洪青梅 胡文斌 李洪立 汪琴琴 何云 濮文輝 李瓊

摘 要 以紅皮紅肉型火龍果品種‘金都一號(hào)莖段為材料，開(kāi)展火龍果外植體選擇方式、外植體最佳消毒處理方式、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)等組織培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明：火龍果外植體最好選擇無(wú)病害健壯的近成熟莖；火龍果外植體最佳處理方式為不去刺座，75%酒精快速消毒30 s，0.1%升汞消毒10 min，最后無(wú)菌水沖洗5～8次；火龍果的最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，誘導(dǎo)率為80%。

關(guān)鍵詞 火龍果；外植體；消毒方式；不定芽誘導(dǎo)

中圖分類(lèi)號(hào) Q949.759.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract This study used red-flesh dragon fruit variety-“Jindu No.1”stem as the material， to research the best way of explant selection， explant disinfection treatment， adventitious bud induction in the pitaya tissue culture experiment. The results showed that pitaya explant had better choose healthy and robust nearly mature stem； and the most suitable disinfection treatment for pitaya stem segments was keeping thorn and followed by rinsing in 75% alcohol for 30 s， then rinsed 0.1% mercuric chloride disinfection for 10 min， and finally rinsed with sterile water 5-8 times. The best culture medium for adventitious bud induction of pitaya was MS+4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA， and induction rate was 80%.

Key words pitaya； explant； disinfection； adventitious bud induction

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.020

火龍果（Hylocereus undatusBritt. & Rose）又名紅龍果、青龍果、仙蜜果等，屬仙人掌科（Cactaceae）多年生攀緣植物，是一種原產(chǎn)于墨西哥南部及中美洲諸國(guó)的太平洋沿岸地區(qū)的熱帶果樹(shù)，也是在熱帶亞熱帶地區(qū)國(guó)家發(fā)展起來(lái)的具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值以及觀(guān)賞價(jià)值的新興熱帶亞熱帶果樹(shù)[1-10]?；瘕埞?qiáng)、易栽培、耐旱耐貧瘠，而且高產(chǎn)，能夠迅速為種植者帶來(lái)很好的效益，對(duì)調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民收人、滿(mǎn)足人們的物質(zhì)需求有著重要意義。

目前火龍果種苗主要通過(guò)扦插和嫁接技術(shù)進(jìn)行繁殖，但是，利用組織培養(yǎng)技術(shù)可以大量快速地保存優(yōu)良火龍果種質(zhì)，獲得優(yōu)質(zhì)的無(wú)菌苗，同時(shí)可在較短時(shí)間和較小空間內(nèi)獲得火龍果的無(wú)性系組培苗。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃青峰等[11]開(kāi)展了火龍果去除和不去除刺座組織培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)研究，黃紅梅等[12]開(kāi)展了火龍果愈傷組織誘導(dǎo)途徑相關(guān)研究，楊紅超等[13]以紅皮紅肉火龍果帶腋芽莖段為外植體研究火龍果啟動(dòng)培養(yǎng)、增值培養(yǎng)、生根培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基；黃春華等[14]則開(kāi)展了“蜜寶”火龍果組培技術(shù)研究，獲得了蜜寶火龍果組培最適方案；彭思維等[15]開(kāi)展了完整火龍果組培再生體系的構(gòu)建研究等，獲得了火龍果組培苗；Hua等[16]則利用玉米素、IBA等激素建立了火龍果最優(yōu)的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)模式。

2015年，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所從臺(tái)灣引進(jìn)‘金都一號(hào)火龍果，為紅皮紅肉型火龍果，平均單果重400 g，可溶性固形物含量平均可達(dá)17%以上，深受消費(fèi)者喜愛(ài)；經(jīng)試種該品種有結(jié)果早、產(chǎn)量高、自花授粉結(jié)實(shí)率高的特點(diǎn)，適宜大面積推廣。目前，‘金都一號(hào)火龍果種苗市場(chǎng)需求旺盛，海南、廣東、廣西、云南等地都在大面積推廣種植該品種，優(yōu)質(zhì)種苗供不應(yīng)求。

