胡海燕 劉迪秋 李允靜 李 陽 涂禮莉

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一個(gè)棉花纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子pGhFLA1的克隆與鑒定

胡海燕 劉迪秋 李允靜 李 陽 涂禮莉*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢430070

棉花纖維是研究單細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的良好模式細(xì)胞, 尋找在棉花纖維發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 對(duì)于棉花纖維發(fā)育的功能基因組研究非常重要。本試驗(yàn)對(duì)發(fā)掘到的一個(gè)在纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因的啟動(dòng)子進(jìn)行克隆, 并將該啟動(dòng)子融合GUS轉(zhuǎn)化棉花和煙草。轉(zhuǎn)基因棉花的GUS蛋白染色表明, 在0~20 DPA (days post anthesis)的纖維中檢測(cè)到GUS蛋白, 同時(shí)在柱頭、雄蕊、萼片、胚根、子葉和根中也檢測(cè)到GUS蛋白, 但在花瓣、葉片和苞葉中沒有檢測(cè)到。同時(shí)GUS定量檢測(cè)結(jié)果顯示, pGhFLA1驅(qū)動(dòng)GUS蛋白積累的高峰是在20 DPA的纖維中, 其驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的能力是CaMV 35S::GUS的22倍。轉(zhuǎn)基因煙草組織化學(xué)染色顯示pGhFLA1可以驅(qū)動(dòng)GUS在葉片及葉片的表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 同時(shí)在子房、柱頭、花藥、苞葉、花柄基部、花瓣、種子等生殖器官上也存在GUS蛋白。啟動(dòng)子pGhFLA1在棉花纖維和煙草葉片的表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 可用于棉花纖維功能基因組研究, 在改良纖維品質(zhì)育種中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

棉花(L.);; 啟動(dòng)子; 纖維

棉花纖維是由胚珠表皮細(xì)胞突起發(fā)育而來。從開花當(dāng)天開始, 棉花纖維經(jīng)歷啟始、伸長(zhǎng)、次生壁增厚和脫水成熟相互重疊的4個(gè)階段, 最后發(fā)育成一個(gè)長(zhǎng)達(dá)3 cm左右, 次生壁中纖維素含量達(dá)90%以上的纖維細(xì)胞[1]。因此棉花纖維細(xì)胞是研究植物單細(xì)胞發(fā)育及纖維素沉積的良好材料。目前, 棉花的基因工程中普遍使用的是組成型CaMV 35S啟動(dòng)子, 使用組成型啟動(dòng)子存在諸多缺點(diǎn), 例如CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的目的基因在受體植物各個(gè)組織中持續(xù)且恒定的表達(dá)會(huì)過度消耗能量; 在受體不表達(dá)的部位表達(dá)目的基因會(huì)使植株的形態(tài)改變, 不能達(dá)到預(yù)期目的[2]。因此分離鑒定棉花纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 無論是在棉花纖維發(fā)育機(jī)制解析還是在分子育種中都具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

目前已經(jīng)克隆了一些棉花纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子, 其中最早克隆出來的棉花纖維優(yōu)勢(shì)啟動(dòng)子E6表達(dá)高峰在開花后5~28 DPA (days post anthesis), 而在其他組織中不表達(dá)[3]。FbL2A啟動(dòng)子在20 DPA纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 活性約為35S啟動(dòng)子的1/3[4]。棉花纖維發(fā)育相關(guān)的脂轉(zhuǎn)移蛋白基因(、和)的啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)GUS在煙草表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 但是這幾個(gè)啟動(dòng)子的啟動(dòng)能力很弱, 其中基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性僅為CaMV 35S啟動(dòng)子的1/1000左右[5-9]。棉花纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子pGbEXPA2在棉花纖維伸長(zhǎng)期和擬南芥的表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[10]。CFSP啟動(dòng)子可以在逆境條件下啟動(dòng)基因在纖維發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)[11]。pGhSCFP在煙草外種皮優(yōu)勢(shì)表達(dá), 在轉(zhuǎn)化棉花突起的纖維細(xì)胞特別是伸長(zhǎng)期纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[12]。啟動(dòng)子GbPDF1-1能夠驅(qū)動(dòng)GUS在0~5 DPA胚珠和纖維細(xì)胞中表達(dá)[13]。一些外源啟動(dòng)子也能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在棉花的種皮和纖維細(xì)胞中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。Luo等[14]發(fā)現(xiàn)矮牽?；虻膯?dòng)子pFBP7在煙草中具有種皮表達(dá)特異性, 并在–1~10 DPA的棉花胚珠和纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。以來源于擬南芥的BAN啟動(dòng)子融合GUS轉(zhuǎn)化棉花, 其0 DPA的胚珠表面纖維細(xì)胞或非纖維細(xì)胞中都有較強(qiáng)的GUS信號(hào), 5 DPA的胚珠GUS活性最強(qiáng), 且在30 DPA的纖維中仍能檢測(cè)到GUS的表達(dá)[15-16]。

