胡基華 陳靜宇 曹旭 姜威 劉宇帥 孟利強(qiáng) 李晶 張淑梅

摘要[目的]探尋防治榆紫葉甲病的生防菌株。[方法]從榆紫葉甲蟲體上分離菌株后進(jìn)行培養(yǎng)，并對室內(nèi)飼養(yǎng)的榆紫葉甲各齡幼蟲進(jìn)行致病性試驗(yàn)。[結(jié)果]從感病榆紫葉甲成蟲蟲體上分離到18個(gè)菌株，其中12個(gè)菌株具有幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)降解活性。5個(gè)菌株對1～2 齡幼蟲表現(xiàn)出不同程度的致病力，在接種后1～3 d幼蟲開始死亡，處理后7 d 幼蟲的累積死亡率為21.2%～46.8%，其中YJA-03和YJA-10菌株的累積死亡率>30.0%。YJA-03菌株為革蘭氏陽性菌，經(jīng)過形態(tài)學(xué)、生理生化特性和PCR 擴(kuò)增鑒定確定它屬于短桿菌屬（Exiguobacterium）。YJA-10菌株為革蘭氏陰性菌，經(jīng)鑒定其屬于Glutamicibacter屬。[結(jié)論]YJA-03和YJA-10菌株可用作防治榆紫葉甲病的生防菌。

關(guān)鍵詞榆紫葉甲；生物防治；菌株分離；生理生化特性

中圖分類號S763.38文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）11-0003-04

Abstract[Objective] To explore the pathogen for the biological control of Ambrostoma quadriimpressum. [Method] Some bacteria strains were isolated from A. quadriimpressum to determine the pathogenicity of Bacillus thuringinensis to each instrar of larvae fed in the laboratory. [Result] 18 bacterial isolates were obtained from diseased adults of A. quadriimpressum， among them 12 isolates showed proteindegrading and chitindegrading activities. 5 isolates showed different pathogenicity to 1stinstar and 2ndinstar larvae of A. quadriimpressum. The larvae began to die during 3-7 d after inoculation， and the accumulative mortality rate of larvae of A. quadriimpressum was 21.2%-46.8%. The accumulative mortality rate of A.quadriimpressum larvae to YJA03 strain and YJA10 strain were more than 30%. YJA03 was identified as Grampositive bacterium， a bacteria of genus Exiguobacterium identified by morphological， physiological and biochemical characteristics and PCR amplification. YJA10 was identified as Gramnegative bacterium， belonging to genus Glutamicibacter. [Conclusion] YJA03 strain and YJA10 strain can be used for the biological control of A. quadriimpressum.

Key wordsAmbrostoma quadriimopressum Motschulsky；Biological control；Strain isolation；Physiological and biochemical characteristics

榆紫葉甲（Ambrostoma quadriimopressum Motschulsky）隸屬鞘翅目葉甲科，其食性專一，僅取食榆樹芽苞、葉片，常將葉片吃光，使樹勢衰弱并引起其他病蟲危害，在黑龍江、吉林、遼寧和內(nèi)蒙古等地危害嚴(yán)重[1-2]。近年來，榆樹已經(jīng)逐漸成為城市園林綠化的重要樹種，榆紫葉甲的危害程度日益加大，嚴(yán)重影響城市園林綠化景觀，同時(shí)造成了極大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，主要依靠廣譜性的化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治，雖然在短時(shí)間內(nèi)可快速控制種群數(shù)量，但是害蟲一旦產(chǎn)生抗藥性，就會有再度猖獗的現(xiàn)象。同時(shí)，也給環(huán)境帶來了污染，隨著人們對環(huán)境問題的關(guān)注越來越多以及對環(huán)境保護(hù)意識的增強(qiáng)，人們不斷探索以生物農(nóng)藥為主的無公害防治方法。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringinensis，Bt）因其能夠產(chǎn)生殺蟲蛋白而被用于防治鱗翅目、鞘翅目和雙翅目等害蟲[3-4]。國內(nèi)有關(guān)榆紫葉甲的生物防治報(bào)道很少，而直接從蟲體上分離篩選出防治榆紫葉甲病原菌的研究鮮見報(bào)道。筆者從感病的榆紫葉甲蟲體上篩選出對榆紫葉甲幼蟲具有生防作用的2株菌株JYA-03和JYA-10，并對室內(nèi)飼養(yǎng)的榆紫葉甲各齡幼蟲進(jìn)行致病性試驗(yàn)，以期從榆紫葉甲蟲體上獲得可用于對榆紫葉甲控制的生防細(xì)菌。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蟲生菌株的分離。感病榆紫葉甲成蟲采集于東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)，從蟲體上分離到菌株后進(jìn)行培養(yǎng)，將菌株編號并保存于試管斜面培養(yǎng)基上，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2供試?yán)ハx。致病性試驗(yàn)采用榆紫葉甲2齡幼蟲，林間采集老熟卵塊，經(jīng)過室內(nèi)飼養(yǎng)分別獲得1～4齡幼蟲，用于室內(nèi)致病性試驗(yàn)。

