柴弋霞　蔡夢穎　金曉玲　張冬林

摘要： 紫花含笑（Michelia crassipes）花色艷麗、花香濃郁，為解釋其在自然條件下結(jié)實率低的原因和判斷最佳雜交時期，該研究從傳粉生物學(xué)入手，通過觀察紫花含笑開花動態(tài)，運用異交指數(shù)（OCI）、花粉胚珠比（P/O）、花粉和柱頭活性、人工授粉試驗等方法對其繁育系統(tǒng)進行了檢測，并記錄訪花昆蟲的種類和行為。結(jié)果表明：（1）紫花含笑花期在4—5月，持續(xù)50 d左右，單花花期4～5 d。（2）雌雄同花，雌蕊先成熟，雄蕊空間位置高于雌蕊。（3）OCI等于4，P/O為2671±123。（4）套袋實驗表明紫花含笑能進行少量的自花傳粉，人工異花授粉結(jié)實率和種子質(zhì)量顯著高于人工自花授粉和自然條件下，且不存在無融合生殖。（5）開花后36 h雌蕊群彎曲分泌粘液時，與含笑（M. figo）雜交結(jié)實率最高達85.7%，為最佳授粉時期。（6）有效訪花者主要有東方蜜蜂、黑紋食蚜蠅和獨角仙，訪花頻率易受天氣影響。綜上說明，紫花含笑繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和需要傳粉者，存在一定近交衰退，自然條件下結(jié)實率低，主要受傳粉昆蟲和雌雄異熟限制，最佳授粉期的確定能夠提高其雜交成功率。該研究結(jié)果為紫花含笑資源保護和雜交育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 紫花含笑， 繁育系統(tǒng)， 傳粉生物學(xué)， 雜交育種， 木蘭科

中圖分類號： Q949.9

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）10132208

傳粉是植物進行有性生殖的必經(jīng)階段，一般是指花粉借助一定的載體，經(jīng)過一定的空間，從雄性結(jié)構(gòu)傳送到柱頭，繼而萌發(fā)的過程，與植物結(jié)實密切相關(guān)。傳粉生物學(xué)是研究與傳粉有關(guān)的各項生物學(xué)規(guī)律的一門學(xué)科，主要包括對植物開花物候、繁育系統(tǒng)、花各部位特征、訪問者種類及頻率的研究。因此，植物傳粉生物學(xué)的研究是開展植物育種的前提，關(guān)系到植物本身的遺傳育種特點、種子生產(chǎn)方法和栽培管理技術(shù)等重要內(nèi)容，更是植物資源保護和雜交育種的理論基礎(chǔ)（羅曉瑩等，2011）。但迄今為止，僅有少數(shù)學(xué)者對木蘭科瀕危植物傳粉生物學(xué)進行了研究，如王潔（2012）揭示了凹葉厚樸雌雄異熟和異位、花粉受精前障礙是導(dǎo)致其結(jié)實率低的主要原因；孫燕（2015）和賴家業(yè)等（2007）研究表明光葉木蘭和單性木蘭瀕危原因是受傳粉昆蟲限制，花粉生活力低且柱頭可授性時間短。

紫花含笑（Michelia crassipes）為木蘭科（Magnoliaceae）含笑屬（Michelia）常綠灌木或小喬木。零星分布于廣東北部、湖南南部、廣西東北部以及江西，自然資源稀缺（劉玉壺，2004）。因其花色艷麗、花香濃郁，具有較高的觀賞價值，所以多次被用來作為木蘭科雜交育種的優(yōu)良親本（龔洵等，2003；李穎婕等，2013；邵文豪等2015，2015，2016）。然而，紫花含笑在自然條件下結(jié)實率低，種子質(zhì)量差，嚴重制約了種群繁衍。目前，關(guān)于紫花含笑的研究主要集中在形態(tài)特征、生理特性（方小平等，2010）、遺傳背景（溫強，2014）和雜交育種（龔洵等，2001；王亞玲等，2003）等方面，但未有從傳粉生物學(xué)角度結(jié)合其對結(jié)實率和雜交育種的影響進行探討。因此，紫花含笑傳粉生物學(xué)特征是否與自然結(jié)實率低有密切關(guān)系，最佳授粉期確定是否能提高雜交成功率均值得深入研究。本研究以紫花含笑為對象開展傳粉生物學(xué)研究，揭示紫花含笑自然條件下結(jié)實率低的原因和判斷最佳雜交時期，為其資源保護和雜交育種提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

在湖南省林業(yè)廳林場（113°2′45.89″ E，28°6′56.32″ N， 112 m），選擇8年生半自然狀態(tài)的、長勢良好的紫花含笑，大量片植于山頂和零星散植山坡的東南面。該地位于長沙市南郊，屬于亞熱帶季風氣候，年平均氣溫16.8 ℃，年平均降雨量1 422.4 mm，酸性土壤。林場面積達13.3 hm2，四周保留原有的香樟自然林帶，植被290余種，主要伴生樹種有樟科、木蘭科、山茶科、薔薇科、杜鵑科、殼斗科、金縷梅科、竹類等。