Liu等[17]在20 DPA的纖維SSH cDNA文庫(kù)中發(fā)掘到一個(gè)在陸地棉纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因, 并對(duì)進(jìn)行qRT-PCR與Northern雜交表達(dá)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),在下胚軸中有微量的表達(dá), 在纖維發(fā)育的不同時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá), 且在15 d時(shí)纖維中表達(dá)量最高, 而在根、葉片、花中沒有表達(dá)。在海島棉和陸地棉之間的表達(dá)模式比較相似, 但前者表達(dá)強(qiáng)于后者[18]。前人已經(jīng)克隆及驗(yàn)證了一些在棉花纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 但是這些啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS的能力較CaMV 35S弱很多。本研究克隆并驗(yàn)證了的啟動(dòng)子pGhFLA1 (promoter-)在棉花和煙草中的表達(dá)模式, 旨在探索棉花纖維發(fā)育各個(gè)時(shí)期驅(qū)動(dòng)GUS的能力和優(yōu)勢(shì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、時(shí)間和地點(diǎn)

于2010年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田進(jìn)行田間試驗(yàn), 在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行室內(nèi)試驗(yàn)。受體作物為陸地棉YZ-1 ()和煙草(L.)。

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

通過Genome-walking的方法擴(kuò)增得到基因的啟動(dòng)子序列并進(jìn)行PCR。PCR產(chǎn)物經(jīng)過TA克隆連接到T載體上, 測(cè)序后進(jìn)行順式元件分析。對(duì)已經(jīng)克隆到的啟動(dòng)子pGhFLA1構(gòu)建植物表達(dá)載體, 并在引物上游和下游分別添加d III和H I酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基, p-FLA-S: 5￠-GCAAAG CTTTCTATAGCATGGAGCTAGGTGGT-3￠; p-FLA- A: 5￠-GCAGGATCCGTCTTTTGGTTTGTGTTGGAA AGG-3￠。將PCR產(chǎn)物純化后用d III和H I酶切, 經(jīng)T4連接酶連接到本實(shí)驗(yàn)室改造的啟動(dòng)子載體PBI121上。將構(gòu)建好的啟動(dòng)子載體pBI-PGhFLA1轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌菌株EHA105中。

1.3 棉花與煙草的遺傳轉(zhuǎn)化

以pGhFLA::GUS和CaMV 35S::GUS轉(zhuǎn)化陸地棉YZ-1, 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化法[19]。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法以PGhFLA:: GUS轉(zhuǎn)化煙草。用75%乙醇或無菌水浸泡煙草種子30 s, 0.1%升汞浸泡10 min, 無菌水沖洗3~5次, 每次1 min, 將無菌的種子放在1/2 MS培養(yǎng)基上, 于25℃下培養(yǎng)直至煙草的葉片生長(zhǎng)到適合轉(zhuǎn)化的時(shí)期。

