林輝鋒 陳昌銘 尚偉 林發(fā)壯 夏朝水 周輝明

摘要[目的]建立石橄欖種子無(wú)菌播種和快速繁殖技術(shù)體系。[方法]以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度6-BA、NAA、有機(jī)添加物，篩選適宜的誘導(dǎo)、增殖及壯苗生根培養(yǎng)基組合。[結(jié)果]以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L為石橄欖種子最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基，14 d可見種子萌動(dòng)，45 d可分化形成叢生幼苗；以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L為最佳增殖培養(yǎng)基，其增殖倍數(shù)可達(dá)2.750倍，假鱗莖形成率達(dá)24.5%；以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L為最佳壯苗生根培養(yǎng)基，苗高可達(dá)3.82 cm，根數(shù)1.9條。[結(jié)論]該研究為石橄欖野生種質(zhì)資源保護(hù)、快速繁育優(yōu)質(zhì)種苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞石橄欖；無(wú)菌播種；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0161-02

Study on Aseptic Sowing and Rapid Propagation Technology for Pholidota chinensis Lindl. Seed

LIN Huifeng， CHEN Changming， SHANG Wei， ZHOU Huiming* et al（Sanming City Agricultural Science Research Academy，Sanming，F(xiàn)ujian 365051）

Abstract[Objective] To establish a system of aseptic sowing and rapid progagation technology for Pholidota chinensis Lindl..[Method]Different concentrations 6BA， NAA， organic additives were added to MS medium to screen the suitable induction， proliferation and strong seedling and rooting medium. [Result]The proper medium for the seeds induction of P. chinensis Lindl. was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L + coconut juice 50 mL/L， seed germination was observed on 14 days，the differentiation and formation of clusters of seedlings were observed on 45 days；the best multiplication medium was MS medium containing 6BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+coconut juice 50 mL/L，proliferation times 2.750，the pseudobulb formation rate up to 24.5%； the best seedling rooting medium was 1/2MS medium containing NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L，plant length up to 3.82 cm，root number 1.9.[Conclusion]The study laid a foundation for the conservation of wild germplasm resources and rapid breeding of high quality seedling.

Key wordsPholidota chinensis Lindl.；Aseptic sowing；Tissue culture

石橄欖學(xué)名石仙桃（Pholidota chinensis Lindl.），系蘭科石仙桃屬多年生附生草本植物，在李時(shí)珍的《本草綱目》中有詳細(xì)記載，其具清熱養(yǎng)陰、化痰止咳、潤(rùn)肺生津、利濕、消瘀等藥用功效，可應(yīng)用于頭痛、眩暈、肺熱咳嗽、火郁胃痛、熱痹、夢(mèng)遺、熱淋、胃火牙痛、虛火喉痛等癥狀治療，由于其藥效廣泛，人們習(xí)稱為“仙桃”[1]。其提取物制成的單方制劑——頭痛定糖漿，為國(guó)家準(zhǔn)字號(hào)藥品，臨床上用于治療神經(jīng)機(jī)能性頭痛、腦震蕩后遺癥，療效明顯，年產(chǎn)值達(dá)1 500萬(wàn)元。在民間，石仙桃作為一種藥食兩用的食材有清疏肺熱、肝火，養(yǎng)陰生津的功效，是煲湯的常用材料。藥用石橄欖多數(shù)為野生資源，而野生石橄欖資源再生緩慢，其種子在自然狀況下極難萌發(fā)，如依靠分株繁殖，則繁育周期較長(zhǎng)，繁殖率極低，遠(yuǎn)不能滿足規(guī)模化生產(chǎn)需求，且當(dāng)前市場(chǎng)上的石橄欖品質(zhì)參差不齊。利用組織培養(yǎng)方法繁殖石橄欖，可有效地穩(wěn)定其品性，增加繁殖系數(shù)，縮短培育周期，從而彌補(bǔ)石橄欖野生種質(zhì)資源嚴(yán)重不能滿足市場(chǎng)需求的不足，達(dá)到對(duì)石橄欖野生種質(zhì)資源保護(hù)的目的。

在石橄欖相關(guān)的組培快繁上，未見有系統(tǒng)的研究報(bào)道，僅王蓮輝等[2]以尖葉石仙桃蒴果內(nèi)的種子為材料研究了尖葉石仙桃的胚培養(yǎng)與快速繁殖，但其選用的尖葉石仙桃產(chǎn)地未描述。福建藥用石橄欖以細(xì)葉石仙桃和石仙桃為主[3-4]，其組培快繁研究未見報(bào)道。筆者以石橄欖種子作為外植體，通過(guò)不同有機(jī)添加物種類、不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、不同基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分研究，篩選適宜的誘導(dǎo)、增殖及壯苗生根培養(yǎng)基配方，從而縮短快繁周期，以期為石橄欖的產(chǎn)業(yè)化栽培提供優(yōu)質(zhì)種苗。

