蔣旋嫻 李永成

摘 要：該研究在海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)的不同階段（5、10、15、20 d），分別添加不同劑量的L-丙氨酸（10、30、50、100 mg·L-1），測定細胞生長、細胞活力及產(chǎn)物含量，確定L-丙氨酸最佳的添加時間及添加劑量。結(jié)果表明：添加L-丙氨酸對細胞生長和細胞活力均有抑制作用；在海南粗榧懸浮培養(yǎng)第15天、添加30 mg·L-1 L-丙氨酸時，產(chǎn)物含量最高（4.853 6 mg·L-1），是對照（2.853 8 mg·L-1）的1.7倍。同時，為了探討添加L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞糖代謝的影響，對培養(yǎng)基糖耗程度、細胞內(nèi)糖酵解途徑（glycolytic pathway，EMP途徑）關(guān)鍵酶丙酮酸激酶（Pyruvate kinase，PK）活力、磷酸戊糖途徑（hexose monophosphate pathway，HMP途徑）關(guān)鍵酶6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase， G6PDH）活力進行了測定，結(jié)果顯示添加L-丙氨酸后，植物細胞培養(yǎng)液中總耗糖速度與對照相比無明顯差異，丙酮酸激酶（PK）活力與對照（25.37 U·g-1）相比下降了29.10%，G6DPH活力是對照組（53.49 U·g-1）的1.33倍。以上結(jié)果說明，糖代謝途徑中碳通量在一定程度上由EMP途徑轉(zhuǎn)向了HMP途徑，三尖杉酯類堿合成的前體物PEP積累，E4P合成量增加，均有利于產(chǎn)物三尖杉酯類堿含量的增加。

關(guān)鍵詞：海南粗榧， 懸浮培養(yǎng)， 抑制劑， L-丙氨酸， 三尖杉酯類堿

中圖分類號：Q813.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2017）04-0497-08

Abstract：Cephalotaxus mannii is an indigenous plant to Hainan， China， which is the main material of cephalotaxuin eloids. The cephalotaxus alkaloids are anti-cancer drugs which have been used widely in clinic. But C. mannii is rare. The plant suspension cell culture can increase the yield of secondary metabolites steadily. And some adopted strategies have been developed to increase the yield in plant cell culture， such as add metabolic inhibitor. L-alanine is an effective inhibitor of pyruvate kinase （PK）， which is an important limited enzyme in the glycolytic pathway （EMP）. To investigate the effects of L-alanine on suspension cell growth and the cephalotaxine production of C. mannii， different doses of L-alanine （10， 30， 50 and 100 mg·L-1） were added into the C. mannii cells at different stages （10， 15， 20 and 25 d） of culture time. Then the cell growth， the cell activity and the cephalotaxine production were determined. The results showed that the cell growth and cell activity of C. mannii were inhibited after adding L-alanine， the cultures treated with 30 mg·L-1） L-alanine at day 15 showed the highest cephalotaxine yield （4.853 6 mg·L-1）， which was 1.7 times that of the control cultures （2.853 8 mg·L-1）. Then， the residue sucrose contents of the culture， the activity of pyruvate kinase （PK） which is the key enzyme of EMP pathway， the activity of glucose 6-phosphate dehydrogenase （G6PDH） which is the key enzyme of hexose monophosphate pathway （HMP pathway） were all been determined to investigate the effects of L-alanine on cell glucose metabolism of C. mannii. The results showed that after adding L-alanine， the sucrose consumption rate of treated cells had no significant difference compared with the control cells， the PK activity of treated cells was decreased by 29.10% compared with the control cells （25.37 U·g-1）， the G6PDH activity of treated cells was 1.33 times of that in the control cells （53.49 U·g-1）. The results suggest that the carbon metabolic flux flow to HMP pathway from EMP pathway in some degree， so it can be presumed that the precursor PEP accumulated and the other precursor E4P also increased， which all benefit to the synthesis of cephalotaxine production.

