朱智德++羅宇東++蔣林++譚安薔

[摘要] 目的 研究瑤藥扶芳藤乙醇、正丁醇提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304缺氧損傷的作用影響。 方法 體外培養(yǎng)ECV-304細(xì)胞，MTT法測(cè)定扶芳藤提取物細(xì)胞毒性，以Na2S2O4誘導(dǎo)ECV-304細(xì)胞缺氧損傷模型，分別將扶芳藤乙醇、正丁醇提取物作用于細(xì)胞24 h后，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；收集細(xì)胞上清液，檢測(cè)LDH露出率；臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞死亡率。 結(jié)果 扶芳藤乙醇和正丁醇提取物濃度為25～400 μg/mL，對(duì)ECV-304細(xì)胞均無細(xì)胞毒作用；與模型對(duì)照組比較，扶芳藤乙醇（濃度50 μg/mL）、正丁醇（濃度50、100、200 μg/mL）提取物對(duì)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞存活率有顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。與模型對(duì)照組比較，扶芳藤正丁醇提取物（濃度100 μg/mL）能明顯降低缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率，（P < 0.05）；與模型對(duì)照組比較，扶芳藤正丁醇提取物（濃度50、100、200 μg/L）能抑制缺氧損傷細(xì)胞ECV-304凋亡（P < 0.01）。 結(jié)論 扶芳藤提取物對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷有一定保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 扶芳藤；血管內(nèi)皮細(xì)胞；缺氧損傷

[中圖分類號(hào)] R28 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）04（a）-0026-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of ethanol and butanol extract of Yao medicine Euonymus fortunei on ECV-304 hypoxia injury of vascular endothelial cells. Methods ECV-304 cells were cultured in vitro， and the cytotoxicity of Euonymus fortunei extract was determined by MTT. ECV-304 cells hypoxia injury model was induced by Na2S2O4， respectively Euonymus fortunei ethanol and n-butanol extracts from cells after 24 h， the survival rate of cells was detected by MTT. The cell supernatant was collected for detection of LDH， the cell apoptosis rate was detected by trypan blue staining. Results Euonymus fortunei ethanol and n-butanol extract was in 25-400 μg/mL concentration range， which was no cytotoxic effect on ECV-304 cells. Compared with the model group， the ECV-304 cells survival rate of Euonymus fortunei （ethanol concentration of 50 μg/mL）， n-butanol （concentration of 50， 100， 200 μg/mL） extract on hypoxia injury was significantly increased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with the model group， the ECV-304 cells LDH exposed rate of Euonymus fortunei n-butanol extract （concentration of 100 μg/mL） was significantly decreased （P < 0.05）. Compared with the model group， the ECV-304 cells apoptosis rate of Euonymus fortunei n-butanol extract （concentration of 50， 100 and 200 μg/mL） was inhibited （P < 0.01）. Conclusion The extract of Euonymus fortunei has protective effect on Na2S2O4 induced hypoxia injury of vascular endothelial cells.

[Key words] Euonymus fortune； Vascular endothelial cells； Hypoxia Injury

血管內(nèi)皮細(xì)胞是連續(xù)被覆在全身血管內(nèi)膜的一層細(xì)胞群，其在血管生成、止血、創(chuàng)傷修復(fù)等病理和生理過程中起著重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷與多種心血管疾?。ㄈ鐒?dòng)脈粥樣硬化、高血壓、血栓形成等）有密切的關(guān)系，從整體、細(xì)胞、分子水平研究對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用的藥物，對(duì)心血管疾病的防治研究具有重要意義?，F(xiàn)代研究表明，活血化瘀類中藥及其有效成分能從多個(gè)方面保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷和促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖，從而為中藥治療血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損相關(guān)性疾病提供了藥理學(xué)依據(jù)[1-5]。

扶芳藤Euonymus fortunei （Turcz.） Hand.-Mazz.為衛(wèi)矛科植物爬行衛(wèi)矛的地上部分，廣西瑤、壯族特色藥材，其性微溫，味甘、苦、微辛，具補(bǔ)肝腎、止血消瘀、舒筋活絡(luò)功效，民間主要用于腰肌勞損、風(fēng)濕痹痛、咯血、血崩、月經(jīng)不調(diào)、跌打骨折、創(chuàng)傷出血等；現(xiàn)代藥理研究表明，扶芳藤具有抗腫瘤、止血、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)腦組織和心血管等作用[6-16]；

本試驗(yàn)研究扶芳藤提取物對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用影響，從血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)角度探討扶芳藤抗心血管病的作用機(jī)制，為扶芳藤及其中藥復(fù)方的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

扶芳藤乙醇、正丁醇提取物的制備：扶芳藤藥材（廣西玉林同康藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20150601）1000 g切成粗段，置于中試型多能提取器中，加入50%乙醇回流提取2次，50%乙醇體積為第一次10 000 mL，第二次8000 mL，每次提取2 h，將提取液用濾紙抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，濾液濃縮成稠膏（相對(duì)密度約1.10），即得乙醇提取物，備用。

