他生理活動(dòng)提供能量(Brabcováetal.，2013; Wangetal.，2016)。雖然乙酰輔酶A結(jié)合蛋白(acyl-CoA binding protein)的研究比較少，但也在脂類代謝通路中起作用(Ohnishietal., 2005)。因此推測(cè)甲基化抑制劑處理后的家蠶發(fā)育受阻的其中一個(gè)原因，可能是家蠶體內(nèi)脂質(zhì)代謝通路受阻，導(dǎo)致能量供應(yīng)不足，機(jī)體生理生化反應(yīng)滯后或減弱所致。而甲基化抑制劑處理后，甲基化含量減少反而減少基因的表達(dá)已有不少報(bào)道(Xiangetal.，2010)，但脂肪酶下調(diào)的具體機(jī)制仍還需要進(jìn)一步的深入研究。同時(shí)，甲基化調(diào)控昆蟲幼蟲的除脂肪代謝外的其他途徑也待進(jìn)一步研究。

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Methyltransferase may involve in regulating the larval growth ofSpodopteralituraandBombxymori

XU Guan-Feng, ZHENG Si-Chun*

(Guangzhou Key Laboratory of Insect Development Regulation and Application Research, School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

DNA methylation plays a role in eukaryotes growth and development. In this study, the function of DNA methylation in larval growth of Lepidoptera pest,Spodopteralitura, and model insect,Bombxymori, was studied. The results showed that the abnormal larvae, which became smaller, of methylation inhibitor (5-Aza-dC)-treatedS.lituraandB.moriwere increased 36% and 58.8% comparing to un-treated larvae, respectively; the RNAi ofS.lituramethyltransferaseDnmt1 reveal the similar result as 5-Aza-dC treatment, the abnormal larvae was increased 35%. qRT-PCR analysis demonstrated the expression ofBmdnmt1 in wing disc, fat body, epidermis and midgut during larval stage, and the highest expression level was found in wing disc ; besides, in wing disc and fat body, theBmdnmt1 mRNA level in early fifth instar was higher than in prepupa. The mRNA levels of lipase and acyl-CoA binding protein, which belonged to lipid metabolism pathway, were analyzed in 5-Aza-dC-treatedB.morilarvae using qRT-PCR and showed that the expression of both genes were inhibited by 5-Aza-dC. All data together suggest that DNA methylation involves in the regulation of Lepidoptera larvae growth, lipid metabolism may be one of pathways regulated by DNA methylation.

DNA Methyltransferase; function;Spodopteralitura;Bombxymori; larvae

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2012CB114603)

徐關(guān)峰，男，1991年生，碩士研究生，研究方向?yàn)槔ハx分子生物學(xué)，E-mail: 1473220308@qq.com

*通訊作者Author for correspondence, E-mail: sczheng62@126.com

Received: 2016-08-12; 接受日期Accepted: 2016-09-19

Q963;S433.4

A

1674-0858(2017)02-0372-10

徐關(guān)峰，鄭思春.DNA甲基轉(zhuǎn)移酶參與調(diào)控斜紋夜蛾和家蠶幼蟲的生長[J].環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2017,39(2):372-381.