Key words：Cephalotaxus mannii， suspension culture， inhibitor， L-alanine， cephalotaxine

海南粗榧（Cephalotaxus mannii）屬于裸子植物門，為三尖杉科（粗榧科）三尖杉屬（粗榧屬）雌雄異株常綠喬木， 是三尖杉科植物中分布最南的一種，主要分布在海南，但在廣西、云南與西藏也有零星分布（傅立國，1978；陳煥鏞，1964）。海南粗榧也是生產(chǎn)抗癌藥物三尖杉酯堿（Harringtonine） 和高三尖杉酯堿（Homoharringtonine）的主要材料（劉進平和黨群帆，2006）；由于有較強的抗癌作用，又被稱為“抗癌奇木”（王有生，1990）。因為其繁殖不易，生長緩慢，并且近年來被過度采伐，這種國家二級重點保護植物已瀕于滅絕的邊緣（符文英等，2003）。三尖杉酯堿與高三尖杉酯堿在海南粗榧中的含量約為0.38%（樹皮）（陳毓亨和黃全，1977），需要約1 000 kg的海南粗榧木材大約才能提取出1 g分析純的三尖杉酯堿（劉進平等，2010），原料耗費巨大，遠不能滿足日益增長的臨床需要。

植物細胞懸浮培養(yǎng)具有不受地理環(huán)境、土壤條件、季節(jié)變化等因素的限制，能確保產(chǎn)物均勻、連續(xù)的生產(chǎn)，并且提取方法簡單（Gibson et al，1993）。其中，促進植物懸浮細胞高效表達次生代謝物的策略主要有：選育高通量的細胞系、選擇合適的培養(yǎng)技術(shù)、優(yōu)化培養(yǎng)條件、添加前體物質(zhì)、使用誘導子和抑制劑等（Strohl，2001；Wilson & Roberts，2012）。其中添加代謝抑制劑可抑制支路代謝和切斷其他非目的代謝的合成途徑，改變細胞中代謝流的流向，從而增加目標化合物產(chǎn)量。周忠強和梅興國（2004）在紅豆杉懸浮細胞體系中通過單獨或組合添加的方式添加單萜合成抑制劑樟腦、松油醇、α-蒎烯后均能促進產(chǎn)物合成，并且三種抑制劑同時添加時更有利于產(chǎn)物的合成。

三尖杉類生物堿是異喹啉生物堿中一組結(jié)構(gòu)特殊的生物堿，其生物合成途徑如圖1所示，葡萄糖經(jīng)過糖酵解產(chǎn)生磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途徑產(chǎn)生的赤蘚糖-4-磷酸，二者合成的莽草酸進一步轉(zhuǎn)化為苯丙氨酸和酪氨酸，從而合成三尖杉酯類堿（Gitterman et al，1980；Parry et al，1980）。L-丙氨酸是糖酵解途徑中重要的限速酶丙酮酸激酶的抑制劑。Ruifang et al（2009）報道在產(chǎn)林可霉素菌株的培養(yǎng)基中外源添加0.1 g·L-1 L-丙氨酸后，產(chǎn)物含量增加 13%。本研究期望通過添加L-丙氨酸，抑制丙酮酸激酶活性，阻斷前體物磷酸烯醇式丙酮酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化路徑，促進葡萄糖向磷酸戊糖途徑分流，使代謝流更多地流向所需產(chǎn)物合成的方向。

1 材料與方法

1.1 植物材料

海南粗榧（Cephalotaxus mannii）外植體采自海南省儋州市熱帶植物園，愈傷組織從其嫩葉中誘導獲得（王成韜，2013）。

1.2 植物細胞培養(yǎng)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其中添加4 mg·L-1 萘乙酸、0.15 mg·L-1激動素、0.5 g·L-1聚乙烯吡咯烷酮、1 g·L-1酶水解酪蛋白以及35 g·L-1蔗糖、固體培養(yǎng)基中另外添加3 mg·L-1植物凝膠。用1 mol·L-1 NaOH 調(diào)節(jié)pH至5.8～6.0（王成韜，2013）。

海南粗榧愈傷組織在 26 ℃黑暗培養(yǎng)，每1個月傳代1次。取 500 mL 三角瓶裝 100 mL液體培養(yǎng)基，接種 8 g愈傷組織作為種子液，黑暗培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度（27±1）℃。種子液在使用前傳代三次，每12 d傳一代。接種時，用 250 mL三角瓶裝 80 mL液體，接種上述培養(yǎng)三代的植物細胞懸浮培養(yǎng)細胞約 6 g。

