張石宇 宋信莉 劉文 湯瑾 石洪州

摘要 [目的]通過(guò)水提醇沉法的正交試驗(yàn)優(yōu)化中藥復(fù)方制劑二丁顆粒的制備工藝。[方法]采用藥典中的水煎煮法制備中藥液，采用醇沉法進(jìn)行精制，以秦皮乙素的含量和出膏率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)濃縮濃度、乙醇濃度、靜置時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]影響精制結(jié)果的因素為濃縮濃度和乙醇濃度，由于靜置時(shí)間沒(méi)有顯著差異，又從降低成本及節(jié)省時(shí)間等方面綜合考慮，確定最佳工藝條件為：浸膏濃縮濃度為2 g/mL，乙醇濃度為80%，靜置時(shí)間為18 h。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為二丁顆粒的劑型改良提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 秦皮乙素；水提醇沉法；正交試驗(yàn)；高效液相色譜法

中圖分類號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）29-0003-03

Water Extractalcohol Precipitation Process of Dibutyl Particles

ZHANG Shiyu1，SONG Xinli2*，LIU Wen2 et al

（1. Guizhou Province Hospital of TCM，Guiyang，Guizhou 550002；2. Guiyang College of TCM，Guiyang，Guizhou 550002）

Abstract [Objective] The water extractalcohol precipitation process of dibutyl particles were optimized by orthogonal test. [Method] The pharmacopeia water decoction prepared in solution and alcohol sinking method were adopted to improve the refined. Taking content and extract rate of phenanthrene as the evaluation index， the concentrated sulfate， ethanol concentration and incubation time of alcohol sinking method were optimized by orthogonal test. [Result] The influencing factors of refining the results were enrichment concentration and ethanol concentration. Because there was no significant difference between incubation time， considering cost and save time， the best process conditions were as followed： the extract concentration was 2 g/mL， the ethanol concentration was 80%， and the incubation time was 18 hours. [Conclusion] The results provide reference for 2 d particles reform.

Key words Phenanthrene；Aqueous alcohol sinking method；Orthogonal experiment；High performance liquid chromatography

作者簡(jiǎn)介 張石宇（1987—），女，貴州遵義人，藥師，碩士，從事中藥新技術(shù)與新制劑研究。*通訊作者，副教授，碩士，從事中藥新技術(shù)與新制劑研究。

收稿日期 2017-09-08

二丁顆粒是由紫花地丁、蒲公英、板藍(lán)根、半邊蓮4味藥材制成的中藥復(fù)方制劑，成品性狀為棕褐色顆粒；味甜、微苦或味微甜、微苦（無(wú)蔗糖）[1]；具清熱解毒、利濕退黃的功能，臨床用于熱癤癰毒、濕熱黃疸、外感風(fēng)熱、咽喉腫痛等的治療[2-3]。二丁顆粒收載于《中國(guó)藥典》2015版 Ⅰ 部。隨著二丁顆粒應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)大，人們對(duì)其工藝進(jìn)行研究十分必要。目前，學(xué)者們對(duì)二丁顆粒的純化工藝研究較少，在制備工藝方面，用水煎煮后直接濃縮加輔料制成顆粒，使得服用量較大。二丁顆粒主要測(cè)定方中紫花地丁中秦皮乙素的含量，筆者以此作為方中的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，采用水提醇沉方法對(duì)二丁顆粒進(jìn)行了準(zhǔn)備，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)二丁顆粒的制備工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為二丁顆粒的劑型改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑。WAT-GZ050926CWJ型WATERS高效液相色譜儀（美國(guó)WATERS公司）；Diamonsil C18色譜柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；SK8210HP型超聲波清洗機(jī)（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；DZF-6210真空干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；AE240微量分析天平（上海梅特勒儀器有限公司）；YP10002電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司）。甲醇（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130410）；甲醇（重慶川東化工有限公司，批號(hào)：20121001）；95%乙醇（重慶川東化工有限公司，批號(hào)：20130410）；乙腈（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130406）；哇哈哈純凈水。

