巴根那 包明蘭 白梅榮 何那拉 佟玉風(fēng) 葉日貴
(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)
實(shí)驗(yàn)研究
蒙藥地格達(dá)-4味湯在D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清移行成分的LC-MSDTrap分析Δ
巴根那 包明蘭*白梅榮 何那拉 佟玉風(fēng) 葉日貴
(內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)
目的:分析蒙藥地格達(dá)-4味湯在D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清移行成分。方法:以地格達(dá)-4味湯水提物為示例藥物、以D-GlaN致急性肝損傷大鼠為研究對象,應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用儀和核磁共振儀對急性肝損傷大鼠灌胃給藥地格達(dá)-4味湯后的血清中移行成分進(jìn)行LC-MSDTrap分析。結(jié)果:灌胃給藥地格達(dá)-4味湯后,在以D-GlaN致急性肝損傷大鼠血清中供檢測到9個移行成分,其中4個移行成分為地格達(dá)-4味湯原型成分,即,4-O-β-glucopyranosylacetophenone、草夾竹桃苷、獐牙菜苦苷、Sweroside;5個移行成分為代謝產(chǎn)物。結(jié)論:所建立的測定方法比較全面、系統(tǒng)地分析地格達(dá)-4味湯血中移行成分,為揭示地格達(dá)-4味湯抗急性肝損傷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)。
蒙藥地格達(dá)-4味湯;急性肝損傷;血清;移行成分;LC-MSDTrap分析
蒙藥地格達(dá)-4味湯始載于《診治明醫(yī)典》,1998年被載入《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·蒙藥分冊》是蒙醫(yī)臨床常用于清熱、保肝、利膽的復(fù)方制劑。本復(fù)方由肋柱花、胡黃連、梔子、瞿麥等4味藥材組成,具有清血熱、分解精華與糟粨等功效。主要用于血熱相搏、肝膽熱、咽喉腫痛,口渴干燥等多種病癥[1]。目前,地格達(dá)-4味湯的研究主要集中在保肝藥理作用及獐牙菜苦苷、胡黃連苷II及梔子苷等主要化學(xué)成分的動態(tài)變化方面[2-4],而地格達(dá)-4味湯保肝藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未清楚。
藥物起作用的前提是必須被吸收入血。因此,本文從藥物的臨床應(yīng)用為切入點(diǎn),分析地格達(dá)-4味湯在D-GIaN致急性肝損傷大鼠(病態(tài)))血清中的移行成分,為后續(xù)探討地格達(dá)-4味湯體內(nèi)直接作用物質(zhì)與藥效相關(guān)性研究提供基本信息數(shù)據(jù),為揭示地格達(dá)-4味湯保肝作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。
1.1 儀器:Agilent 1100 series LC-MSD液質(zhì)聯(lián)用儀(Agilent SL型多級離子阱質(zhì)譜儀,低壓四元梯度泵,二級管陳列檢測器(DAD),chemistation化學(xué)工作站);KQ-200VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山);NA-5L氮?dú)饪諝庖惑w機(jī);TD4-I型離心機(jī)(長沙);AUW120D型分析天平(上海);固相萃取小柱-WAT094226? Waters OAsis HLB 3cc/60mg,30um(上海)。
1.2 藥品與試劑:地格達(dá)-4味湯自制(肋柱花采自扎魯特旗自然保護(hù)區(qū)特金罕山,經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院布和巴特爾教授鑒定,是龍膽科植肋柱花Lomatogonium carinthiacum (Wulf) Reichb.的干燥全草;胡黃連、梔子、瞿麥:內(nèi)蒙古通遼市澤強(qiáng)醫(yī)藥有限公司提供)。D-GlaN(批號58461)由美國,Sigma公司提供。色譜2甲醇,甲酸。
1.3 實(shí)驗(yàn)動物:取Wistar大鼠,SPF級,雄性,許可證號碼:SCXK(吉)-2011-0004:長春市億斯實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。
2.1 色譜條件:色譜柱:VenusilMPC18(4.6*300mm,5μm);流動相A為0.1%甲酸水溶液,流動相B為甲醇,梯度洗脫(0~10min,10~20%B;10~20min,20~40%B;20~40min,40~60%B;40~60min,60~75%B;60~80min,75~85%B;80~90min,85~10%B);流速:1.0mL·min-1;檢測波長:280nm;柱溫:35℃;進(jìn)樣量:30μL。