1.3 代謝抑制劑的制備與試驗設(shè)計

L-丙氨酸溶解于0.1%NaOH 溶液中， 使用前121 ℃高溫滅菌15 min。在海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)第15天，添加L-丙氨酸溶液，使 L-丙氨酸在培養(yǎng)基中終濃度為 10、30、50和100 mg·L-1，對照組中不添加，每個濃度設(shè)3個平行。測定細胞生物量、細胞活力、三尖杉酯類堿含量，確定合成三尖杉酯類堿的最佳濃度。分別在海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)第5、10、15、20天添加最佳濃度的 L-丙氨酸溶液，對照組中不添加，每個處理設(shè)3個平行。測定細胞生物量、細胞活力、三尖杉酯類堿含量，確定其最佳添加時間。在上述結(jié)果中最佳添加時間向海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)體系中添加最佳劑量的 L-丙氨酸溶液，在加入 L-丙氨酸后每隔3 d取樣測定培養(yǎng)液糖耗值，并在添加 L-丙氨酸后48 h，取樣測定海南粗榧懸浮細胞胞內(nèi)丙酮酸激酶、6-磷酸葡萄糖脫氫酶活力。

1.4 細胞活力的測定

用氯化三苯四氮唑（2，3，5-Triphenyltetrazolium Chloride， TTC）還原法測定。離心去上清液獲得約200 mg 新鮮植物細胞，加入3 mL TTC溶液（取0.6 g TTC溶于100 mL pH 7.5的0.5 mmol·L-1磷酸緩沖液中），25 ℃下反應24 h，吸去TTC，用蒸餾水清洗2～3次，收集細胞；加入3 mL 95%無水乙醇于60 ℃恒溫水浴10 min，以抽提酶反應生成的紅色甲臜，離心取上清液，冷卻，于492 nm 處測定其吸光值。細胞活力單位用每克濕細胞在492 nm處的吸光值來表示（OD·g-1）（DuBois et al，1956）。

1.5 培養(yǎng)液糖濃度測定

用苯酚-硫酸法測定懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基中殘?zhí)呛?，即離心獲得1 mL培養(yǎng)基上清液樣品加1 mL 5%（W/V）的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，混勻后在室溫下反應30 min，以葡萄糖標準液做標準曲線，在480 nm下測定其吸光度（Dacie et al，1992）。

1.6 丙酮酸激酶活力測定

（1）酶的提?。禾崛【彌_液組成為50 mmol·L-1Tris-HCl，pH7.5；1 mmol·L-1EDTA，15 mmol·L-1巰基乙醇，5 mmol·L-1 MgCl2，10%甘油，1%（w/v）不溶性PVP。先取200 mg左右的濕細胞，加1 mL提取緩沖液與少量石英砂，冰上研磨勻漿，然后在15 000 r·min-1離心20 min，取上清液待測。（2）酶活測定：測定液組成為25 mmol·L-1 Bis-tris-propane或25 mmol·L-1Mes-HCl，pH 6.5， 2 mmol·L-1 PEP，1 mmol·L-1 ADP，20 mmol·L-1 KCl， 10 mmol·L-1 MgCl2，0.15 mmol·L-1NADH， 1 mmol·L-1 DTT，5%PEG（8000），2 U·mL-1兔肌乳酸脫氫酶，測定液1.5 mL，酶提取液0.5 mL。加酶后立即測定OD340，1 min后測定OD340。以1 min內(nèi)消耗1 μmol NAD+所需的酶量定義為一個單位（U）。細胞酶活性用每克濕細胞的酶單位（U·g-1）來表示（Dacie，1984）。