1材料與方法

1.1材料

外植體材料為采自于三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植物園的成熟未開裂石橄欖蒴果。

1.2方法

1.2.1種子消毒。

用棉花蘸取洗潔精將蒴果表面清洗干凈，在自來(lái)水下沖洗20 min左右，無(wú)菌條件下，72%乙醇處理45 s，無(wú)菌水清洗3遍，用0.1%HgCl2浸泡消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，無(wú)菌濾紙吸干。用手術(shù)刀將消毒好的蒴果切開，將種子撒到裝有無(wú)菌水的錐形瓶中，搖勻，每瓶接種1 mL。

1.2.2培養(yǎng)條件。

使用200 mL廣口瓶為培養(yǎng)容器（下同），每瓶加入30 mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L、瓊脂粉5 g/L，pH 5.6，培養(yǎng)溫度（25±1）℃，光照強(qiáng)度2 000 lx。

1.2.3無(wú)菌播種初代誘導(dǎo)培養(yǎng)。

以MS為基本培養(yǎng)基，將用無(wú)菌水懸浮稀釋消毒后的種子，接種于添加不同激素的MS萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基配方為①M(fèi)S；②MS+椰子汁50 mL/L；③ MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L；④MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L；⑤MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+香蕉泥 50 g/L；⑥MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+活性炭（AC）1 g/L，觀察不同培養(yǎng)基對(duì)種子萌發(fā)的影響。

1.2.4增殖培養(yǎng)。

以MS添加50 mL/L椰子汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，設(shè)置6-BA（0、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/L）和NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L）2因素5水平試驗(yàn)，增殖培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)植株假鱗莖形成率和種苗增殖倍數(shù)。植株假鱗莖形成率=統(tǒng)計(jì)時(shí)植株帶假鱗莖數(shù)/統(tǒng)計(jì)時(shí)植株數(shù)×100%；種苗增殖倍數(shù)=統(tǒng)計(jì)時(shí)植株數(shù)/接種時(shí)種苗數(shù)。

1.2.5壯苗生根培養(yǎng)及煉苗移栽。

以1/2MS添加1 g/L AC為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度NAA（0、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L），壯苗生根培養(yǎng)30 d，統(tǒng)計(jì)苗高、根數(shù)。將生根好的植株先放在溫室大棚煉苗4 d，揭開瓶蓋繼續(xù)煉苗3 d，洗凈培養(yǎng)基，用稀釋800倍的甲基硫菌靈浸泡10 min后，移栽于珍珠巖∶沙土=1∶1的基質(zhì)中，保持空氣濕度75%以上，環(huán)境溫度18～28 ℃。

1.3統(tǒng)計(jì)分析方法采用DPS數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)菌播種初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

石橄欖種子較小，45 d后可形成幼苗。無(wú)菌初代培養(yǎng)需散光，培養(yǎng)14 d時(shí)，可見種子有綠色萌動(dòng)，在培養(yǎng)0～21 d時(shí)，處理⑥中的種子萌動(dòng)較好，培養(yǎng)22～45 d時(shí)幼苗長(zhǎng)勢(shì)較弱；處理④在培養(yǎng)0～21 d時(shí)萌動(dòng)較為緩慢，培養(yǎng)22～45 d時(shí)長(zhǎng)勢(shì)快且好；處理⑤種子萌動(dòng)無(wú)論前期還是后期均表現(xiàn)弱勢(shì)；處理①和②種子萌動(dòng)

無(wú)論是前期還是后期長(zhǎng)勢(shì)均相當(dāng)，處理③較之種子萌動(dòng)長(zhǎng)勢(shì)弱。試驗(yàn)結(jié)果表明，以處理④（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+椰子汁50 mL/L）為石橄欖種子誘導(dǎo)培養(yǎng)基最佳。

2.2石橄欖的增殖培養(yǎng)

將初代誘導(dǎo)培養(yǎng)出的石橄欖種苗接種于各增殖培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示6-BA和NAA對(duì)石橄欖增殖影響較大，從石橄欖種苗假鱗莖形成率來(lái)看，6號(hào)培養(yǎng)基中表現(xiàn)最高（40.6%），但其增殖倍數(shù)不高，說(shuō)明低濃度的NAA能夠促進(jìn)石橄欖假鱗莖的形成。從6-BA和NAA對(duì)石橄欖種苗增殖倍數(shù)影響來(lái)看，在6-BA為1.0 mg/L、NAA為0.1 mg/L時(shí)，表現(xiàn)最好，達(dá)2.750倍，其假鱗莖形成率雖然只有24.5%，但其形成數(shù)與6號(hào)培養(yǎng)基上的表現(xiàn)相當(dāng)。由表1可知，高濃度的6-BA（2.0、4.0 mg/L）和高濃度的NAA（0.4、0.8 mg/L）組合抑制了假磷莖的形成且增殖倍數(shù)較低，種苗矮小。研究認(rèn)為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰子汁50 mL/L為最佳增殖培養(yǎng)基。

