桓瓊莎 伍時華 趙東玲 黃翠姬 易弋

摘 要：研究了釀酒酵母GJ2008和釀酒酵母GGSF16不同接種比例（V/V）在酒精發(fā)酵過程中葡萄糖和果糖利用的差異性，為蔗汁木薯粉酒精發(fā)酵提供研究基礎(chǔ).以等質(zhì)量濃度的葡萄糖與果糖（總糖220 g/L）混合進行酒精發(fā)酵，調(diào)節(jié)釀酒酵母GJ2008與GGSF16不同接種比例（10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10，以初始酵母數(shù)為4.0×107 CFU/mL）進行酒精發(fā)酵，測定發(fā)酵過程中總糖﹑葡萄糖﹑果糖﹑乙醇的變化，采用曲線下面積法和糖代謝一半與代謝完全所需時間法對兩種糖利用差異性進行分析.結(jié)果表明：果糖的利用速率小于葡萄糖的利用速率，隨著酵母菌株GGSF16接種量的增加，葡萄糖利用速率加快，整個發(fā)酵過程中，混合酵母菌株對果糖代謝的影響程度高于其對葡萄糖的影響程度；兩種酵母菌株的接種比例對乙醇產(chǎn)量無明顯影響；相比較之下，0∶10組總糖發(fā)酵效率和耗糖發(fā)酵效率均較高；因此，釀酒酵母GJ2008和GGSF16最佳接種比例為0∶10（V/V）.

關(guān)鍵詞：混合菌種；果糖；葡萄糖；曲線下面積；酒精發(fā)酵

中圖分類號：TS261.1 文獻標志碼：A

0 引言

將甘蔗和木薯作為燃料乙醇的候選原料已經(jīng)成為近年來的研究熱點[1-2]，目前國內(nèi)外已有將兩種原料混合進行酒精發(fā)酵的相關(guān)報道[3-5].甘蔗汁與木薯粉混合發(fā)酵過程中，甘蔗汁中蔗糖被水解成葡萄糖和果糖，木薯淀粉在糖化酶的作用下水解生成大量的葡萄糖.葡萄糖與果糖在酒精發(fā)酵過程中共用一套膜運輸和酶催化體系[6-7]，而果糖對膜運輸和酶催化體系的親和度小于葡萄糖，所以兩種糖在發(fā)酵過程中的利用必存在差異性.目前，酒精發(fā)酵過程中，影響葡萄糖和果糖利用差異性的因素主要有可同化氮[8]﹑糖濃度[9]﹑溫度[10]﹑葡萄糖與果糖比例[11]﹑菌種性能[12]等，混合酵母對糯米酒風(fēng)味改善研究也有所報道[13].而關(guān)于混合酵母菌株對葡萄糖與果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精過程中兩糖利用差異性影響的研究尚不清楚，因此有必要對此問題開展研究.

本研究以釀酒酵母GJ2008，GGSF16為出發(fā)菌株，等質(zhì)量濃度的葡萄糖和果糖混合作為發(fā)酵培養(yǎng)基，采用混合菌株進行酒精發(fā)酵，研究混合菌株酒精發(fā)酵過程對葡萄糖與果糖利用差異性的影響，以期為甘蔗汁與木薯粉混合酒精發(fā)酵提供參考和依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）GJ2008和GGSF16：廣西科技大學(xué)發(fā)酵工程研究所保藏.

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面活化培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH.

一級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.

二級種子培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，葡萄糖100 g/L，蛋白胨20 g/L，自然pH.

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸膏10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖±110 g/L，果糖±110 g/L，自然pH.

以上培養(yǎng)基均于115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 儀器與設(shè)備

ZWYD-2402疊式恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LS-B35L-I立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；SBA-40生物傳感儀：山東科學(xué)院生物研究所；SGD-IV全自動還原糖測定儀：山東科學(xué)院生物研究所；SW-CJ-TB標準凈化工作臺：蘇州集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Mikro220R臺式冷凍離心機：天津奧特賽恩斯儀器有限公司；DW-86L386立式超低溫保存箱：青島海爾特種有限公司.