1.7 G6PDH活力測定

（1）酶的提?。禾崛【彌_液組成為50 mmol·L-1，pH7.5， 15 mmol·L-1甘露醇，5 mmol·L-1 MgCl2，1%（w/v）PVP。先取200 mg左右的濕細胞，加1 mL提取緩沖液與少量石英砂，冰上研磨勻漿，然后在15 000 r·min-1離心20 min，取上清液待測。（2）酶活測定：測定液組成為50 mmol·L-1 Tris-HCl，pH7.5，5 mmol·L-1 MgCl2，3 mmol·L-1 6-磷酸葡萄糖二鈉鹽，100 μmmol·L-1 NADP-Na2。1.9 mL測定液，加0.1 mL酶提取液，30 ℃反應5 min，測定反應前后OD340的變化?？瞻讓φ找?.1 mL Tris-HCl代替。以反應前后每5 min吸光度變化0.01所需的酶量定義為一個單位（U）。細胞酶活性用每克濕細胞的酶單位（U·g -1）來表示（Yu et al，2004）。

1.8 三尖杉酯類堿的提取與測定

（1）胞內(nèi)產(chǎn)物提?。撼闉V收集濕細胞，60 ℃下干燥，加石英砂在研缽中研磨，20 mL甲醇浸泡24 h，在真空條件下濃縮至干，最后用1 mL甲醇復溶，并用0.22 μm濾膜過濾待測。（2）胞外產(chǎn)物提?。杭影彼{(diào)節(jié)培養(yǎng)液 pH至8.0左右，用三氯甲烷反復萃取3次，在真空條件下濃縮至干，最后用1 mL甲醇復溶，并用0.22 μm濾膜過濾待測。（3）測定：采用高效液相色譜法（HPLC），色譜條件為XDBC18（150 nm × 4.6 nm， 5 μm）色譜柱，進樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1，流動相為0.02 mol·L-1乙酸銨∶甲醇=55∶45，柱溫25 ℃，檢測波長為280 nm（Li，2014）。

1.9 統(tǒng)計分析

每個處理重復3次，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示。差異顯著性分析用Duncan 法進行多重比較，P<0.05視為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞生長的影響

糖酵解是葡萄糖代謝的主要途徑，為細胞生長提供所需的能量，L-丙氨酸是糖酵解途徑的抑制劑，理論上添加L-丙氨酸會抑制細胞的生長。如圖2：a所示，細胞生物量隨L-丙氨酸添加劑量的增加呈下降趨勢，隨抑制劑濃度的增加，抑制作用增強。

在添加時間方面（圖2：b），在不同生長時期添加L-丙氨酸對細胞生長抑制作用不同，對細胞生物量的影響隨L-丙氨酸添加時間的延后而減弱，第5天添加30 mg·L-1 L-丙氨酸時，生物量比對照（22.14 g·L-1）降低41.12%。綜上可知，L-丙氨酸對懸浮細胞生長的抑制作用是隨著其濃度的增大而增大。在培養(yǎng)后期添加，由于細胞生長已趨于穩(wěn)定，因此對細胞生長影響并不明顯。

2.2 L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞活力的影響

如圖3：a所示，添加不同濃度L-丙氨酸后，海南粗榧細胞活力均受到抑制，隨著L-丙氨酸添加濃度增加，抑制作用逐漸加強，在添加100 mg·L-1 L-丙氨酸時，對細胞活力抑制作用最大。在懸浮細胞不同生長時期添加L-丙氨酸如圖3：b所示，在第5天添加，對細胞活力的抑制作用最為明顯。說明添加過量抑制劑或者過早添加都會對植物細胞的初生代謝有傷害作用。

2.3 L-丙氨酸對三尖杉酯類堿合成的影響

分別測定海南粗榧中含量較高的三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿。由實驗結(jié)果可知，添加不同劑量的L-丙氨酸均能促進三尖杉酯類堿的合成，并且三尖杉酯類堿總量與對照相比均差異顯著（P<0.05），其中添加30 mg·L-1的L-丙氨酸可有效促進三尖杉酯堿的合成。添加時間方面（表2）， 15 d添加效果最佳。表2結(jié)果表明，在第15天添加30 mg·L-1 L-丙氨酸時，產(chǎn)物含量達到最高，獲得最佳產(chǎn)量的三尖杉酯類堿（4.853 6 mg·L-1），比對照組中三尖杉酯類堿含量（2.853 8 mg·L-1）高1.7倍。