1.1.2 藥材。紫花地?。ㄖ袊?guó)亳州市京皖中藥飲片廠，批號(hào)：皖20150145）、蒲公英（安徽泰源中藥飲片有限公司，批號(hào)：皖20160272）、板藍(lán)根（中國(guó)亳州市京皖中藥飲片廠，批號(hào)：皖20100145）、半邊蓮（中國(guó)亳州市京皖中藥飲片廠，批號(hào)：皖20150145）、秦皮乙素（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110741-200506）。根據(jù)文獻(xiàn)[4]高效液相色譜法測(cè)定紫花地丁中秦皮乙素的含量，對(duì)紫花地丁進(jìn)行含量測(cè)定，得出安徽亳州的紫花地丁符合藥典標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備。

1.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備。取秦皮乙素對(duì)照品適量，精密稱定，加入甲醇制成濃度為306 μg/mL的溶液，即得對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 二丁顆粒浸膏粉的制備。取紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍(lán)根各25 g，加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液，濾過(guò)，濃縮，減壓干燥，直至恒重即得干浸膏，將干浸膏粉碎過(guò)100目篩，即得浸膏粉。

1.2.1.3 供試品溶液的制備。取“1.2.1.2”浸膏粉0.14 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲處理（頻率50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.1.4 陰性對(duì)照品溶液的制備。按照“1.2.1.2”方法制備缺紫花地丁的浸膏粉，取0.14 g，再按“1.2.1.3”方法制備陰性對(duì)照品溶液。

1.2.2 色譜條件。色譜柱：Diamonsil C18柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-冰醋酸（25∶75∶0375）；檢測(cè)波長(zhǎng)為353 nm；柱溫為25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以秦皮乙素計(jì)不低于3 000。

1.2.3 方法學(xué)考察。

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別精密吸取“1.2.1.1”對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，取10 μL注入液相色譜儀，按“1.2.2”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.2 精密度試驗(yàn)。精密吸取10 μL同一濃度（30.60 mg/mL）的秦皮乙素對(duì)照品溶液，注入高效液相色譜儀中測(cè)定峰面積，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“1.2.2”色譜條件進(jìn)行分析。

1.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取10 mL供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、6、8、10、12 h各取10 μL注入高效液相色譜儀中測(cè)定峰面積。

1.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.1.3”方法制備6批樣品溶液，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。

1.2.3.5 陰性試驗(yàn)。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照液各10 μL進(jìn)行高效液相色譜分析。

1.2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)。采用加樣回收法，精密稱取二丁顆粒干浸膏粉約0.08 g（相當(dāng)于164 μg秦皮乙素）6份，分別精密加入0.54 mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液，濃度為306 μg/mL（相當(dāng)于165.24 μg秦皮乙素標(biāo)準(zhǔn)品），加入25 mL甲醇，稱重，超聲處理（頻率50 kHz）30 min，放冷，補(bǔ)足損失的質(zhì)量，濾過(guò)，制備得6份供試品溶液，各吸取供試品溶液10 μL注入色譜儀中測(cè)定。

1.2.4 二丁顆粒的純化工藝研究。

1.2.4.1 未精制前二丁顆粒的含量測(cè)定。按“1.2.1.2”的方法平行制備3份浸膏粉，再按“1.2.1.3”的方法制備得供試品溶液。分別取10 μL供試品與對(duì)照品注入液相色譜儀，按“1.2.2”色譜條件測(cè)定秦皮乙素含量。同時(shí)按“1.2.1.2”的方法平行制備3份浸膏粉，測(cè)定浸膏率。

1.2.4.2 純化工藝的正交試驗(yàn)。采用正交法優(yōu)選秦皮乙素含量高時(shí)的醇沉條件，設(shè)置3因素3水平正交考察，以秦皮乙素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)二丁顆粒純化工藝進(jìn)行探討。因素與水平見(jiàn)表1。