1.3 方法

1.3.1 種子培養(yǎng)方法 將實驗室保藏菌種GJ2008，GGSF16經(jīng)30 ℃斜面活化1 d～2 d后分別接種至一級種子培養(yǎng)基中，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)12 h，以體積分數(shù)為10%的接種量分別轉(zhuǎn)接至二級種子培養(yǎng)基中，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)10 h后，經(jīng)4 000 r/min離心10 min，棄上清液得濕酵母泥，加入無菌水振蕩混合制得10倍濃縮種子懸液.

1.3.2 酒精發(fā)酵方法 以原菌液體積分數(shù)為10%的接種量計，將2 mL10倍濃縮種子液接種至裝液量為200 mL/500 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進行果糖和葡萄糖混合酒精發(fā)酵，其中釀酒酵母GJ2008與GGSF16接種比（V/V）為10∶0，8∶2，6∶4，4∶6，2∶8，0∶10.初始酵母數(shù)約4.0×107 CFU/mL，32 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)，透氣膜和牛皮紙包扎封口進行非嚴格厭氧發(fā)酵，每組3個平行試驗.發(fā)酵開始0 h，3 h，6 h以后每隔6 h取樣并測CO2失重，CO2失重小于0.2 g時發(fā)酵結(jié)束.

1.3.3 成分分析方法 樣品處理：取2 mL發(fā)酵液，12 000 r/min冷凍離心3 min，取上清液于-60 ℃儲存，備用.

葡萄糖和乙醇含量采用生物傳感分析儀測定，標準乙醇體積分數(shù)為0.075%，葡萄糖質(zhì)量濃度為1 g/L，采用還原糖測定儀測定發(fā)酵液中的還原糖質(zhì)量濃度.果糖質(zhì)量濃度等于還原糖質(zhì)量濃度減去葡萄糖質(zhì)量濃度.

1.3.4 糖代謝曲線分析 運用GraphPad Prism 5.0軟件繪制果糖和葡萄糖的代謝曲線，并分別獲得果糖與葡萄糖代謝曲線下面積（area under the fermentation curve，AUC）[14]，記作果糖AUC和葡萄糖AUC.

運用Origin 9.0軟件對糖代謝進行非線性曲線擬合，Boltmann S型函數(shù)是葡萄糖和果糖代謝擬合較好的方程，選擇相關(guān)系數(shù)R2最大的函數(shù)作為其擬合方程，通過擬合方程分別計算出兩種糖消耗一半和消耗完全所用的時間，記作tF50，tG50和tFend，tGend[7].

1.3.5 計算方法

總發(fā)酵效率=×100%

乙醇產(chǎn)率g/（L·h）=

2 結(jié)果與討論

2.1 糖代謝時間法分析葡萄糖與果糖利用差異

圖1為混合酵母菌株不同接種比例條件下葡萄糖和果糖的代謝擬合曲線，糖代謝擬合方程見表1.由圖1可知，發(fā)酵6 h ～18 h，每組比值中果糖的含量總是高于葡萄糖；不同小組間，同一發(fā)酵時間，接種比值越大，果糖含量越小.等量的葡萄糖與果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，隨著兩菌株接種比值的減小，兩糖消耗曲線逐漸拉開.采用Origin 9.0軟件對兩種糖代謝過程進行非線性曲線擬合，Boltmann S型函數(shù)是擬合較好的方程，見表1.由表1可知，所得到的擬合方程的R2在0.991 8～0.997 7之間，擬合程度較好，能夠簡單、直觀地描述發(fā)酵過程中糖代謝的變化，葡萄糖和果糖代謝過程的擬合曲線類型受兩菌株接種比例影響不大.

糖消耗一半和消耗完全的時間可以表示菌株對糖利用的快慢，時間越短，表示菌株對糖利用越快[6].根據(jù)表1擬合方程計算可獲得葡萄糖和果糖的t50，tend值，結(jié)果見表2.由表2可知，在酵母菌株不同接種比例下，tF50和tFend一直大于tG50和tGend，表明酒精酵母對葡萄糖的嗜好性更強.隨著釀酒酵母GGSF16接種量的增加，tG50隨之減小，說明葡萄糖利用快慢與GGSF16接種量有關(guān).

表3中， tnF50/t0F50，tnG50/t0G50和tnGend/t0Gend的大小表明葡萄糖與果糖的利用情況受兩酵母菌種接種比例的影響程度.由表3可知，不同接種比例下tnG50/t0G50一直小于tnF50/t0F50，說明果糖的代謝受兩種菌株接種比例的影響更為明顯.