1.1.3培養(yǎng)基。分離培養(yǎng)和保存蟲生細(xì)菌的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基、幾丁質(zhì)瓊脂（CA）培養(yǎng)基、牛奶瓊脂（MA）培養(yǎng)基，分別用于幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性測定。

1.2方法

1.2.1菌株的分離與純化。用75%乙醇清洗感病榆紫葉甲成蟲5 s，體表消毒后用 0.1%升汞水溶液對蟲體表面消毒2～3 min，無菌水清洗2次，將蟲體壓碎后，用0.85%生理鹽水制成菌懸液，水溶懸液（65 ℃ 15 min），取0.1 mL菌懸液涂布于LB平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)48 h。

1.2.2菌株降解酶活性的測定。將分離到的菌株分別接種在CA或MA平板中，培養(yǎng)3 d 后進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)菌落周圍出現(xiàn)透明圓環(huán)的即為具有降解活性的菌株，初步推測為致病性菌株。

1.2.3致病性試驗(yàn)。將具有降解酶活性的菌株活化稀釋成2.0×109個(gè)/mL 的細(xì)菌懸浮液。在培養(yǎng)皿（直徑9.0 cm 或15.0 cm）中鋪上濾紙，每個(gè)皿中放入新鮮榆樹葉片，將試蟲置于葉片上（每皿15 頭），室溫下進(jìn)行飼養(yǎng)。用噴霧器將菌液均勻噴在榆樹葉片和試蟲蟲體上，進(jìn)行室內(nèi)觀察。另外，以滅菌水噴霧葉片和試蟲作為對照（CK），每個(gè)處理重復(fù)3次。處理后1～7 d，每天定時(shí)觀察并記錄蟲體發(fā)病和死亡情況。

1.2.4測定項(xiàng)目與方法。致病菌確定為可降解幾丁質(zhì)或蛋白質(zhì)的菌株；致病性試驗(yàn)通過累積死亡率（LR7 d）和致死中時(shí)（50%蟲體死亡所需的時(shí)間，LT50），比較不同菌株之間LR7 d 值的差異，同時(shí)通過回歸分析建立毒力回歸模型。

1.2.5致病菌株的分子學(xué)鑒定。致病菌株活化培養(yǎng)36 h后進(jìn)行革蘭氏染色；觀察菌落特征、細(xì)胞形態(tài)和大??；菌株的生理生化特性參照東秀珠等[5]的方法進(jìn)行測定。

基因組DNA的提?。孩偃?00 μL樣品置于2 mL無菌離心管中，11 000 r/min離心10 min。②加入0.8 mL抽提緩沖液[1% CTAB、100 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、20 mmol/L EDTA（pH 8.0）、700 mmol/L NaCl（pH 8.0）]和20 μL蛋白酶K，充分混勻。37 ℃下水浴30 min，每隔10 min混勻1次。③加入160 μL 10% SDS，充分混勻后，65 ℃水浴1 h，每隔15 min混勻1次。④加入等體積的氯仿，充分混勻，4 ℃ 11 000 r/min 離心10 min。⑤取700 μL上清液置于2 mL離心管中，重復(fù)步驟③和④。⑥加入0.6倍體積的異丙醇混勻使其沉淀，離心。⑦加入75%乙醇700 μL，混勻后11 000 r/min離心10 min，棄上清。⑧重復(fù)步驟⑥，將沉淀風(fēng)干。⑨用30 μL TE緩沖液溶解DNA沉淀，使用切膠試劑盒純化DNA，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測。