取煙草葉片于無菌平皿上, 用無菌剪刀將煙草葉片剪切成約1 cm2的小片, 接種到MGL懸浮的農(nóng)桿菌菌液中, 侵染5~10 min后將葉片放到鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上, 21℃暗培養(yǎng)3 d, 轉(zhuǎn)到篩選培養(yǎng)基上(含50 mg L–1的卡那霉素, 400 mg L–1的頭孢霉素)培養(yǎng)并篩選2次, 將煙草苗移植到土壤中。

1.4 轉(zhuǎn)基因植株DNA的提取及Southern驗(yàn)證

取轉(zhuǎn)基因植株的幼嫩葉片0.2~0.3 g, 并用植物基因組提取試劑盒DP305 (北京天根)提取基因組DNA。取10 μg轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA, 用d III酶切48 h后, 凝膠電泳檢測(cè)DNA是否被徹底酶切。將徹底酶切后的DNA混合適量溴酚藍(lán), 并用0.8%的0.5×TBE瓊脂糖凝膠, 于0.5×TBE電泳緩沖液中, 250 V高壓電泳10 min, 接著電壓調(diào)至40 V繼續(xù)電泳12~14 h。將電泳后的膠條上的溴酚藍(lán)和點(diǎn)樣孔之間的凝膠小心整齊地切下; 隨后酸變性10 min, 堿變性20 min, 堿轉(zhuǎn)移液處理15 min。然后用堿轉(zhuǎn)移液作為轉(zhuǎn)移緩沖液轉(zhuǎn)膜約36 h, 用2×SSC漂洗膜2次(各5 min), 80℃真空烘膜2 h以上固定DNA。

先將尼龍膜用2×SSC漂洗后裝入雜交管, 加入65℃預(yù)熱的預(yù)雜交液10 mL, 趕除氣泡后置于65℃空氣恒溫雜交爐上預(yù)雜交6 h。將標(biāo)記好的探針沸水變性10 min, 冰浴10 min后一起加入雜交管, 65℃空氣恒溫雜交爐上雜交18 h以上。用低嚴(yán)謹(jǐn)?shù)南茨ひ篒先熱洗10 min, 再洗5~10 min之后, 將膜平攤于濾紙上吸干表面水分, 用保鮮膜包裹, 平鋪在磷屏上(Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan)過夜, 用FLA-5000 Plate/ Fluorescent Image Analyzer (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)掃描磷屏成像。

1.5 GUS組織化學(xué)染色及活性測(cè)定

將轉(zhuǎn)基因植株的不同器官、組織放到GUS染色液中, 37℃保溫2 h至過夜, 經(jīng)70%酒精脫色后FAA固定液中保存, 肉眼或在體式顯微鏡下觀察GUS基因表達(dá)情況, 然后在體式顯微鏡(Leika MZFLIII)下照相。GUS染色液成分為X-gluc 90 mg、氯霉素10.0 mg、0.1 mol L–1磷酸鈉緩沖液(pH 7.0) 50 mL、甲醇20% (v/v), 補(bǔ)足無菌水至100 mL。

采用Jefferson等[20]報(bào)道的方法定量檢測(cè)GUS。在1 mL離心管中加入400 μL GUS蛋白提取緩沖液、100 μg GUS蛋白、10 μL 40 mmol L–14-MUG, 37℃反應(yīng)1 h后加入1.6 mL反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。以50 nmol L–1的4-MU為標(biāo)準(zhǔn), 在激發(fā)光365 nm發(fā)射光455 nm條件下測(cè)定標(biāo)樣吸光值。以pmol 4-MU μg–1min–1表示GUS活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGhFLA1的序列分析

采用Genome-walking的方法從陸地棉中克隆到了長(zhǎng)961 bp的pGhFLA1啟動(dòng)子序列, 利用啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)網(wǎng)站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/)進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子有4個(gè)CAAT BOX和4個(gè)TATA BOX。同時(shí)檢測(cè)到多個(gè)光響應(yīng)和激素響應(yīng)位點(diǎn), 如脫落酸、茉莉酸等(圖1)。

方框中為CAAT BOX; 橢圓中為TATA BOX; 紅色下畫線表示茉莉酸響應(yīng)位點(diǎn); 綠色下畫線表示光響應(yīng)位點(diǎn); 藍(lán)色下畫線表示脫落酸響應(yīng)位點(diǎn)。

Square box indicates CAAT BOX, oval indicates TATA BOX, red underline indicates JA responsive elements, green underline indicates light responsive elements, blue underline indicates ABA responsive element.