1.2 方法

1.2.1開花動態(tài)的觀察在2015—2016年每年的4—5月，開花前隨機標記大小相似的植株20株，依據(jù)Dafni（1992）的方法記錄開花過程；盛花期隨機標記20朵花蕾，觀察并記錄開花動態(tài)，計算單花花期。

1.2.2 柱頭可授性和花粉活力檢測參考吉利等（2011）對紫花含笑的花粉萌發(fā)研究方法，采用蔗糖150 g·L1+300 mg·L1 HBO3+300 mg·L1 CaCl2培養(yǎng)基，將不同開花狀態(tài)的花粉置于25 ℃培養(yǎng)8 h，每個處理3個重復(fù)，各取5個視野在Nikon YS100光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計花粉萌發(fā)率。

采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法對五種狀態(tài)下花朵的柱頭可授性進行測定，以產(chǎn)生氣泡的數(shù)量、速度和被染色的深淺來判斷柱頭的活性。

1.2.3 繁育系統(tǒng)測定

1.2.3.1 異交指數(shù)（Outcrossing index， OCI）的估算盛花期隨機選擇21朵花，按照Dafni的標準測量花部特征（包括花朵直徑，雌雄蕊成熟時間間隔，柱頭與花藥的空間間隔）。

1.2.3.2 花粉胚珠比（Pollenovule ration， P/O）的估算隨機選取9朵未散粉花朵，將雄蕊取下分別裝于潔凈的小瓶中，待花粉管全部裂開加入10 mL蒸餾水，磁力攪拌器下振蕩5 min制成花粉懸浮液，取1 μL滴于載玻片上，在Nikon YS100光學(xué)顯微鏡下統(tǒng)計全部花粉數(shù)，每一處理重復(fù)5次求得平均值。同時將子房壁用解剖刀切開，在光學(xué)顯微鏡下先統(tǒng)計每個子房胚珠數(shù)，再計算單朵花胚珠數(shù)平均值，最后計算P/O。

1.2.3.3 人工授粉實驗（1）在2015—2016年盛花期，選取花蕾狀態(tài)的紫花含笑進行套袋，人工授粉。處理方式：①不去雄，不套袋，檢測自然條件下是否結(jié)實；②去雄，套袋，檢測是否存在無融合生殖；③不去雄，套袋，檢測是否能自動自花授粉；④去雄，套袋，人工自花授粉；⑤去雄，套袋，人工異花授粉。（2）以紫花含笑為母本，含笑為父本，選取五個開花狀態(tài)下紫花含笑為母本，分別與含笑進行雜交實驗。以上每處理21朵花，3個重復(fù)。每隔10 d觀察1次，果實成熟后統(tǒng)計座果率、結(jié)籽率和千粒重三項指標。座果率=果實總數(shù)/各處理個數(shù)；結(jié)籽率=果實中種子數(shù)/胚珠總數(shù)。

1.2.4 訪花昆蟲行為和訪花頻率的觀測在紫花含笑盛花期隨機選取21株植株，每天從8：00—18：00，每小時觀測訪花者種類、停留時間和訪花行為。收集訪花昆蟲帶回實驗室制成標本鑒定，并同時記錄天氣情況。統(tǒng)計各訪花者單位時間內(nèi)訪花次數(shù)，分析一天中不同昆蟲的訪花規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007軟件進行統(tǒng)計及圖表繪制，用SPSS 19.0軟件對花粉活力、坐果率、結(jié)籽率及千粒重進行單因素方差（Oneway ANOVA）分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。

2結(jié)果與分析

2.1 開花動態(tài)

紫花含笑種群花期在4—5月，持續(xù)時間為50 d左右。始花期在4月初，在4月下旬達到盛花期，5月下旬為謝花期（表1）。從花期降雨頻率觀測結(jié)果來看，紫花含笑花期內(nèi)降雨頻率較高，達46.2%。

紫花含笑單花花期4～5 d，開花前花蕾被苞片包裹（A）；苞片開裂，露出紫色的花被片，雄蕊緊靠柱頭（B）；36 h后，花被片逐漸打開，雄蕊離開柱頭，雌蕊群彎曲成一定角度，并分泌粘液（C）；48～60 h后花被片張開，雄蕊群開始散粉，雌蕊群逐漸收攏（D）；4～5 d后花被片水平張開甚至脫落，雄蕊枯萎脫落，雌蕊群靠近柱頭，柱頭授粉成功后呈褐色（E）。