2.4 L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞糖代謝的影響

2.4.1 L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)基糖耗程度的影響 添加L-丙氨酸后，培養(yǎng)基糖耗如圖4所示，在添加抑制劑后的第0天到第6天，植物細胞糖耗受到抑制最為顯著。在添加L-丙氨酸后第6天，培養(yǎng)基中殘余總糖含量為12.62 mg·mL-1，其平均耗糖速度與對照[1.67 mg·（mL·d）-1]相比下降了42.04%。但在接下來的6 d內(nèi)，經(jīng)處理后細胞的糖耗速度與對照相比顯著增加，最終，經(jīng)抑制劑處理后的培養(yǎng)基內(nèi)殘?zhí)呛颗c對照相比不顯著（P>0.05）。雖然添加L-丙氨酸后，細胞活性不同程度的出現(xiàn)了下降現(xiàn)象，但植物細胞培養(yǎng)液中，其糖耗速度并沒降低。這說明營養(yǎng)物質(zhì)可能從維持細胞生長的初生代謝轉(zhuǎn)向次生代謝。

2.4.2 L-丙氨酸對海南粗榧懸浮細胞丙酮酸激酶（PK）活力的影響 因為L-丙氨酸是通過抑制丙酮酸激酶的活性來抑制EMP途徑，調(diào)節(jié)海南粗榧懸浮細胞糖代謝，所以測定丙酮酸激酶活力研究其抑制效果。圖5顯示，添加抑制劑后，丙酮酸激酶活性明顯受到抑制（P<0.05） ，與對照（25.37 U·g-1）相比下降了29.10%。這表明添加L-丙氨酸后糖酵解途徑中磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）轉(zhuǎn)化為丙酮酸路徑受到抑制，得合成產(chǎn)物三尖杉酯類堿的前體物PEP積累。

2.4.3 L-丙氨酸對6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）活力的影響 6-磷酸葡萄糖脫氫酶（glucose 6-phosphate dehydrogenase， G6PDH）是糖代謝另一條重要途徑磷酸戊糖途徑（HMP）的關(guān)鍵酶，該途徑終產(chǎn)物赤蘚糖-4-磷酸（E4P）是三尖杉酯類堿合成的另一重要前體物。如圖6所示，在添加L-丙氨酸48 h后，G6DPH活力明顯高于對照組（P<0.05），是對照組G6PDH酶活力（53.49 U·g-1）的1.33倍。說明糖代謝途徑中碳通量在一定程度上由EMP途徑轉(zhuǎn)向了HMP途徑，并且三尖杉酯類堿合成的前體物PEP積累，E4P合成量增加。

3 討論與結(jié)論

近年來，對提高三尖杉酯類堿合成的研究中，較多采用的方法為添加誘導子（茉莉酸甲酯、水楊酸等）、前體物（苯丙氨酸，酪氨酸），優(yōu)化激素水平等（龍曉娟和李永成，2015；白雪芳等，1999；蔡長福，2007），以上方法均可在一定程度上促進三尖杉酯類堿的合成。本研究主要通過添加代謝抑制劑，調(diào)節(jié)糖代謝途徑，從而增加產(chǎn)物生物堿的產(chǎn)量。

使用抑制代謝旁路或相關(guān)代謝途徑的抑制劑后，可以使得代謝流更多地流向目標產(chǎn)物（董娟娥等，2009）。L-丙氨酸對海南粗榧產(chǎn)生的作用主要是通過抑制糖酵解途徑中關(guān)鍵酶丙酮酸激酶活性改變其代謝流，刺激次生代謝產(chǎn)物的合成。本研究表明，添加一定劑量的L-丙氨酸對海南粗榧產(chǎn)三尖杉酯堿和高三尖杉酯堿都有一定的促進作用。

本研究在細胞生長方面，L-丙氨酸對細胞生長和細胞活力都有不同程度的抑制作用，并且隨添加濃度的增加抑制作用增強。這是由于抑制糖酵解途徑，在一定程度上會影響細胞能量的供給，抑制細胞初生代謝。添加過量的抑制劑會因為三羧酸循環(huán)中缺乏碳流，導致細胞缺失能量，所以選擇合適的添加劑量非常重要。另外，第15天加入抑制劑時，細胞生長趨于穩(wěn)定期（陳林和李永成，2014），此時細胞生長趨于穩(wěn)定，次生代謝能力強，可在一定程度上抵御外界刺激，對細胞的生長與細胞活力抑制作用較小，有利于三尖杉酯類堿的合成。