2.2 啟動(dòng)子pGhFLA1在棉花各個(gè)組織中的表達(dá)模式

是一個(gè)在纖維伸長(zhǎng)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因。通過Southern驗(yàn)證2個(gè)獨(dú)立的pGhFLA1::GUS轉(zhuǎn)化株系的拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn), 其中一個(gè)是單拷貝, 一個(gè)多拷貝(圖2)。

從田間的陽性株系上取不同時(shí)期的胚珠、纖維、葉片、苞葉及花組織, 及萌發(fā)1 d的胚和萌發(fā)7 d的下胚軸和根進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色表明, 纖維整個(gè)發(fā)育時(shí)期(0~25 DPA)及剛萌發(fā)的子葉、幼嫩的根尖、雌雄蕊和根中都檢測(cè)到GUS蛋白, 但在花瓣、葉片、苞葉中沒有檢測(cè)到GUS蛋白(圖3)。為了驗(yàn)證該啟動(dòng)子在纖維發(fā)育不同時(shí)期驅(qū)動(dòng)GUS能力的強(qiáng)弱, 分別定量測(cè)定5 DPA (纖維/胚珠), 10、15、20和25 DPA的纖維組織的GUS活性。結(jié)果表明啟動(dòng)子pGhFLA1在5~25 DPA的纖維中都有表達(dá), 但是在10 DPA的表達(dá)量最低, 在20 DPA的表達(dá)量達(dá)到一個(gè)峰值, 達(dá)到34 938.04 pmol4-MU μg–1min–1(圖4)。所以可以確定pGhFLA1是一個(gè)伸長(zhǎng)期及次生壁增厚轉(zhuǎn)換時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子。

為了與最常用的CaMV 35S啟動(dòng)子進(jìn)行對(duì)比,我們從CaMV 35S::GUS轉(zhuǎn)化棉花的轉(zhuǎn)基因純系植株上同時(shí)取5 DPA (纖維/胚珠), 10、15、20和25 DPA的纖維進(jìn)行GUS活性定量檢測(cè), 發(fā)現(xiàn)在20 DPA pGhFLA1::GUS的活性是CaMV 35S::GUS的22倍(圖5)。

M: marker; 1, 2: 不同的轉(zhuǎn)化事件。

M: marker; 1, 2: two different transgenic cotton lines.

A: 0 DPA; B: 1 DPA; C: 3 DPA; D: 10 DPA; E: 10 DPA胚珠; F: 15 DPA胚珠; G: 20 DPA胚珠; H: 20 DPA; I: 25 DPA; J: 25 DPA胚珠; K: 葉片; L: 根; M: 胚; N: 下胚軸; O: 苞葉; P: 花瓣; Q: 萼片; R: 雌雄蕊。

A: 0 DPA; B: 1 DPA; C: 3 DPA; D: 10 DPA; E: 10 DPA ovules; F: 15 DPA ovules; G: 20 DPA ovules; H: 20 DPA; I: 25 DPA; J: 25 DPA ovules; K: leaf; L: root; M: embryo; N: hypocotyl; O: bract; P: petal; Q: sepal; R: pistil and stamen.