PCR擴(kuò)增體系：處理后的樣品（70 ng/μL）模板2.0 μL；dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5 μL；27F（20 μmol/L）1.5 μL；1492R（20 μmol/L）1.5 μL；10 × Ex Taq Buffer（Mg2+ plus）5.0 μL；Ex Taq酶（5 U/μL）0.2 μL；補(bǔ)足ddH2O至50.0 μL。Ex Taq DNA Polymerase等擴(kuò)增所用試劑均購自TaKaRa公司，PCR Purification Kit 購自Promega，引物由上海生工合成。PCR儀使用Biometra公司生產(chǎn)的Tgradient，凝膠成像分析儀為Bio-Rad 公司的Gel-Doc2000。

參考Goto等的方法[6-8]，以菌株的形態(tài)特征以及生理生化特性為基礎(chǔ)，根據(jù)《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[8]初步確定各菌株的分類學(xué)屬名；根據(jù)16S rDNA 基因序列的BLASTn 比對結(jié)果，最終確定菌株的分類地位。

2結(jié)果與分析

2.1榆紫葉甲蟲病原菌菌株的分離與純化采集到的感病榆紫葉甲蟲通過對其蟲體進(jìn)行分離與純化，共得到18個(gè)菌株，編號為YJA-01～YJA-18。通過幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)水解試驗(yàn)測定，其中具有幾丁質(zhì)降解活性的有9株，具有蛋白質(zhì)降解活性的有8株，能同時(shí)降解2種物質(zhì)的有5株（表1），初步推測這12株菌株是榆紫葉甲的病原菌。

2.2具有酶活性的菌株對榆紫葉甲幼蟲的致病性滅菌水（CK）處理后榆紫葉甲幼蟲的生長發(fā)育正常，全部能按期蛻皮直至預(yù)蛹。用蟲體分離具有降解酶活性的12個(gè)菌株接種榆紫葉甲2齡幼蟲，有7個(gè)菌株未引起發(fā)病，其取食和生長發(fā)育未受到影響；5個(gè)菌株具有致病性，但其致病性存在差異（表2）。其中，2個(gè)菌株YJA-03 和YJA-10的致病性較強(qiáng)，接種后2 d始見蟲體死亡，LT50 分別為6.30和8.30 d；其余3個(gè)菌株對榆紫葉甲2齡幼蟲的致病性較弱，接種5～6 d 始見蟲體死亡，LR7d 均在25.00%以下，LT50 均超過5.00 d，其中YJA-13菌株的致病性最低，接種后第6天蟲體開始死亡，LR7 d 為2298%，LT50 為30.10 d。

對3個(gè)殺蟲效果較好的菌株進(jìn)行毒力回歸分析（表3），經(jīng)t檢驗(yàn)可知，這些回歸模型都達(dá)到顯著水平（P<0.05）。通過這些模型可以估計(jì)3個(gè)菌株對榆紫葉甲2齡幼蟲的致病能力。在一定的接種濃度（2.0×109 CFU/mL）下，計(jì)算出使50%的2齡榆紫葉甲幼蟲死亡所需要的時(shí)間（LT50），LT50時(shí)間越短，其致病性就越強(qiáng)，即對榆紫葉甲幼蟲的殺蟲效果越好。由表3可知，菌株YJA-03的致病性最強(qiáng)，LT50僅為6.30 d，其殺蟲效果最好。菌株YJA-10的致病性較強(qiáng)，LT50為8.30 d。

2.3致病菌株的形態(tài)特征對榆紫葉甲幼蟲具有殺蟲活性的2株病原菌在LB培養(yǎng)基上進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)，單胞菌落YJA-03呈淺橙色，色素不擴(kuò)散，菌株表面濕潤，菌落平坦，表面略微隆起，光滑，有蠟層（圖1A）；菌體幼齡培養(yǎng)物為桿菌，老培養(yǎng)物為球狀，菌體大小為（1.1～1.2） μm×（1.4～3.2 ） μm（圖1B），革蘭氏染色呈陽性，初步鑒定為桿菌[5，9]。YJA-10菌株為淡黃色，表面濕潤，略微隆起，光滑，有蠟層（圖1C）。革蘭氏染色均呈陰性，菌體短桿形，菌體大?。?.16～1.77） μm×（1.35～2.81） μm（圖1D）。