2.2 花粉活力與柱頭可授性

紫花含笑為雌蕊先熟，各階段的花粉生活力與柱頭可授性具有顯著差異（表2）。開花初期雌雄蕊的活性極低，開花后36 h左右柱頭活性達到最高，處于最佳授粉期（狀態(tài)三）。開花后第48～60 h（狀態(tài)四），雄蕊開始散粉，花粉活力達到最高，柱頭活性逐漸下降。開花第4～5天后（狀態(tài)五），花粉和柱頭活力均較低。

2.3 繁育系統(tǒng)

2.3.1異交指數(shù)（OCI）紫花含笑的花朵直徑為（28.5 ± 2.0） mm，N=21，花為兩性花，雌蕊先成熟，雄蕊高于雌蕊，花朵螺旋狀著生在枝上。異交指數(shù)OCI=4，根據(jù)Dafin的標準，其繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，異交需要傳粉者。

2.3.2 花粉胚珠比（P/O）紫花含笑單花花粉量較大，為（160 260 ± 246）（N=21），每心皮具有2枚胚珠（圖1：F），胚珠總數(shù)為（60 ± 2）（N=21）枚，平均胚珠比P/O為（2 671±123）（在2 108～195 525之間）。根據(jù)Cruden（1997）的標準，判定其繁育系統(tǒng)為專性異交。

2.3.3 人工授粉實驗授粉實驗結(jié)果表明：各處理紫花含笑坐果率存在顯著差異（P=0.000<0.001）。其中人工異交授粉處理的坐果率最高，達（80.95±1.67）%，人工自花授粉次之。直接套袋自交坐果率低，表明紫花含笑能進行少量的自發(fā)傳粉。去雄套袋后無結(jié)籽，表明不存在無融合生殖。人工異交種子的千粒重和結(jié)籽率表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。以上結(jié)果表明紫花含笑繁育系統(tǒng)為部分自交親和，有時需要傳粉者，人工異花授粉能夠提高結(jié)實率。

選取不同狀態(tài)下紫花含笑與含笑進行雜交實驗，在狀態(tài)三柱頭活力最高時進行雜交（表5），其坐果率（85.7%）和結(jié)籽率（88.23%）顯著高于其他時期（P<0.05），為最佳授粉期。

2.4 訪花昆蟲及行為觀測

根據(jù)引種栽培地觀測可知，紫花含笑的傳粉昆蟲主要有4種，其中大型的東方蜜蜂（Apis cerana）和黑紋食蚜蠅（Episyrphus balteatus）通過花朵頂部或花瓣間隙進入花朵內(nèi)取食花粉，停留2～3 min后，在群落中飛行，將花粉帶到另一朵花內(nèi)進行授粉（圖2：A，B）；甲蟲類的獨角仙（Allomyrina dichotoma）進入花朵內(nèi)，通過觸角、口器等攜帶花粉在柱頭上自上而下的授粉，停留時間長且多宿住在花朵內(nèi)（圖2：C）；德國小蠊類（Blattlla germanica）主要在花朵內(nèi)活動或鄰近的花朵間，通過身體移動帶走花粉，停留時間在30 min以上，但其最大的危害是啃食花瓣和葉片，傳粉作用差（圖2：D）。

一天中訪花頻率較高主要集中在上午11：00—12：00和下午14：00—15：00，受溫度和光照的影響，訪花頻率出現(xiàn)雙峰值（圖3）。東方蜜蜂和獨角仙訪問頻率較高，黑紋食蚜蠅的訪問頻率次之，德國小蠊類傳粉效率最差。

3討論與結(jié)論

3.1 紫花含笑開花物候?qū)鞣鄣挠绊?/p>

開花物候期是植物生命活動中一個重要的時期，能夠影響植物的傳粉效率和結(jié)實率。張愛勤等（2011）的研究中發(fā)現(xiàn)，因苜?；ㄆ谂c昆蟲活動不遇，而導(dǎo)致苜蓿種子產(chǎn)量極低。本研究中紫花含笑的花期為4月中旬至5月底，此時有大量昆蟲開始活動。但紫花含笑的花瓣在雌蕊成熟前未完全打開，不利于昆蟲進入，且有效傳粉昆蟲種類少，傳粉效率低。此外，劉芬等（2013）認為，天氣影響植物傳粉，陰雨天氣降低了昆蟲訪花的頻率，從而降低了異交的可能性。紫花含笑花期在春夏季，易出現(xiàn)連續(xù)的雷雨天氣，不利于昆蟲傳粉，導(dǎo)致結(jié)實率低。昆蟲的訪問頻率和行為決定了其傳粉效率。紫花含笑4種傳粉昆蟲中，東方蜜蜂、黑紋食蚜蠅和獨角仙是有效傳粉者，而德國小蠊類傳粉作用差。 但東

