馮學珍 伍善廣 韋啟球 陸苑 裴世成

摘要： 該研究通過超聲輔助并采用醇沉、脫蛋白、脫色、干燥的方法，分別檢測低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度下的網地藻多糖對DPPH·自由基的清除能力，探討質量濃度和反應時間對網地藻多糖清除DPPH·自由基活性的變化規(guī)律。按照一級反應動力學方程和二級反應動力學方程分別建立反應動力學模型。結果表明：不同的質量濃度和反應時間對網地藻多糖清除DPPH·自由基活性均有影響，網地藻多糖質量濃度提高，其清除DPPH·自由基的能力逐漸加強，當網地藻多糖濃度為 0.5 mg·mL1時，反應20 min，網地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為86.06%，其清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。準一級動力學模型擬合的線性相關性較差，相關系數(shù)R2的范圍分別為0.848～0.891；準二級動力學模型擬合的相關系數(shù)R2的范圍為0.902～0.967，因此采用二級動力學擬合方程能較好地描述網地藻多糖對DPPH·自由基的清除能力。網地藻多糖在低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度時對DPPH·的二級反應的清除速率常數(shù)（k2）分別為0.011、0.054、0.421。這說明網地藻多糖隨著反應濃度逐漸升高其清除DPPH·自由基的速度越來越快，清除自由基能力也越來越強，結合IC50值來共同評價抗氧化能力，IC50值越小，反應速率值越大，表明其抗氧化活性越好，這與實驗得出的數(shù)據(jù)一致。

關鍵詞： 網地藻， DPPH·自由基， 抗氧化， 反應動力學

中圖分類號： Q946

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）05064706

Abstract： In order to study the kinetics of DPPH· free radical scavenging activity of Dictyota dichotoma polysaccharides， the polysaccharide was prepared which was extracted from Dictyotadichotoma by ultrasonicassisted technology， ethanol precipitation， deproteinization， decolorization and desiccation， and the effects of mass concentration and reaction time on DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides， low （0.1 mg·mL1）， medium （0.25 mg·mL1） and high （0.5 mg·mL1） concentrations were investigated. And the reaction kinetic model was established based on firstorder and secondorder reaction kinetic sequation， respectively. The mass concentration and reaction time significantly affected the DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides. Dictyotadichotoma polysaccharides of high concentration scavenged DPPH· was more quickly than that of lower concentration. The highest DPPH· scavenging rate of Dictyota dichotoma polysacharides was 86.06% when the mass concentration was 0.5 mg·mL1 and the reaction time was 20 minutes which half maximal inhibitory concentration（ IC50） was 0.25 mg·mL1. The fitting correlation coefficient （R2） of firstorder and secondorder reaction kinetics equation were 0.848-0.891 and 0.902-0.967， respectively， indicating that secondorder was better than firstorder model in representing DPPH· free radical scavenging activity of Dictyotadichotoma polysaccharides. The secondorder elimination rate constants （k2） for three different concentrations （0.1， 0.25 and 0.5 mg·mL1） of Dictyotadichotoma polysaccharides were 0.011， 0.054， 0.421， respectively. In conclusion， the scavenging ability of Dictyotadichotoma polysaccharides to DPPH· was stronger when its concentration was higher， and the scavenging ability of Dictyotadichotoma polysaccharides to DPPH· was evaluated by elimination rate constants （k2） and half maximal inhibitory concentration（IC50）. The activity of antioxidative was better and better when k2 was bigger and bigger and IC50 was smaller and smaller， which conformed the results of experiments.