2.2 曲線下面積法分析葡萄糖與果糖利用差異

發(fā)酵程度的好壞可以通過糖利用情況來評估，本研究采用曲線下面積法對糖利用情況進行直觀判斷，AUC值越小，表示菌株對糖利用越快[14].由表4可知，兩酵母菌株接種比同水平下，果糖AUC值總是大于葡萄糖AUC值；果糖AUC值隨著接種比例的減小而增大，葡萄糖AUC值隨著接種比例的減小而減小，表明兩種菌株對葡萄糖的偏好均明顯優(yōu)于果糖，證明酵母菌對葡萄糖具有嗜好性，并隨著酵母菌株GGSF16接種量的增大，葡萄糖代謝速度加快.

表5中，在兩酵母菌株不同接種量比例下，糖利用受接種比例影響的程度可以通過糖代謝曲線下面積比值果糖AUC/果糖AUC和葡萄糖AUC/葡萄糖AUC進行比較，比值越大，表明該糖類受菌株接種比例影響程度越大[15].由表5可知，果糖AUC/果糖AUC總是大于葡萄糖AUC/葡萄糖AUC，說明酵母菌株接種比例對果糖的代謝影響更明顯.

2.3 dGF /dG法分析葡萄糖與果糖利用差異

dGF/dG=[dG- dF]/ dG，即[葡萄糖消耗速率（dG）-果糖消耗速率（dF）]/葡萄糖消耗速率（dG）， dGF/dG值是衡量葡萄糖與果糖利用差異性指標之一[8，15].酵母菌株不同接種比例下葡萄糖與果糖混合發(fā)酵dGF/dG值見圖2.由圖2可知，發(fā)酵過程中dGF/dG值均呈減小趨勢，6 h～12 h尤其明顯，表明此階段葡萄糖的利用速率大于果糖的利用速率；之后dGF/dG值不斷減小直至發(fā)酵結(jié)束，說明發(fā)酵后期葡萄糖與果糖的利用差異性在不斷縮小，這可能與發(fā)酵后期培養(yǎng)基中的可同化氮量有關(guān)[16].

2.4 混合酵母菌株不同接種比例條件下酒精發(fā)酵參數(shù)的比較分析

酵母菌株不同接種比例條件下，葡萄糖和果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)酒精主要參數(shù)見表6.從殘總糖質(zhì)量濃度，發(fā)酵周期、酒精度、乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率及耗糖發(fā)酵效率來看，各比例小組相互之間差別不大；相比較之下，0∶10組不論是酒精度，還是乙醇產(chǎn)率、總糖發(fā)酵效率及耗糖發(fā)酵效率均較高，所以葡萄糖和果糖混合發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，0∶10（即僅含酒精酵母GGSF16）時發(fā)酵效果最好.

3 結(jié)論

本文研究了釀酒酵母GJ2008和GGSF16接種比例對葡萄糖果糖利用差異性的影響，結(jié)果表明：發(fā)酵前中期釀酒酵母對果糖的利用速率低于其對葡萄糖的利用速率，說明酒精酵母對葡萄糖的嗜好性；隨著酵母菌株GGSF16接種量的增加，葡萄糖利用速率加快；整個發(fā)酵過程中，混合酵母菌株接種比例對果糖代謝的影響程度高于其對葡萄糖的影響程度.

參考文獻

[1] 趙子威，伍時華，張健，等. 不同總糖濃度木薯全渣乙醇分批發(fā)酵過程的研究[J]. 廣西科技大學(xué)學(xué)報，2014，25（3）：92-97，102.

[2] DIVYANAIR M P， PADMAJA G， MOORTHY S N. Biodegradation of cassava starch factory residue using a combination of cellulases， xylanases and hemicellulases[J]. Biomass and Bioenergy， 2011， 35（3）：1211-1218.

[3] 申乃坤，張紅巖，王青艷，等. 木薯粉與甘蔗汁混合發(fā)酵生產(chǎn)高濃度乙醇[J]. 生物工程學(xué)報，2010，26（9）：1269-1275.

[4] 易弋，容元平，程謙偉，等. 提高甘蔗汁酒精發(fā)酵酒度的實驗[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（6）：247-249.

[5] BAI F W， ANDERSON W A， MOO-YOUNG M. Ethanol fermentation technologies from sugar and starch feedstocks[J]. Biotechnology Advances， 2008， 26（1）：89-105.