2.2 質(zhì)譜條件:ESI電離源:電噴霧離子源;檢測模式:正離子掃描;掃描范圍:m/z50~800;干燥氣溫度:350℃;干燥氣流量:9.0mL·min-1;霧化氣壓強(qiáng):35.0psi(1psi=6.895kpa);毛細(xì)管電壓:4kv。
3.1 D-GlaN致急性肝損傷模型的復(fù)制:取20只大鼠,體重220±10g,按體重隨機(jī)分為空白組、模型組,每組10只,模型組按400mg·kg-1劑量腹腔注射D-GlaN生理鹽水染毒造模,空白組灌胃等量生理鹽水,禁食不禁水21h后,從腹主動脈取血,3000r·min-1離心10min,取上清液,檢測ALT、AST血清指標(biāo)[5],結(jié)果見表1。
表1 D-GlaN致急性肝損傷模型血清ALT、AST 含量的影響
注:與空白組比較*P<0.05;
3.2 含地格達(dá)-4味湯血清樣品的制備:取30只大鼠,體重220±10g,按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物組,每組10只,模型組與藥物組按“3.1”方法水染毒造模,造模成功后,藥物組按1.44g·kg-1(按提取率換算)劑量灌胃地格達(dá)-4味湯水提物,空白組灌胃等量生理鹽水,給藥45min后,從腹主動脈取血,3000r·min-1離心10min,取上清液,備用。
3.3 含地格達(dá)-4味湯血清樣品的處理:分別精密吸取含地格達(dá)-4味湯組血清、空白組血清和模型組血清各500μL,用20μL85%的磷酸酸化后加入活化(2mL甲醇、2mL水)的HLB固相萃取柱,分別以2mL水、2mL10%甲醇和3mL70%甲醇洗脫,棄去前兩段洗脫液,收集70%的甲醇洗脫液,氮?dú)獍l(fā)生儀上吹干樣品[6]。用200μL甲醇溶解,過0.22μm微孔濾膜,制備相應(yīng)的含地格達(dá)-4味湯組血清、空白組血清和模型組血清樣品,備用。
3.4 地格達(dá)-4味湯血清中移行成分的LC-MSDTrap分析:精密吸取含地格達(dá)-4味湯組、空白組和模型組血清樣品溶液各30μL,按“2”分析條件進(jìn)行檢測。記錄相應(yīng)的總離子圖和二級質(zhì)譜圖,結(jié)果見表2和圖1~10。
表2 地格達(dá)-4味湯血清中移行成分的正離子 掃描模式的質(zhì)譜分析結(jié)果
圖2 1號移行成分的結(jié)構(gòu) 圖3 2號移行成分的結(jié)構(gòu)
圖4 3號移行成分的結(jié)構(gòu) 圖5 4號移行成分的結(jié)構(gòu)
圖6 5號移行成分的結(jié)構(gòu) 圖7 6號移行成分的結(jié)構(gòu)
圖8 7號移行成分的結(jié)構(gòu) 圖9 8號移行成分的結(jié)構(gòu)
圖10 9號移行成分的結(jié)構(gòu)
4.1 D-GlaN致急性肝損傷模型血清ALT、AST含量:與正常組比較,模型組的血清ALT、AST活性明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示模型復(fù)制成功。
4.2 地格達(dá)-4味湯血清中移行成分的LC-MSDTrap分析結(jié)果:應(yīng)用LC-MS分析含地格達(dá)-4味湯組、空白組和模型組血清樣品,比較了質(zhì)譜檢測方式,發(fā)現(xiàn)在正離子模式下,質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng),并且峰容量更大,故選擇ESI正離子模式。
鑒定過程在本次實(shí)驗(yàn)色譜條件下,含地格達(dá)-4味湯血清中共檢測到13個移行成分峰,除了空白組和模型組血清固有移行成分以外,含地格達(dá)-4味湯血清中與藥物有關(guān)的有9個移行成分,其中4個移行成分是地格達(dá)-4味湯原型成分、5個移行成分是體內(nèi)產(chǎn)生的代謝物(圖1)。對這些移行成分首先精確計(jì)算出ESI-MS上所得化合物的分子質(zhì)量,初步鑒定其化學(xué)成分[7-10]。然后,選擇合適的分子離子峰進(jìn)行裂解,通過二級質(zhì)譜裂解方式,獲得與化合物結(jié)構(gòu)相關(guān)的碎片離子,再對比其他碎片信息,結(jié)合紫外吸收波長、分子質(zhì)量、碎片離子峰、保留時(shí)間等參數(shù),進(jìn)一步推斷5個代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu);根據(jù)1H-NMR、13C-NMR及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)據(jù)確定4個原型成分的結(jié)構(gòu)(表2和圖2-10)。
以獐牙菜苦苷為例。首先,通過該峰的準(zhǔn)分子離子峰m/z397.5,可確定其目標(biāo)分子量為374.1,根據(jù)m/z397.5的二級質(zhì)譜裂解圖進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)所得二級質(zhì)譜圖(圖11)中有明顯的m/z379.3[M+ Na-OH]+、217.1[M+Na-OH-C6H10O5]+、255.1[M+Na-OH-C6H4O3]+、165.1[M+Na-OH-C6H4O3-C7H10O3]+等碎片離子信息,從而推斷出其裂解途徑(圖12)。結(jié)合保留時(shí)間、紫外吸收波長、碎片離子等參數(shù),最終確定該峰為獐牙菜苦苷。采用類似的方法,對其他移行成分也進(jìn)行相應(yīng)的鑒定。