Key words： Dictyota dichotoma， DPPH·， antioxidation， reaction kinetics

網地藻（Dictyota dichotoma）是褐藻門、褐藻綱、網地藻目、網地藻科、網地藻屬的一種海洋藻類。主要生長在熱帶、亞熱帶的海洋中，溫帶海岸低潮帶也有，我國各沿海均有分布。廣西北部灣海域地處熱帶和亞熱帶，資源環(huán)境較好，所盛產的海洋藻類有十幾種，網地藻為其一（鄧家剛等，2008）。海藻多糖是一類多組分的海洋多糖類物質，因其來源于海洋，加之海藻多糖具有抗炎、抑菌、抗氧化等藥理活性，成為目前海洋藥物研究的熱點之一（韓玲等，2012；周慶峰等，2009；吳淳濤等，2011）。關于網地藻的研究主要集中于對其化學成分（宋福行等，2006）和抑菌藥理活性（鄭怡等，2004）的研究，其它領域相對較少。本研究在課題組前期研究的基礎上（馮學珍等，2014，2013），對網地藻多糖的抗氧化活性進行了初步研究，為開發(fā)天然抗氧化劑奠定基礎。

抗氧化活性的測定方法較多（穆楠等，2010；趙慧芳等，2011），其中DPPH·是一種相對較穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，具有較強還原能力，可與抗氧化劑反應以檢測其抗氧化能力，因其測定方法簡便易行、靈敏度高、重現(xiàn)性好，成為目前常用的抗氧化活性檢測方法之一（趙慧芳等，2011； Zhang et al，2016）。DPPH·自由基在乙醇溶液中顯紫色，當與抗氧化劑反應時其顏色會減退，褪色程度與抗氧化劑的抗氧化能力及數(shù)量呈定量關系，且不同抗氧化劑對DPPH·自由基反應的速率存在差異（Zhang et al，2016；GrajedaIglesiasa et al，2016）。本研究采用DPPH·自由基檢測網地藻多糖的抗氧化能力，并對其清除DPPH·自由基的反應動力學進行了探討。

1材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料供試的網地藻于2013年采自廣西北部灣海域，經中國科學院南海海洋研究所雷新明博士鑒定為鹿角網地藻（Dictyota cervicornis），經水洗、干燥后備用；1，1二苯基2三硝基苯肼（DPPH·）（分析純，Sigma公司）；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器1901型雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；DL180J智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司）；RE52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；臺式離心機TDL5A（飛鴿）；AL104電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DPPH·標準曲線繪制準確配制質量濃度為0.05 mg·mL1的DPPH·標準母液，無水乙醇稀釋倍數(shù)為1/2、1/3、1/4、1/5、1/6的DPPH·溶液，于517 nm處測定其吸光度。以濃度（x）為橫坐標，吸光度A（y）為縱坐標繪制標準曲線（趙慧芳等，2011；Zhang et al， 2016；GrajedaIglesiasa et al， 2016）。

1.2.2 網地藻多糖樣品的制備將干燥后的網地藻粉末稱重，乙醇浸泡過夜揮干，加30倍蒸餾水，75 ℃，pH 7.0超聲（功率200 W）提取30 min，離心，濃縮，80%乙醇沉淀，靜置過夜，沉淀干燥稱重。Sevage法脫蛋白（潘雪豐，2015），活性炭脫色，乙醇沉淀，無水乙醇、丙酮、無水乙醚反復洗滌，干燥即得網地藻多糖的樣品粉末（馮學珍等，2014）。

1.2.3 網地藻多糖清除DPPH·自由基清除曲線的繪制將樣品粉末用無水乙醇配制成高（0.5 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、低（0.1 mg·mL1）三個質量濃度的樣品液，每個質量濃度配制三份樣品液，離心后取樣品液2 mL，加入0.025 mg·mL1的DPPH·溶液2 mL，混勻后在30 ℃反應20 min，采用動力學監(jiān)測法于517 nm處測定不同時間的吸光度A（趙慧芳等，2011；Zhang et al，2016；GrajedaIglesiasa et al，2016），直至吸光度基本不變?yōu)橹?。同時用無水乙醇作參比測定吸光度，按照以下公式計算清除率（馮學珍等，2013； Zhang et al，2016），以反應時間為橫坐標，DPPH·自由基清除率（%）為縱坐標繪制不同質量濃度的樣品溶液的清除率與時間反應的曲線。