2.3pGhFLA1在煙草中的表達(dá)

以pGhFLA1::GUS轉(zhuǎn)化煙草, 取陽性植株的不同組織進(jìn)行GUS染色表明GUS蛋白表達(dá)主要集中在子房、柱頭、雌蕊、花藥、苞葉、花柄基部、花瓣、種子等生殖器官。值得注意的是在葉片及葉片的表皮毛上染色尤其明顯, 表明pGhFLA1可能在這些部位驅(qū)動(dòng)GUS優(yōu)勢(shì)表達(dá)(圖6)。

3 討論

傳統(tǒng)的育種方法對(duì)棉花產(chǎn)量潛力的挖掘和纖維品質(zhì)的提高在近年來進(jìn)展不大, 生物技術(shù)的快速發(fā)展及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用為作物育種和生產(chǎn)提供了新途徑?；蚬δ茯?yàn)證和轉(zhuǎn)基因育種除了對(duì)目標(biāo)基因有要求, 啟動(dòng)子也是一個(gè)不可忽視的方面。在研究棉花纖維發(fā)育機(jī)制過程中, 傳統(tǒng)的CaMV 35S啟動(dòng)子所驅(qū)動(dòng)的基因表達(dá)系統(tǒng), 不能排除基因?qū)χ仓暾w發(fā)育的影響從而影響纖維生長(zhǎng)發(fā)育。雖然已經(jīng)有大量的內(nèi)源及外源的啟動(dòng)子在纖維不同發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá), 但是真正在基因工程中驗(yàn)證能被使用的卻為數(shù)不多, 因此研究和開發(fā)在纖維發(fā)育時(shí)期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子勢(shì)在必行。

A: 子房; B: 柱頭; C: 雄蕊; D和F: 花柄; E: 葉柄; G和I: 苞葉; H: 花瓣; J: 種子; K和L: 葉片; M和N: 表皮毛。

A: ovary; B: stigma; C: stamen; D and F: peduncle; E: petiole; G and I: bract; H: petal; J: seed; K and L: leaf; M and N: epidermal.

棉花轉(zhuǎn)化有一定的難度, 許多研究者認(rèn)為棉花纖維的發(fā)育可能與煙草和擬南芥的表皮毛發(fā)育存在相似性[21], 因此很多研究用煙草和擬南芥來驗(yàn)證棉花啟動(dòng)子的表達(dá)模式。在已有的報(bào)道中, 將棉花纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因的啟動(dòng)子在煙草和擬南芥中異源表達(dá)后, 能夠驅(qū)動(dòng)GUS在表皮毛或根中優(yōu)勢(shì)表達(dá)。如以棉花脂轉(zhuǎn)移蛋白基因的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草后只在煙草表皮毛中表達(dá)[8], 棉花可逆糖基化多肽基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草, 在生長(zhǎng)4周的植株的根中表達(dá)量最高[22]。棉花葡糖醛酸基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草后, 在煙草的根冠、種皮、花粉粒和表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá)[23]。纖維素合酶基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草, 在煙草的表皮毛和葉脈中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 同時(shí)也在下胚軸和莖的維管組織中表達(dá)[24]。RING-type泛素連接酶(E3)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化擬南芥, 在葉、根、表皮毛、花藥、柱頭等部位表達(dá)[25]。啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化棉花, 其在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 同時(shí)也在表皮毛、葉片、苞葉、莖等組織表達(dá), 轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥表明其在表皮毛中特異表達(dá)[26]。本研究同時(shí)將pGhFLA1::GUS轉(zhuǎn)化了棉花和煙草, 棉花染色結(jié)果表明該啟動(dòng)子不僅在纖維發(fā)育各個(gè)時(shí)期表達(dá), 同時(shí)在幼嫩的根尖、雌雄蕊及根中都有表達(dá)。煙草的染色結(jié)果表明除了在表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 在花的各個(gè)組織中都檢測(cè)到GUS蛋白的存在。說明棉花與煙草的染色結(jié)果存在一致性, 所以用煙草或擬南芥驗(yàn)證棉花啟動(dòng)子的表達(dá)模式有一定的可行性。