另取扶芳藤藥材100 g，打成細(xì)粉，加4倍量的正丁醇（即400 mL）進(jìn)行索氏提取，提取液用濾紙抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收溶劑后減壓干燥，得到扶芳藤正丁醇提取物，備用。

以上扶芳藤乙醇、正丁醇提取物浸膏，每克膏分別相當(dāng)于25.5、779.4 g的藥材量。由廣西中醫(yī)藥大學(xué)制藥廠提供。

1.2 試劑

RPMI1640培養(yǎng)基（gibco公司）；胎牛血清（HyClone）；胰蛋白酶（Solarbio）；雙抗（gibco公司）；SOD試劑盒（批號(hào)：20150110，南京建成生物工程研究所）、NO試劑盒（批號(hào)：20150105，南京建成生物工程研究所）、NOS試劑盒（批號(hào)：20150110，南京建成生物工程研究所）；四氮唑藍(lán)MTT（SIGMA）；H2O2（批號(hào)：141021，南國(guó)藥業(yè)），Hochest染料（碧云天），乙醇（分析醇，批號(hào)：20151010R），正丁醇（分析醇，上海申博化工有限公司，批號(hào)：0607101）。

1.3 儀器

倒置顯微鏡（LEICA DMIRB）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo）；超凈工作臺(tái)（荷蘭ClearAir公司）；離心機(jī)（德國(guó)Biofuge Stoctos 公司）；連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海科華實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司，ST360）；中試型多能提取器（武漢制藥機(jī)械設(shè)備公司設(shè)備制造廠），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52A，上海亞榮生化儀器廠），多能數(shù)顯恒溫水油汽鍋（鞏義市予華儀器有限公司），真空干燥箱（ZK-82A，上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠）。

1.4 藥物配制

分別稱取扶芳藤乙醇、正丁醇提取物浸膏0.1218、0.1330 g，溶解于1 mL DMSO溶液中，獲得121.8、133 mg/mL母液，于4℃保存，正式試驗(yàn)以母液稀釋成所需的濃度，控制DMSO的終濃度在0.05%以內(nèi)。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304細(xì)胞株購(gòu)于（廣州吉妮歐生物科技有限公司），培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗1%的RPMI1640培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)[17-19]。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 扶芳藤各提取部位對(duì)正常ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞以1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、扶芳藤乙醇提取物5個(gè)濃度組、正丁醇提取物5個(gè)濃度組，5個(gè)濃度組終濃度為25、50、100、200、400 μg/mL，每組4個(gè)復(fù)孔。正常對(duì)照組加培養(yǎng)基，各藥物組加相應(yīng)終濃度的藥物，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.6.2 扶芳藤各提取部位對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞以5000 個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每孔100 μL，于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層后，實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組（Na2 S2O4終濃度為10 mmol/L）、扶芳藤乙醇、正丁醇提取物均設(shè)3個(gè)濃度組別（終濃度為50、100、200 μg/mL）。除正常對(duì)照組，其余各組均加終濃度為10 mmol/L Na2S2O4作用細(xì)胞1 h，造成細(xì)胞缺氧損傷，然后去掉上清液，PBS洗2次，模型對(duì)照組加入培養(yǎng)基，藥物組加入相應(yīng)濃度藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率。

1.6.3 扶芳藤各提取部位對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率的影響 細(xì)胞處理方法見“1.6.1”，待藥物處理24 h后，收集上清液，按試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞上清LDH含量。

1.6.4 臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞死亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞以20 000個(gè)/孔，的密度接種于24孔板中，用藥處理后（方法同“1.6.1”），分別收集細(xì)胞懸液，用PBS洗2次，最后將細(xì)胞制成懸液，取細(xì)胞懸液9滴加0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液1滴混勻，3 min內(nèi)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)藍(lán)染的死細(xì)胞和拒染的活細(xì)胞共20個(gè)，細(xì)胞死亡率（%）=死細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 扶芳藤各提取部位對(duì)正常ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響

扶芳藤乙醇、正丁醇提取物組在25～400 μg/mL濃度范圍內(nèi)對(duì)正常ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)無影響，與正常對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 扶芳藤提取物對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)情況的影響

從表2提示，模型對(duì)照組、扶芳藤乙醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）OD值與正常對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示造模成功；而扶芳藤乙醇提取物組（濃度為50 μg/mL）、正丁醇（濃度為50、100、200 μg/mL）提取物組對(duì)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞存活率有顯著提高，OD值與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.3 扶芳藤各提取部位對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率的影響

模型對(duì)照組、扶芳藤乙醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）LDH露出率與正常對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示造模成功；而扶芳藤正丁醇提取物組（100 μg/mL）能明顯降低缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率，LDH露出率與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

2.4 扶芳藤提取物對(duì)ECV-304細(xì)胞缺氧損傷死亡率的影響

模型對(duì)照組、扶芳藤乙醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）、扶芳藤正丁醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）凋亡率與正常對(duì)照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示造模成功；扶芳藤正丁醇提取物組（濃度為50、100、200 μg/mL）能抑制缺氧損傷細(xì)胞ECV-304凋亡，凋亡率與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