本研究由三尖杉酯類堿合成途徑得知，由糖酵解途徑（EMP）產(chǎn)生的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和磷酸戊糖途徑（HMP）產(chǎn)生的4-磷酸赤蘚糖（E4P）是產(chǎn)物合成的限制性底物。在EMP途徑中，PK催化PEP轉(zhuǎn)化為丙酮酸。加入PK抑制劑L-丙氨酸后，PK活力與對照相比有所下降，這種轉(zhuǎn)化作用受到抑制，前體物PEP積累。G6DPH是磷酸戊糖途徑的限速酶，添加L-丙氨酸后，G6DPH活力高于對照，HMP途徑碳通量增加，E4P含量升高。并且，在添加抑制劑后，海南粗榧懸浮細胞耗糖與對照相比有一個先減慢后加快的趨勢，最終在海南粗榧懸浮細胞生長后期，經(jīng)抑制劑處理后的培養(yǎng)基內(nèi)殘?zhí)呛颗c對照無顯著差異。所以說，抑制了丙酮酸激酶活性后，改變了代謝流，使三尖杉酯類堿前體物PEP積累，E4P含量增加，二者縮合形成DAHP，代謝流在一定程度上被導向了莽草酸途徑，有利于三尖杉酯類堿的生物合成。

綜上所述，在海南粗榧懸浮細胞培養(yǎng)第15天添加代謝抑制劑30 mg·L-1 L-丙氨酸對海南粗榧產(chǎn)三尖杉酯類堿和高三尖杉酯類堿有較好的促進作用。

參考文獻：

BAI XF， WANG JM， BU CS， et al， 1999. Production of antitumoralkaloids from suspension cell culture of Cephalotaxus fortunei [J]. Chin J Biochem Pharm， 20：139-142. [白雪芳，王靖楣，卜宗式，1999.三尖杉懸浮細胞的培養(yǎng)及抗癌生物堿的產(chǎn)生 [J].中國生化藥物雜志， 20：139-142.]

CAI CF， 2007. The study of cell culture and metabolize of Cephalotaxus alkaloids of Cephalotaxus fortunei Hook.f. [C]. FuJian：Fujian Agriculture and Forestry University：43. [蔡長福，2007. 三尖杉細胞培養(yǎng)及其三尖杉酯類堿次生代謝的研究 [C]. 福建：福建農(nóng)林大學，43.]

CHEN HY， 1964. Flora of Hainan：Vol. 1 [M]. Beijing：Science Press：220. [陳煥鏞， 1964. 海南植物志：第1卷 [M].北京：科學出版社， 1964：220]

CHENG L， LI YC， 2014. Establishment of cell suspension culture system for Cephalotaxus mannii [J]. Guangdong Agric Sci，9（24）：54-59. [陳林，李永成， 2014. 海南粗榧細胞懸浮培養(yǎng)體系的建立 [J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學， 9（24）：54-59.]

CHENG YH， HUANG Q，1977. The resource utilization of Anticancer plant Cephalotaxu mannii in our country [J]. Chin Herb Med，6：14-17. [陳毓亨，黃全， 1977. 我國抗癌植物—三尖杉的資源利用 [J].中草藥通訊，6：14-17.]

DONG JE， ZHANG KJ，LIANG ZS，2009.Plant secondary metabolism and its regulation [M]. Yangling：North West Agriculture and Forestry University Press：147. [董娟娥，張康健，梁宗鎖， 2009. 植物次生代謝與調(diào)控 [M]. 西北農(nóng)林科技大學出版社：147.]

DUBOIS M， GILLES K， HAMILTON，et al，1956. Colorimetric method fordetermination of sugars and related substances [J]. Anal Chem， 28（3）：350-356.

FU LG， 1978. China higher plants：Vol. 7 [M]. Beijing：Science Press. [傅立國，1978. 中國高等植物：第7卷 [M]. 北京：科學出版社，1978.]