1.2.4.3 二丁顆粒的精制。以樣品溶液中秦皮乙素含量和出膏率的綜合值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析，用水提醇沉法對(duì)中藥復(fù)方二丁顆粒進(jìn)行精制。二丁顆粒純化浸膏粉的制備：取紫花地丁、半邊蓮、蒲公英、板藍(lán)根各12.5 g，加水煎煮2次，第1次2.0 h，第2次1.5 h，合并煎液，濾過(guò)；取續(xù)濾液，根據(jù)精制試驗(yàn)正交表和因素水平表，濃縮，待濃縮液冷至室溫，慢慢加入乙醇到濃縮液中，邊加邊攪拌，密封，于3～5 ℃靜置冷藏，取出分離除去沉淀，濾液置于水浴鍋上蒸發(fā)至干，減壓干燥即得干浸膏，將干浸膏粉碎過(guò)100目篩，即得浸膏粉。供試品溶液的制備：取0.1 g純化后的二丁顆粒浸膏粉，按“1.2.1.3 ”的方法制備，即得供試品溶液。對(duì)照品溶液的制備：按“1.2.1.1”的方法制備濃度為15.4 μg/mL的對(duì)照品溶液。取上述所得樣品各10 μL，注入液相色譜儀，按“1.2.2”色譜條件測(cè)定秦皮乙素含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)的考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性范圍。以峰面積（y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為 y=34 752x-17 057，r=0.999 7，表明對(duì)照品溶液濃度為6.12～30.60 mg/mL時(shí)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度。重復(fù)進(jìn)樣6次，峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，表明精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%，小于3.00%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.41%，小于3.00%，表明試驗(yàn)重復(fù)性較好，方法可靠。

2.1.5 陰性試驗(yàn)。結(jié)果表明，在秦皮乙素的保留時(shí)間處無(wú)色譜峰，說(shuō)明對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。秦皮乙素對(duì)照品、二丁顆粒陰性對(duì)照品和二丁顆粒供試品的HPLC圖譜分別見(jiàn)圖1、2、3。

2.2 二丁顆粒的純化工藝研究

2.2.1 未精制前二丁顆粒的含量測(cè)定。由表3可知，未精制的二丁顆粒浸膏粉中秦皮乙素的含量為2.049 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.40%。由表4可知，未精制的二丁顆粒的浸膏得率為21.400 9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68%。

2.2.2 純化工藝的正交試驗(yàn)優(yōu)化。由表5和方差分析結(jié)果可知，影響精制結(jié)果的因素為濃縮濃度（A）和乙醇濃度（B），當(dāng)試驗(yàn)為A3B3時(shí)，即浸膏濃縮濃度為2 g/mL、乙醇濃度為80%時(shí)，秦皮乙素的平均含量最高，浸膏出膏率最低。由于C沒(méi)有顯著性差異，從降低成本及節(jié)約時(shí)間等綜合考慮，最佳工藝條件定為A3B3C1，即浸膏濃縮濃度為2 g/mL、乙醇濃度為80%、靜置時(shí)間為18 h。

3 結(jié)論與討論

中藥復(fù)方提取效果直接關(guān)系到產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，選擇評(píng)價(jià)提取工藝優(yōu)劣的評(píng)價(jià)指標(biāo)是研究工作中的重要問(wèn)題，合理的提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)應(yīng)該是提取的有效成分質(zhì)和量的代表，也是提取物臨床作用性質(zhì)和強(qiáng)度的代表[5]。該研究中，方法學(xué)考察是參照2015版藥典一部中二丁顆粒的含量測(cè)定法所建立。結(jié)果表明，秦皮乙素在濃度為6.12～30.60 μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=0.999 7；平均回收率為102.28%；樣品溶液在12 h內(nèi)保持穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%。該法穩(wěn)定，為二丁顆粒制備工藝優(yōu)選提供了依據(jù)。

選擇適宜密度的醇沉乙醇濃度和浸膏初始密度對(duì)醇沉

的效果有重要影響，若密度或濃度過(guò)高，因水煮液中含有較

多的糖類，易包裹藥液，可造成有效成分損失；若濃度或密度過(guò)低，則藥液量較大，需消耗大量乙醇，延長(zhǎng)工序時(shí)間，有效成分也易被破壞[6]。該研究通過(guò)正交試驗(yàn)篩選出最佳的濃縮濃度、乙醇濃度和靜止時(shí)間，對(duì)二丁顆粒進(jìn)行精制，為后期二丁顆粒的制備工藝奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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