清除率（%）= [1-（Ai-Aj）/A0] ×100（式1）

式1中，Ai： 2 mL樣品液+2 mL DPPH·的吸光度；Aj： 2 mL樣品液+2 mL無水乙醇的吸光度；A0： 2 mL無水乙醇+2 mL DPPH·的吸光度。

1.2.4 網地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測定

配制系列濃度的網地藻多糖溶液作為樣品液，按照1.2.3的測定方法計算清除率，以網地藻多糖的質量濃度為橫坐標，清除率為縱坐標繪圖，以測定網地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)抑制率（IC50）（Zhang et al，2016）。

1.2.5 網地藻多糖清除DPPH·自由基活性的反應動力學研究

根據(jù)1.2.3的DPPH·自由基的清除曲線，按照以下反應動力學方程建立反應動力學模型（Simonin，2016）。

一級反應動力學方程式：

lnCt/C0=-k1t（式2）

式2中，DPPH·剩余率=Ct/C0×100%；清除率a=1-DPPH·剩余率=（1-Ct/C0） ×100%。

因此，Ct/C0=1-a，代入式（2），則有一級反應動力學方程式：

ln（1-a） = -k1t

二級反應動力學方程式：

1/Ct = k2 t +1/C0（式3）

將Ct = C0*（1-a）， 代入上式（3），則有二級反應動力學方程式：

1/1-a=k2C0t-1

式中，C0表示DPPH·自由基在t=0時的濃度（mg·mL1）；Ct表示DPPH·自由基在t min時的濃度（mg·mL1）；a表示DPPH·自由基清除率；k1表示擬一級反應速率常數(shù)（min1）； k2表示擬二級反應速率常數(shù)（mg·mL1·min1）。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理方法采用Origin 8.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計、計算和分析。

2結果與分析

2.1 DPPH·標準曲線的繪制

按照1.2.1的方法繪制標準曲線，結果見圖1，其回歸方程y=43.79x，R2=0.999（極顯著相關），在0.008～0.025 mg·mL1范圍內DPPH·自由基濃度與吸光度之間有較好的線性關系。

2.2 網地藻多糖對DPPH·自由基的反應動力學曲線

高、中、低三個不同質量濃度的樣品溶液清除DPPH·自由基的活性曲線見圖2。由圖2可見，隨著網地藻多糖質量濃度的不斷提高，其清除DPPH·自由基的能力逐漸加強，表明在一定范圍內網地藻多糖清除DPPH·自由基的能力與其濃度呈明顯的量效關系，高濃度情況下網地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高，為86.06%，低濃度情況下網地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為24.01%，這是由于高濃度的網地藻多糖含有的抗氧化功能集團（羥基、酚羥基）多于低濃度的網地藻多糖，能更有效地清除自由基。

由圖2還可見，不同質量濃度的樣品溶液清除DPPH·自由基的反應達到平衡的時間也不相同，高、中、低三種濃度下反應達到平衡的時間為12.4、14.2、17.4 min，高濃度條件下反應清除速度比低濃度下快，因此要探討質量濃度和反應時間對網地藻多糖清除DPPH·自由基活性的變化規(guī)律。

2.3 網地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測定

由圖3可見，清除率隨網地藻多糖質量濃度的增加逐漸增高，當網地藻多糖濃度為5.0 mg·mL1時，清除率可達到88%，之后隨著網地藻多糖質量濃度的增加，清除率緩慢增加，之后基本保持不變，由圖3可推測網地藻多糖清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。

2.4 網地藻多糖清除DPPH·自由基活性的反應動力學研究

由圖2可知，在一定時間內，測試液中網地藻多糖清除DPPH·自由基清除率與其反應時間呈正相關，因此可用DPPH·清除率隨時間t的變化規(guī)律來表示網地藻多糖的抗氧化活性隨時間t的變化規(guī)律。假定網地藻清除DPPH·自由基的清除率對時間的變化規(guī)律符合準一級反應動力學方程式。以ln（1-a）（y）為縱坐標，以時間t（x）為橫坐標，繪制標準曲線，即得出準一級反應動力學方程式，低濃度下的準一級反應動力學方程為y = -0.009x-0.128，R2 = 0.891；中濃度下的準一級反應動力學方程為y = -0.029x - 0.328，R2= 0.872；高濃度下的準一級反應動力學方程為y = -0.088x - 0.686，R2=0.848，見圖4所示，相應的動力學參數(shù)見表1。