圖1 含地格達(dá)-4味湯組(A)、模型組(B)及 空白組(C)血清總離子流圖
圖11 獐牙菜苦苷二級質(zhì)譜圖
圖12 獐牙菜苦苷裂解途徑
藥物口服后,多數(shù)所含成分不能被吸收,只有部分成分被吸收進(jìn)入體內(nèi),而進(jìn)入體內(nèi)的成分既可能以原型,也可能以代謝物的形式發(fā)揮作用。真正起作用的是吸收入血的成分,即血清中的移行成分。另外,由于蒙藥成分較復(fù)雜,有些成分在肝臟的Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶的作用下生物轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物后才能更具有較強(qiáng)的生理活性。因此,從含地格達(dá)-4味湯血清中分析得到的以上9個血中移行成分可能是地格達(dá)-4味湯化學(xué)成分的體內(nèi)作用形式,它們最有可能成為地格達(dá)-4味湯的抗急性肝損傷藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。但被吸收入血的成分不一定都是有效成分,所以血中移行成分的活性與地格達(dá)-4味湯臨床療效的相關(guān)性,還有待進(jìn)一步研究。
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2016年12月15日收稿
LC-MSD Trap Analyze the transitional components of Mongolian medicine Digeda-4 in serum of acute liver injury of rats induced by D-GIaN ba-genna Bao-minglan*bai-meirong he-nala tong-yufeng ye-rigui
(College of Mongolian Medicine and Pharmacology,Inner Mongolian
University for Nationalities,Tongliao,Inner Mongolia 028000,China)
Objective:To analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in serum after administration of stomach.Methods:With extract is an example of drugs to D-GlaN induced acute liver injury in rats as the research object,The application of LC-MS and NMR on acute liver injury in rats after intragastric administration of LC-MSD Trap placeality analysis of transitional components of -4 Decoction in the serum.Results:After administration of stomach for the Digeda-4,The nine transitional elements were detected in rat serum,four transitional elements were the Digeda-4denoction's prototype components that 4-O-β-glucopyranosyl,Phlox glycosides,Swertia bitter glycosides,Sweroside,5 transitional components were metabolites.Conclusion:The established method could comprehensively systematically analyze the transitional elements of Digeda-4 denoction in blood,to reveal to Digeda-4 decoction provide a scientific basis for anti-liver injury in acute pharmacodynamic material basis.
Mongolian medicine Digeda-4 decoction;acute liver injury;serum;the analyze of transitional elements:LC-MSD Trap Analysis
國家自然基金項(xiàng)目(81360673)
巴根那(1960-)男,教授,博士,博士生導(dǎo)師,研究方向:蒙藥新藥開發(fā)研究,bagenna@126.com;
*通訊作者:包明蘭(1979-)女,副教授,博士,研究方向:方劑作用機(jī)理研究,baominglan@126.com
R291.2
A
1006-6810(2017)04-0046-04