2.3石橄欖壯苗生根培養(yǎng)及馴化移栽

由表2可知，相比沒(méi)有添加NAA的對(duì)照，添加NAA對(duì)石橄欖生根無(wú)顯著差異，而對(duì)石橄欖壯苗影響上，以低濃度0.1 mg/L為極顯著差異。其中以1/2MS+NAA 0.1 mg/L+AC 1 g/L為最佳壯苗生根培養(yǎng)基，表現(xiàn)為當(dāng)帶假鱗莖石橄欖植株接種于壯苗生根培養(yǎng)基后，14 d即有新根長(zhǎng)出，30 d后生根數(shù)可達(dá)1.9條，苗高 3.82 cm。煉苗移栽是將生根植株煉苗7 d，用稀釋800倍的甲基硫菌靈浸泡10 min后，移栽于珍珠巖∶沙土=1∶1的基質(zhì)中，保持空氣濕度75%以上，環(huán)境溫度18～28 ℃，成活率

3討論

石橄欖系蘭科石仙桃屬多年生附生草本植物，其種子較小，在自然狀況下極難萌發(fā)，因此種子無(wú)菌播種萌發(fā)和植株形成研究極為重要。前人在對(duì)蘭科種子無(wú)菌播種和快速繁殖研究上，發(fā)現(xiàn)適宜的外源激素添加通過(guò)降低其促萌發(fā)的內(nèi)源激素含量引起種子萌發(fā)[5]。同時(shí)，有機(jī)添加物因其富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，具有為植物生長(zhǎng)提供一些生理活性物和補(bǔ)充未知微量成分的作用，已有運(yùn)用于蘭科植物的研究[6]。通過(guò)研究基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加外源激素、香蕉泥、椰子汁和活性炭組合發(fā)現(xiàn)，椰子汁比香蕉泥更易于石橄欖種子萌發(fā)和幼苗形成，同時(shí)，結(jié)合外源激素添加更能促進(jìn)石橄欖種子萌動(dòng)，促進(jìn)細(xì)胞分裂和幼苗分化。雖然活性炭對(duì)于石橄欖種子前期的萌動(dòng)有促進(jìn)作用，但是后期的幼苗分化能力較為不足，可能是由于活性炭能夠提供暗環(huán)境和吸附培養(yǎng)基中有害物質(zhì)（如醌類化合物）的同時(shí)，也能吸附離體培養(yǎng)中的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物和一些有益的營(yíng)養(yǎng)物[7]。

在石橄欖的增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在基本培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素6-BA和生長(zhǎng)素NAA組合起到關(guān)鍵性作用。適宜濃度的6-BA和低濃度的NAA組合能夠促進(jìn)植物側(cè)芽形成、分化和增殖，這可能是因?yàn)槭蠙煸鲋撤N苗內(nèi)源激素較低，需外源添加適宜的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑促進(jìn)其側(cè)芽的形成、分化和增殖。但當(dāng)6-BA濃度較高和NAA濃度較高時(shí)，都不利于側(cè)芽的形成、分化和增殖，這可能是由于石橄欖增殖種苗在增殖培養(yǎng)過(guò)程中吸收并累積過(guò)多外源激素所致。因此，石橄欖在側(cè)芽形成、分化和增殖過(guò)程中，6-BA和NAA存在交互作用，這與許多植物組織培養(yǎng)報(bào)道結(jié)果一致[8]。此外，在植物組織培養(yǎng)階段，假鱗莖的形成有利于植物壯苗生根，進(jìn)而提高種苗質(zhì)量和移栽成活率。研究發(fā)現(xiàn)低濃度的NAA有利于植株假鱗莖的形成，而高濃度下假鱗莖形成數(shù)較少，適宜濃度的6-BA和NAA組合有利于促進(jìn)植物側(cè)芽形成、分化和增殖以及植株假鱗莖的形成。

該研究以石橄欖種子為外植體，研究不同濃度6-BA、NAA、有機(jī)添加物組合，篩選了適宜的誘導(dǎo)、增殖及壯苗生根培養(yǎng)基配方，建立了一套石橄欖種子無(wú)菌播種和快速繁殖技術(shù)體系，對(duì)于石橄欖野生種質(zhì)資源保護(hù)、繁殖周期縮短、供應(yīng)優(yōu)質(zhì)種苗具有重要意義。

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