本研究以‘金都一號(hào)火龍果品種為材料，開(kāi)展火龍果組培快繁技術(shù)研究。火龍果離體快繁技術(shù)主要包括2種途徑，分為不定芽再生途徑和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑，本研究指的是不定芽再生途徑，主要開(kāi)展以下研究：一是外植體選擇與處理方式，通過(guò)不同類(lèi)型外植體選擇、外植體刺座不同處理方式、外植體不同消毒滅菌處理方法，篩選出最佳的外植體類(lèi)型和最佳處理方式，減少火龍果外植體前期的褐化、污染現(xiàn)象；二是通過(guò)不同激素處理篩選出火龍果不定芽誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

紅皮紅肉火龍果品種：‘金都一號(hào)，取自海南儋州農(nóng)業(yè)部火龍果種質(zhì)資源保護(hù)海南創(chuàng)新基地。

1.2 方法

1.2.1 外植體的選取與處理方式 從莖段外植體類(lèi)型選擇、有/無(wú)保留刺座處的小刺和絨毛、不同滅菌消毒劑與消毒時(shí)間等方面開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究，統(tǒng)計(jì)外植體污染率和褐死率，獲得最佳方案。

取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的成熟老莖，先移植到室內(nèi)盆栽，待枝條長(zhǎng)出新的嫩枝后，分別剪取生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的火龍果近成熟莖段（能分化出幼嫩莖且不能分化出花芽的莖段）和幼嫩莖段。每種莖段做2個(gè)處理，一種為去除刺座上的刺及其絨毛，另一種則保留刺座，然后在洗衣粉或洗潔精溶液中用軟毛刷輕柔刷洗并用流水沖洗干凈，用0.2%～0.5%多菌靈泡洗30 min，最后用自來(lái)水沖洗干凈；沿著莖段棱緣縱切，切成寬為3 cm左右的棱片，再橫切成6～8 cm長(zhǎng)的小段，每段保留2～3個(gè)刺座，用75%的酒精快速消毒30 s，將莖段分別置于0.1%的升汞中消毒10 min，用無(wú)菌水沖洗5～8次，每次3 min；分別接種到無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶1個(gè)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，培養(yǎng)基為MS+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6 g/L），pH值為5.8。3 d后每隔2 d觀(guān)察統(tǒng)計(jì)污染、褐變和死亡的外植體數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)3次后計(jì)算外植體污染率和褐死率。

取同樣保留刺座的幼嫩莖和近成熟莖，經(jīng)過(guò)洗潔精、多菌靈等清洗后，切成同上大小的片段，用75%的酒精快速消毒30 s，然后將莖段分別置于0.1%的升汞和2%的次氯酸鈉溶液中浸泡消毒（每100 mL溶液加入1滴吐溫20），每個(gè)處理消毒時(shí)間設(shè)為8、10、12、15 min。消毒滅菌后，用無(wú)菌水沖洗5～8次，每次3 min；每個(gè)處理段接種10個(gè)，做3個(gè)重復(fù)，將消毒后的莖段切成2 cm左右長(zhǎng)的莖段，接種到同上無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基上，每瓶1個(gè)。3 d后每隔2 d觀(guān)察統(tǒng)計(jì)污染、褐變和死亡的外植體數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計(jì)3次后計(jì)算外植體污染率和褐死率。

1.2.2 不定芽的誘導(dǎo) 將篩選出來(lái)的無(wú)污染健康的外植體轉(zhuǎn)接到有激素的MS固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為MS+蔗糖（30 g/L）+卡拉膠（6 g/L），另加不同濃度的6-BA（6-芐氨基嘌呤）和NAA（萘乙酸），pH為5.8。6-BA濃度設(shè)2.0、4.0、6.0、8.0 mg/L共4個(gè)水平，NAA濃度設(shè)0.05、0.1、0.2 mg/L共3個(gè)水平；每個(gè)處理10瓶，每瓶1塊，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，接種后定期觀(guān)察芽苗生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)30～40 d，統(tǒng)計(jì)刺座不定芽的誘導(dǎo)率，篩選出最適不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)室溫度為（26±2）℃，每天光照14 h，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的選取與處理方式