方蜜蜂的訪問頻率受溫度和光照影響，且在花間停留時間短。黑紋食蚜蠅的訪問頻率低，獨角仙雖訪問頻率高，但其活動范圍小。這與孫燕（2015）對光葉木蘭的傳粉昆蟲研究結(jié)果相同。因此，紫花含笑坐果率低主要外因是受天氣影響和有效傳粉者少，訪問頻率低。

3.2 紫花含笑繁育系統(tǒng)特征

植物繁育系統(tǒng)是受內(nèi)部遺傳機制和外部環(huán)境條

件共同相互作用，在決定植物有性繁殖和遺傳進化方向上，起著重要作用。植物繁育系統(tǒng)的檢測常通過OCI、P/O值和控制授粉的方法。本研究中紫花含笑OCI為4， 結(jié)合人工授粉實驗表明繁育系統(tǒng)類型為部分自交親和，異交需要傳粉者。而根據(jù)P/O值得到紫花含笑為專性異交，結(jié)果與前兩者不完全一致。原因是P/O值的測定具有簡單易行的特點，但缺乏準確性，有些自花授粉的植物P/O值顯著高于Cruden的標準或與異花授粉植物P/O值重疊，其較高的P/O值是為了補償雄蕊開裂后掉落所影響的雄性功能（吳佩紋等，2016）。同時較大的花粉量，可以彌補在自然條件下傳粉效率低的弊端，是使其適應(yīng)環(huán)境從而保證生殖成功的有效對策，李志成等（2015）研究發(fā)現(xiàn)在艾比湖沙拐棗也有這一現(xiàn)象。由此推斷紫花含笑的繁育系統(tǒng)為異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。殷東生等（2016）認為判斷有性生殖能力的重要標準是結(jié)實率的高低。授粉實驗表明，紫花含笑不存在無融合生殖。不去雄套袋處理有少量結(jié)實，說明紫花含笑具備自花授粉的能力?；ǘ涞穆菪隣钪绞剑约靶廴锫愿哂谥^，使自花授粉存在可能。雄蕊成熟時，在重力作用下花粉會落在柱頭上，加上風力影響使得自花授粉更加容易，但由于雌雄蕊成熟時間存在差異，導(dǎo)致自花授粉結(jié)實率較低。自然條件下的結(jié)實率遠高于套袋處理，說明紫花含笑需要依靠傳粉者完成授粉。自然條件下結(jié)實率顯著低于人工授粉，說明自然條件下紫花含笑結(jié)實率存在花粉限制，這與對傳粉昆蟲的研究結(jié)果一致。人工異交授粉結(jié)實率和種子質(zhì)量顯著高于人工自花授粉，表明紫花含笑具有一定的近交衰退。綜上，紫花含笑繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者。

3.3 紫花含笑傳粉生物學(xué)對雜交育種的意義

傳粉生物學(xué)的研究，關(guān)系到植物遺傳和進化，對有性繁殖和育種具有重要意義（彭東輝等，2012）。植物繁育系統(tǒng)有多種適應(yīng)方式來保證異株異花受精，如：雌雄異位、雌雄異熟以及自交不親和等。根據(jù)阮成江和姜國斌（2006）對雌雄異位的劃分，紫花含笑屬于柱頭縮入式雌雄異位，即雌雄蕊的成熟存在一定的空間和時間距離。研究證明這是植物促進異交、避免自交的策略，是其長期進化的一種繁殖機制。因此這是紫花含笑結(jié)實率低的主要內(nèi)因，但能為紫花含笑的人工雜交育種提供有利的條件。植物的授粉時間與種子的形成和其質(zhì)量有關(guān)，如Hanson（1961）、Strickler（1996）指出苜蓿授粉時間與種子形成有關(guān)，單花在開放的第2天被授粉，每莢果內(nèi)種子千粒重最大，這可能與柱頭活力有關(guān)。本研究中不同開花狀態(tài)下紫花含笑與含笑雜交，在開花后2～3 d（狀態(tài)三），坐果率最高在85%以上，且高于王亞玲等的雜交研究結(jié)果（60%），確定為最佳授粉期。這表明最佳授粉期的確定有利于提高雜交育種的成功率，為今后紫花含笑雜交育種提供參考。

綜上所述，有效傳粉者的缺乏和雌雄蕊的空間及時間異位且存在一定近交衰退共同影響紫花含笑自然結(jié)實率。其中，雌雄性器官空間分離和成熟時間的不遇及一定近交衰退是主要內(nèi)因，缺乏有效傳粉者是重要外因。其繁育系統(tǒng)以異交為主，部分自交親和，需要傳粉者；在最佳可授期雜交能夠有效提高雜交成功率。在今后的研究中，可以根據(jù)紫花含笑傳粉生物學(xué)的特點開展更近一步的雜交育種工作，豐富含笑屬植物種類。

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