3 討論

血管內(nèi)皮功能缺失或受損是導(dǎo)致多種心血管疾病發(fā)生和發(fā)展的早期征兆，在血管新生、止血與血栓、輻射損傷、免疫及炎性反應(yīng)等一系列重要的病理生理過程起著重要的作用。慢性缺氧是心腦血管疾病中常見的一個(gè)病理性刺激，首先作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞異常分泌多種生物活性物質(zhì)，進(jìn)而引起內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞損傷在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中也有重要的始動(dòng)作用。而心血管疾病是世界上發(fā)病率和凋亡率最高的疾病之一，所以對(duì)內(nèi)皮功能和結(jié)構(gòu)受損的研究并探求有效的干預(yù)措施，對(duì)心血管疾病的治療學(xué)發(fā)展有非常重要的意義[1-5]。

衛(wèi)矛屬植物是一類重要的天然藥用資源，在世界各地均有分布，在我國(guó)民間作為藥物使用有著悠久的歷史，主要用于抗腫瘤、抗炎、抗菌等[20]。扶芳藤為衛(wèi)矛科植物扶芳藤Euonymus hederaceus Champ.Ex Benth的根、樹皮或葉，為廣西壯族、瑤族地區(qū)的民間常用藥材，主要用于治療腎虛腰痛、慢性腹瀉、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等，臨床應(yīng)用廣泛。國(guó)內(nèi)對(duì)扶芳藤的藥理研究已經(jīng)取得了一定的成果，表明其具有抑菌、抗凝血、活血化瘀、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗疲勞、免疫增強(qiáng)等作用[6-10]。冠心病屬于中醫(yī)心痛、胸痹范疇，病位在心，病機(jī)多為本虛標(biāo)實(shí)，臨床論治多采用益氣活血行氣化痰、通陽(yáng)開痹等方法。近年來，扶芳藤臨床上多用于治療心腦血管疾病，臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究已經(jīng)表明，扶芳藤對(duì)心腦血管缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用，扶芳藤可通過清除氧自由基抑制了脂質(zhì)體的氧化，抑制腦組織中IL-1β和TNF-α的含量從而對(duì)心肌缺血再灌注或急性腦缺血再灌注損傷起到了保護(hù)作用[11-13]。

扶芳藤主要含有衛(wèi)矛醇、三萜類、黃酮類、木脂素、類倍半萜吡啶生物堿類、糖醇類等化學(xué)成分[8-10]；課題組前期對(duì)扶芳藤所含化學(xué)成分進(jìn)行純化檢識(shí)及含量測(cè)定研究表明，扶芳藤50%乙醇提取物主要含生物堿、衛(wèi)矛醇、黃酮等成分，扶芳藤正丁醇提取物則含三萜皂苷類成分。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶芳藤乙醇、正丁醇提取物對(duì)正常ECV-304細(xì)胞生長(zhǎng)無影響，各試藥組OD值與正常對(duì)照組比較無顯著差異，但乙醇提取物對(duì)ECV-304細(xì)胞存活率影響呈“鐘罩型”的趨勢(shì)，這或許與乙醇提取物中所含衛(wèi)矛醇成分具有清除氧自由基抑制脂質(zhì)體的氧化，從而促進(jìn)正常ECV-304細(xì)胞的生長(zhǎng)有關(guān)；扶芳藤乙醇、正丁醇提取物對(duì)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞存活率有顯著提高，提示扶芳藤乙醇或正丁醇提取物對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷均有一定的保護(hù)作用，這或許是其臨床用于活血化瘀，治療心血管疾病的機(jī)制之一。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，扶芳藤正丁醇提取物與乙醇提取物比較，在提高缺氧損傷ECV-304細(xì)胞存活率方面作用更為明顯，且能明顯降低缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率，并能抑制缺氧損傷細(xì)胞ECV-304凋亡，而乙醇提取物對(duì)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞上清LDH露出率和凋亡均無影響，提示扶芳藤中三萜皂苷類成分或許為保護(hù)缺氧損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞的主要成分之一，而乙醇提取物中所含成分較多，多種物質(zhì)的綜合效應(yīng)使之對(duì)缺氧損傷ECV-304細(xì)胞的存活率，上清LDH露出率和凋亡作用不顯著?，F(xiàn)代研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞能合成和分泌多種血管活性物質(zhì)如NO、ET等，NO對(duì)血管有擴(kuò)張作用，ET對(duì)血管有收縮作用，正常情況下二者保持動(dòng)態(tài)平衡，NO的作用略占優(yōu)勢(shì)以保持血管壁的平滑和血流的通暢，內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時(shí)，NO和ET之間的動(dòng)態(tài)平衡受到破壞，NO生成量下降，ET 表達(dá)量增加導(dǎo)致微血管痙攣并阻塞血流[18-22]。另外，至少有30多種生長(zhǎng)因子與的血管生成有關(guān)，而最直接的促血管生成因子是血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，而細(xì)胞凋亡與其相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2和caspase-3表達(dá)相關(guān)，扶芳藤提取物對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)使用是否為影響血管活性物質(zhì)、生長(zhǎng)因長(zhǎng)的生成及凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)，還有待進(jìn)一步的研究。

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（收稿日期：2016-11-22 本文編輯：李岳澤）