2.1.1 刺座刺及其絨毛的有無(wú)對(duì)火龍果莖段消毒效果的影響 火龍果莖段表面光滑，消毒容易，但是刺座部位由于刺和絨毛的存在，容易導(dǎo)致消毒滅菌不徹底，特別容易引起真菌污染，在培養(yǎng)3 d后一般就可以看到污染的發(fā)生。從表1可知，用0.1%升汞溶液處理10 min時(shí)，無(wú)論是幼嫩莖還是近成熟莖，去除刺和絨毛后，其污染率都比保留刺和絨毛的低，但是幼嫩莖段不保留刺和絨毛時(shí)褐死率達(dá)到66.7%，近成熟莖段則達(dá)到53.3%。綜合污染率、褐死率與死亡率，保留刺座的近成熟莖段的成活率最高，為86.7%。因此，選擇近成熟莖并保留刺座是最合適的外植體選擇和處理方式。

2.1.2 不同表面消毒試劑、時(shí)間對(duì)火龍果莖段培養(yǎng)的影響 不同表面消毒試劑及時(shí)間對(duì)莖段培養(yǎng)褐化、污染和成活均有影晌。從表2可以看出，當(dāng)使用相同消毒試劑和時(shí)間處理時(shí)，幼嫩莖污染率與褐死率大都高于近成熟莖，因而選擇近成熟莖作為外植體比較好；而同類(lèi)型外植體，在相同處理時(shí)間下，用次氯酸鈉消毒滅菌處理比升汞處理的污染率和褐死率高，說(shuō)明利用升汞消毒滅菌的方法更合理。同類(lèi)型莖段且消毒滅菌方法相同，從不同處理時(shí)間上比較，火龍果莖段的褐死率隨著消毒液浸泡時(shí)間的增加而增加；火龍果莖段的污染率，隨著消毒液浸泡時(shí)間的增加而降低，消毒滅菌時(shí)間為10 min時(shí)污染率與褐死率之和最低，成活率最高。綜上所述可知，選擇近成熟莖，用0.1%升汞消毒滅菌10 min為最佳外植體選擇和處理方式。

2.2 不同濃度6-BA與NAA組合對(duì)火龍果不定芽誘導(dǎo)的影響

如表3所示，6-BA濃度在2.0～8.0 mg/L同時(shí)NAA濃度在0.05～0.2 mg/L時(shí)，均能誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。根據(jù)方差分析，不同濃度的6-BA、NAA對(duì)火龍果不定芽的誘導(dǎo)都有顯著影響，當(dāng)較低濃度的6-BA（2.0 mg/L）與適當(dāng)濃度的NAA組合時(shí)，外植體不定芽的誘導(dǎo)率較低，誘導(dǎo)率在30%～40%之間；當(dāng)較高濃度的6-BA（4.0～8.0 mg/L）與適當(dāng)濃度的NAA組合時(shí)，外植體不定芽的誘導(dǎo)率較高，可達(dá)到50.0%～80.0%。在合適的范圍內(nèi)，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度相同的情況下，6-BA質(zhì)量濃度的提高，或者6-BA質(zhì)量濃度相同，降低NAA濃度，基本上都表現(xiàn)為不定芽誘導(dǎo)率的增加。綜上所述，不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA激素組合對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響不同，其中以MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 4.0 mg/L的培養(yǎng)基不定芽誘導(dǎo)效果最好，其刺座不定芽誘導(dǎo)率可達(dá)80.0%，MS+NAA 0.05 mg/L+6-BA 4.0 mg/L誘導(dǎo)效果次之，達(dá)到了76.7%。