[6] 左松，伍時華，張健，等. 糖濃度對酒精酵母GJ2008果糖與葡萄糖利用差異性的影響[J]. 中國釀造，2013，32（12）：25-29.

[7] BERTHELS N J， CORDERO OTERO R R， BAUER F F， et al. Correlation between glucose/fructose discrepancy and hexokinase kinetic properties in different Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，77（5）：

1083-1091.

[8] BERTHELS N J， CORDERO O R R， BAUER F F， et al. Discrepancy in glucose and fructose utilization during fermentation by Saccharomyces cerevisiae wine yeast strains[J].FEMS Yeast Research，2004，4（7）：683-689.

[9] ZINNAI A， VENTURI F， SANMARTIN C. Kinetics of D-glucose and D-fructose conversion during the alcoholic fermentation promoted by Saccharomyces cerevisiae[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2013，115（1）：43-49.

[10] TRONCHONI J， GAMERO A，ARROYOLóPEZ F N， et al. Differences in the glucose and fructose consumption profiles in diverse Saccharomyces wine species and their hybrids during grape juice fermentation[J]. International Journal of Food Microbiology，

2009，134（3）：237-243.

[11] DIAZ-CAMPILLOM， URTIZN，SOTO O， et al. Effect of glucose concentration on the rate of fructose consumption in native strains isolated from the fermentation of Agave duranguensis[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，28（12）：3387-3391.

[12] GUILLAUME C， DELOBEL P， SABLAYROLLES J M， et al. Molecular basis of fructose utilization by the wine yeast Saccharomyces cerevisiae： a mutated HXT3 allele enhances fructose fermentation[J] . Applied and Environmental Microbiology，2007，73（8）：2432-2439.

[13] 楊子琳，伍時華，黃翠姬，等. 扣囊復(fù)膜酵母與釀酒酵母混合液態(tài)發(fā)酵改善糯米酒風(fēng)味的研究[J]. 廣西科技大學(xué)學(xué)報，

2016，27（3）：95-100.

[14] LICCIOLI T，CHAMBERS P J， JIRANEK V. A novel methodology independent of fermentation rate for assessment of the fructophilic character of wine yeast strains[J]. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2011，38（7）：833-843.

[15] 左松，伍時華，張健，等. 外部因素對酒精酵母GJ2008果糖與葡萄糖酒精發(fā)酵的影響[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報， 2015， 34（7）：764-771.

[16] LAOPAIBOON L， NUANPENG S， SRINOPHAKUN P， et al. Ethanol production from sweet sorghum juice using very high gravity technology： effects of carbon and nitrogen supplementations[J].Bioresource Technology， 2009， 100（18）： 4176-4182.

Discrepancy of fructose and glucose consumption during alcoholic fermentation by mixed strains

HUAN Qiong-sha， WU Shi-hua﹡， ZHAO Dong-ling， HUANG Cui-ji， YI Yi

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and

Technology， Liuzhou 545006， China）

Abstract：To provide basic information of sugarcane and cassava fermentation， the inoculation proportion of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 was evaluated to verify the use of glucose and fructose. The glucose and fructose medium （the total concentration was 220 g/L） with same concentration was used to conduct alcoholic fermentation. We adjusted the ratios of mixed strains of S.cerevisiae GJ2008 and GGSF16 （10∶0， 8∶2，6∶4，4∶6， 2∶8， 0∶10） to conduct alcoholic fermentation， determining total sugar， glucose， fructose and ethanol in the fermentation process， using area under the curve（AUC） and complete/half metabolism time methods to analyze the difference of the utilization between the glucose and the fructose. The results showed that the rate of utilization of fructose was less than the rate of utilization of glucose， with the number of S.cerevisiae GGSF16 increasing， the metabolism rate of glucose became faster， the effect of mixed yeast strain on fructose metabolism was higher than that of glucose， the inoculation ratio of two yeast strains had no significant effect on ethanol production， the 0∶10 group had the highest total sugar fermentation efficiency and consumption of sugar fermentation efficiency. Thus， the best vaccination ratio of Saccharomyces cerevisiae GJ2008 and Saccharomyces cerevisiae GGSF16 was 0∶10.

Key words：mixed strains； fructose； glucose； area under the curve； alcohol fermentation

（學(xué)科編輯：黎 婭）