2.4榆紫葉甲致病菌株的生理生化特性具有殺蟲活性的2株致病菌的各生理生化特性見表4。從碳源和氮源來看，2個(gè)菌株都能利用D-葡萄糖、D-果糖、D-蔗糖、甘露醇、NH4H2PO4和KNO3；2個(gè)菌株接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽利用和硝酸鹽還原反應(yīng)結(jié)果均呈陽性；2個(gè)菌株淀粉水解試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)都呈陰性；甲基紅檢測YJA-03菌株呈陽性，YJA-10菌株呈陰性，都能在2%NaCl和30～37 ℃正常生長，而在5%～7% NaCl、4和41～45 ℃條件下均不能生長。

注：A，B.菌株YJA-03；C，D.菌株YJA-10

2.5致病菌株的16S rDNA與分子學(xué)鑒定以2個(gè)致病菌株的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分析（圖2），可見提取DNA大小約為1 600 bp；測序后去除首尾非相關(guān)序列后，得到各菌株大小1 012～1 268 bp的序列，序列登錄到GenBank數(shù)據(jù)庫中并得到它們的登錄號。將這些菌株的16S rDNA序列進(jìn)行Blast分析，結(jié)果表明YJA-03與GenBank中的短菌桿屬（Exiguobacterium）菌株高度相近；YJA-10則與Glutamicibacter屬菌株高度相近（表5）。根據(jù)包括2個(gè)菌株在內(nèi)的10個(gè)菌株的16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。從16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，同一種菌不總是聚為一簇，但相隔較近；不同種的菌株在系統(tǒng)進(jìn)化樹上相隔較遠(yuǎn)；菌株 YJA-03和YJA-10分別處于不同的小分支內(nèi)，進(jìn)化上距離較近。

3討論與結(jié)論

利用昆蟲病原菌能有效控制害蟲的發(fā)生危害，在防治害蟲的同時(shí)，還可以保護(hù)自然環(huán)境安全[10]。該研究從感病的注：M.DL 2000 Marker；1.YJA-03菌株；2.YJA-10菌株

榆紫葉甲成蟲上分離并篩選出2株對其具有致病性的細(xì)菌菌株YJA-03和YJA-10，具有一定的開發(fā)利用價(jià)值。篩選出的生防菌對1 齡、2 齡榆紫葉甲幼蟲有很好的殺蟲效果，但對高齡幼蟲和成蟲沒有明顯的致病性，說明榆紫葉甲等鞘翅目昆蟲的高齡幼蟲和成蟲對細(xì)菌的抗性明顯高于低齡幼蟲，與其他研究報(bào)道[11-12]相一致。

凡是對害蟲有毒性的細(xì)菌（如蘇云金桿菌、假單孢菌及色細(xì)菌等）都具有幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性[12-14]。該研究先從榆紫葉甲上分離并獲得病原菌，由于昆蟲表皮的成分主要為幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì)[15]，因此首先研究分離病原菌的幾丁質(zhì)酶和蛋白酶活性，因?yàn)橛g幼蟲集中危害嫩葉，室內(nèi)試驗(yàn)中用細(xì)胞懸浮液噴灑于榆樹葉片和蟲體上，大大增加了病原菌侵入蟲體的機(jī)會。今后林間野外試驗(yàn)應(yīng)對昆蟲林間發(fā)育進(jìn)度進(jìn)行調(diào)查研究，選擇適當(dāng)?shù)氖┧帟r(shí)期和合適的氣候條件，以保證藥劑的殺蟲效果。

該研究通過觀察2個(gè)榆紫葉甲殺蟲活性菌株的菌落和菌體形態(tài)特征和生理生化特性，結(jié)合16S rDNA 序列對比分析鑒定，確定它們分屬于短桿菌屬（Exiguobacterium）和Glutamicibacter屬。前者曾從馬鈴薯加工廢水中提取到，也用于廢水處理研究中。目前，還未見到2個(gè)菌株侵染昆蟲的報(bào)道，因此還需要對其殺蟲機(jī)理、發(fā)酵擴(kuò)繁和制劑配制、應(yīng)用技術(shù)等方面進(jìn)行深入研究。此外，該研究雖然篩選到對榆紫葉甲具有生防效果的細(xì)菌，但不同環(huán)境中的榆紫葉甲蟲體上還存在其他潛在的生防細(xì)菌，今后還需要進(jìn)行進(jìn)一步分離篩選和鑒定研究。

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