基因啟動(dòng)子是重要的基因表達(dá)調(diào)控元件, 決定了基因的轉(zhuǎn)錄方向、轉(zhuǎn)錄效率以及轉(zhuǎn)錄的時(shí)空特性[27]。運(yùn)用基因工程手段對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行遺傳改良, 賦予農(nóng)作物一些新性狀, 需要外源基因在受體內(nèi)以高度受控方式表達(dá), 因此對(duì)啟動(dòng)子的表達(dá)特性提出了很多新要求。例如要求啟動(dòng)子能接受外部信號(hào)刺激, 引導(dǎo)基因在特定器官組織和細(xì)胞類型的特定發(fā)育階段表達(dá), 這對(duì)于外源基因能否在特定的組織優(yōu)勢(shì)高效表達(dá)至關(guān)重要[29-31]。啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明, pGhFLA1上存在一些光信號(hào)及激素響應(yīng)位點(diǎn), Huang等[32]研究發(fā)現(xiàn)可能受到激素的調(diào)控從而影響纖維的伸長(zhǎng), 因此啟動(dòng)子預(yù)測(cè)對(duì)于基因功能的研究具一定指導(dǎo)作用。

已經(jīng)報(bào)道的啟動(dòng)子中有很大一部分啟動(dòng)能力很弱, 其中有一個(gè)棉花泛素相關(guān)啟動(dòng)子uceA1.7在花組織里面的表達(dá)量是CaMV 35S的7倍之多[33]。pGhFLA1::GUS的組織化學(xué)染色結(jié)果顯示, pGhFLA1可以驅(qū)動(dòng)目的基因在纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 且表達(dá)高峰在15~25 DPA, 在20DPA為CaMV 35S的22倍之多。因此, pGhFLA1是纖維發(fā)育的高效優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 在纖維伸長(zhǎng)與次生壁增厚轉(zhuǎn)換時(shí)期其啟動(dòng)能力強(qiáng)于CaMV 35S, 并且可以用于提高基因在纖維伸長(zhǎng)與次生壁增厚轉(zhuǎn)換時(shí)期的表達(dá)。

4 結(jié)論

棉花啟動(dòng)子pGhFLA1是一個(gè)纖維優(yōu)勢(shì)表達(dá)的啟動(dòng)子, 在棉花纖維發(fā)育的伸長(zhǎng)及次生壁增厚的轉(zhuǎn)換時(shí)期及煙草表皮毛中優(yōu)勢(shì)表達(dá), 并且在20DPA驅(qū)動(dòng)GUS表達(dá)的能力是CaMV 35S的22倍, 可作為棉花纖維功能基因組研究的優(yōu)良啟動(dòng)子和運(yùn)用于未來的棉花分子育種。

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Identification of Promoter GhFLA1 Preferentially Expressed during Cotton fiber Elongation

HU Hai-Yan, LIU Di-Qiu, LI Yun-Jing, LI Yang, and TU Li-Li*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China

Cotton (L.) fiber is a perfect model cell for studying cell initiation and growth, so it is critical to find new promoters specifically or preferentially expressed in fiber for functional genomics of fiber and improvement of cotton fiber yield and quality. We found a genewith very high expression level in fiber elongation stage and cloned its promoter (pGhFLA1). pGhFLA1::GUS was transferred into cotton YZ1 () and tobacco () to identify its expression pattern in different plant tissues. GUS activity in transgenic plant was obviously detected in fiber from 0 DPA (days post anthesis) to 20 DPA, also in stamens, pistils, sepal, radicle, cotyledon and root, but not in petal, leaf and bract. Quantitative analysis of GUS activity showed that GUS expression level driven by pGhFLA1 was the highest in 20 DPA fiber and 22-fold higher than that in CaMV 35S. In transgenic tobacco, GUS activity was detected in leaf and trichome and reproductive organs like ovary, stigma, anther, bract, petal and seed. In general, the promoter pGhFLA1 fusion with GUS highly expresses in cotton fiber and tobacco trichome, which could be used in fiber functional genomics research and improvement of cotton fiber quality.

Cotton (L.);; Promoter; Fiber

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31071465)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31071465).

(收稿日期): 2016-08-08; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期):2017-02-17.

10.3724/SP.J.1006.2017.00849

(Corresponding author): 涂禮莉, E-mail: lilitu@mail.hzau.edu.cn, Tel: 027-87283955

E-mail: yanhai0987@163.com

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1009.016.html