3 討論

不定芽的誘導(dǎo)一般有3種方式，一種是先誘導(dǎo)出愈傷組織，然后由愈傷組織分化出不定芽；二是愈傷組織和不定芽同時(shí)發(fā)生；三是直接誘導(dǎo)出大量不定芽，期間沒(méi)有經(jīng)過(guò)愈傷組織形成階段。本研究探討的是直接誘導(dǎo)不定芽的途徑?；瘕埞牧系奈廴敬蠖汲霈F(xiàn)在刺座處，因?yàn)榇套垦厶幱腥~刺和數(shù)不清的小絨毛，不易清洗干凈，剝除刺座又容易在消毒環(huán)節(jié)傷害裸露的芽點(diǎn)。根據(jù)前人研究可知，黃青峰等[11]對(duì)此做過(guò)研究，認(rèn)為不帶刺座的莖段不能直接用于誘導(dǎo)不定芽，拔去小刺和絨毛的外植體不定芽誘導(dǎo)率能達(dá)65%。本研究對(duì)保留刺座上的小刺、絨毛和不保留小刺、絨毛2種類(lèi)型外植體進(jìn)行消毒比較分析，發(fā)現(xiàn)雖然拔除小刺和絨毛的近成熟莖段容易消毒，污染率僅為3.3%，但其成活率只有43.4%，不定芽誘導(dǎo)率肯定不會(huì)超過(guò)43.4%；而保留小刺和絨毛的莖段不定芽誘導(dǎo)率可高達(dá)80.0%，而污染率也僅為10.0%，而且拔除小刺和絨毛的過(guò)程中，難免會(huì)對(duì)不定芽原基造成損傷，或因直接拔掉了不定芽原基而影響不定芽誘導(dǎo)率。故認(rèn)為保留刺座上小刺和絨毛的莖段更利于誘導(dǎo)火龍果不定芽萌發(fā)，提高其組培快繁效率。消毒劑（0.1%升汞或者2.0%的次氯酸鈉溶液）浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)火龍果莖段的褐死率、污染率呈一定的規(guī)律性：火龍果莖段誘導(dǎo)的褐死率隨著消毒劑浸泡時(shí)間的增加而増加；火龍果莖段的污染率隨著消毒劑浸泡時(shí)間的増加而降低。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，選擇近成熟莖作為外植體時(shí)，利用0.1%升汞溶液消毒10 min是最合適的消毒方式。

植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，外植體不定芽的誘導(dǎo)不僅僅和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度有關(guān)，還隨著植物種類(lèi)、品種、外植體選取部位、取材時(shí)間等因素的不同而變化。大量研究表明，火龍果組織培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)不定芽的誘導(dǎo)起著重要作用，不同種類(lèi)的激素對(duì)不同材料的作用效果差異較大，其中大多數(shù)材料都可以被6-BA等細(xì)胞分裂素和NAA等生長(zhǎng)素誘導(dǎo)形成不定芽。本研究使用6-BA、NAA 2種激素來(lái)誘導(dǎo)火龍果不定芽的產(chǎn)生，在MS基本培養(yǎng)基上，當(dāng)6-BA為2.0～8.0 mg/L且NAA為0.05～0.2 mg/L時(shí)均能誘導(dǎo)出不定芽，這與黃青峰[11]、王云山等[17]研究結(jié)果相符合。而前人還采用了其他類(lèi)型的激素來(lái)誘導(dǎo)火龍果不定芽，如Hua等[16]研究結(jié)果表明，采用13.68 μmol/L ZT和2.46 μmol/L IBA等激素組合進(jìn)行火龍果不定芽誘導(dǎo)，效果最好。劉洪章等[18]、劉穎等[19]都使用MS+3.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IAA組合誘導(dǎo)出不定芽；根據(jù)王云山等[17]的研究，4.0 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA組合時(shí)效果最好，刺座不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到75%，這與本研究結(jié)果相同，只是本研究不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到了80%。

后續(xù)將深入開(kāi)展不定芽增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)最適培養(yǎng)基篩選研究，以及火龍果煉苗移栽相關(guān)技術(shù)研究，建立完整的火龍果不定芽再生途徑組織培養(yǎng)技術(shù)體系；同時(shí)通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)途徑構(gòu)建火龍果再生體系。

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