FU WY，DU DL，XING YW， 2003. Study on the protection and ex ploitation of Cephalotaxus mannii [J]. Mol Plant Breed，5（6）：795-799. [符文英，杜道林，邢詒旺， 2003. 海南粗榧保護和開發(fā)利用的研究 [J]. 分子植物育種，5（6）：795-799.]

GIBSON DM，KETCHUM REB，VANCE NC，et al，1993. Intiation and growth of cell lines of Taxus brevifolia [J]. Plant Cell Rep，12：479-482.

GITTERMAN A， PARRY RJ，DUFRESNE RF， et al， 1980. Biosynthesis of the cephalotaxus alkaloids. Investigations of the biosynthesis of deoxyharringtonine， isoharringtonine， and harringtonine [J]. J Amer Chem Soc， 102（6）：2074-2081.

IBORRA JL，GUARDIOLA J，MONTANER S，et al，1992. 2，3，5-Triphenyltetrazolium chloride as a viability assay for immobilized plant cells [J]. Biol Technol， 6：319-322.

LI YC， 2014. Enhanced cephalotaxine production in Cephalotaxus mannii suspension cultures by combining glycometabolic regulation [J]. Proc Biochem， 2279-2284.

LIU JP，DANG QF. 2006. Propagation of Cephalotaxus hainanensis Li by cutting [J]. Chin Trop Agric， 5：63. [劉進平，黨群帆，2006. 海南粗榧扦插繁殖技術(shù) [J]中國熱帶農(nóng)業(yè)，5：63.]

LIU JP， WU JJ， HUANG YL， et al， 2010. Surface sterilization and callus induction of stem explants of Cephalotaxus hainansis Li [J]. Trop Agric Sci Technol， 33：39-41. [劉進平，吳佳靜，黃艷麗，2010. 海南粗榧外植物滅菌與愈傷組織誘導 [J].熱帶農(nóng)業(yè)科技，33：39-41.]

LONG XJ， LI YC， 2015. Effect of elicitor on growth and cephalotaxus alkaloids accumulation of Cephalotaxus mannii Suspension cells [J]. Chin J Trop Crops， 36（6）：1125-1130. [龍曉娟， 李永成，2015.誘導子對海南粗榧細胞懸浮生長及三尖杉酯類堿合成的影響 [J].熱帶作物學報， 36（6）：1125-1130.]

PARRY RJ， CHANG MN， SCHWAB JM， et al， 1980. Biosynthesis of the cephalotaxus alkaloids. investigations of the early and late stages of cephalotaxine biosynthesis [J]. J Am Chem Soc， 102（3）：1099-1111.

STROHL WR， 2001. Biochemical engineering of nature product biosynthesis pathways [J]. Metab Eng， 3（1）：4.

WANG CT， 2013. Study on multiplication and browning in the callus culture of Cephalotaxus mannii [C]. Hainan：Hainan University：18. [王成韜，2013. 海南粗榧愈傷組織增殖及抗褐變研究 [D].海南：海南大學，18.]

WANG YS， 1990. Help the anticancer plant——Cephalotaxu mannii [J]. Plant J， 3：8-9. [王有生，1990.救救抗癌奇木——海南粗榧 [J].植物雜志，3：8-9.]

WILSON SA， ROBERTS SC，2012. Recent advances towards development and commercialization of plant cell culture processes for the synthesis of bimolecular [J]. Plant Biotechnol，10：249-268.

YE RF， WANG Q， ZHOU XF， 2009. Lincomycin， rational selection of high producing strain andimproved fermtation by amino acids supplementation [J]. Bioproc Biosyst Eng， 32：521-529.

YU LJ， LAN WZ， CHEN C， YANG Y， et al， 2004. Glutathione levels control glucose-6-phosphatede hydrogenase activity during elicitor-induced oxidative stress in cell suspension cultures of Taxus chinensis [J]. Plant Sci 167：329-35.

ZHOU ZQ， MEIXG， 2004. Progress in the research on production of taxol by taxus cell culture [J]. J S-Centr Univ Nat （Nat Sci Ed） ，23（1）：21-25. [周忠強，梅興國，2004.紅豆杉細胞培養(yǎng)生長紫杉醇的研究進展 [J].中南民族大學學報（自然科學版），23（1）：21-25.]