假設網地藻清除DPPH·自由基的清除率對時間的變化規(guī)律符合準二級反應動力學方程式。以1/（1-a）（y）為縱坐標，以時間t（x）為橫坐標，繪制標準曲線，即得出準二級反應動力學方程式，低濃度下的準二級反應動力學方程為y = 0.011x + 1.135，R2 = 0.902；中濃度下的準二級反應動力學方程為y = 0.054x + 1.355，R2 = 0.918；高濃度下的準二級反應動力學方程為y = 0.054x + 1.355，R2 = 0.918，見圖5所示，相應的動力學參數(shù)見表1。

由表1可知，準一級動力學模型擬合的線性相關性較差，相關系數(shù)R2為0.848～0.891。而用準二級動力學模型進行擬合，其相關系數(shù)R2為0.902～

0.967，網地藻多糖對DPPH·的清除作用說明符合準二級動力學方程。通過準二級動力學擬合方程計算出在實驗條件下，網地藻多糖初始濃度分別為0.1、0.25、0.5 mg·mL1時，網地藻多糖對DPPH·的清除作用二級動力學速率常數(shù)分別為0.011、0.054、0.421。二級反應速率常數(shù)通常被認為與抗氧化物質的自由基清除能力有關，速率常數(shù)越大，即清除反應的速率越快，因此網地藻多糖隨著濃度的逐漸升高清除DPPH·自由基的速度越來越快，其清除自由基能力也越來越強，這與實驗所得的數(shù)據(jù)一致。

3討論與結論

海藻多糖清除DPPH·自由基活性的研究報道有草葉馬尾藻多糖（張朝燕，2012）、羽藻和刺松藻多糖（宋厚芳，2010）等，也有研究者報道了多種天然藥物中多糖類物質清除DPPH·自由基活性的研究，如刺五加多糖（孟繁磊等，2010）、青錢柳多糖（葛霞等，2011）、荷葉多糖（涂宗財?shù)龋?013）等，多糖清除DPPH·自由基活性的研究大多是對DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）的測定，沒有進行清除動力學的研究，本研究采用IC50值結合反應速率來共同評價多糖清除DPPH·自由基活性的能力，為開發(fā)天然抗氧化劑提供數(shù)據(jù)支持。

本研究采用超聲輔助提取網地藻多糖，采用醇沉，脫蛋白，脫色，干燥的方法制備網地藻多糖的樣品粉末。分別檢測了低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度下的網地藻多糖對DPPH·自由基的清除能力，當網地藻多糖濃度為 0.5 mg·mL1時，反應20 min，網地藻多糖清除DPPH·自由基的清除率最高為86.06%，因此網地藻多糖具有一定的抗氧化能力，其清除DPPH·自由基活性半數(shù)清除率（IC50）為0.25 mg·mL1。按照反應動力學方程建立反應動力學模型，結果表明二級動力學擬合方程能較好地描述網地藻多糖對DPPH·自由基的清除能力，其相關系數(shù)R2的范圍為0.902～0.967。網地藻多糖在低（0.1 mg·mL1）、中（0.25 mg·mL1）、高（0.5 mg·mL1）三種濃度時，對DPPH·的清除速率常數(shù)分別為 0.011、0.054、0.421。說明網地藻多糖隨著濃度的逐漸升高其清除DPPH·自由基的速度越來越快，其清除自由基能力也越來越強。IC50值越小，反應速率值越大，說明其抗氧化活性越好，因此網地藻多糖比草葉馬尾藻多糖、羽藻和刺松藻多糖具有更好的抗氧化活性（張朝燕，2012；宋厚芳，2010），有望將其開發(fā)為一種天然的抗氧化劑。

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