劉凱 謝楠 馬恒甲 姚桂桂

摘要[目的]研究不同抗凝劑對鯽魚外周血的抗凝效果。[方法]以鯽魚“中科3號(hào)”為研究對象， 比較5種抗凝劑對鯽魚外周血的抗凝效果，探討其適宜抗凝劑品種和有效抗凝濃度。[結(jié)果]除了L-半胱氨酸在試驗(yàn)條件下不能作為有效抗凝劑外，其余4種抗凝劑延長血液凝固時(shí)間均在61.43 min以上。肝素鈉、檸檬酸鈉、草酸鉀和EDTA的有效抗凝濃度分別為（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL。顯微鏡下，肝素鈉、檸檬酸鈉、草酸鉀和EDTA 4種抗凝劑均能較好地維持鯽魚外周血細(xì)胞的形態(tài)。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為鯽魚外周血抗凝劑的應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞鯽魚； 外周血； 抗凝劑；抗凝效果

中圖分類號(hào)S965.117文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0115-02

Study on the Anticoagulation Effect of Different Anticoagulants on Peripheral Blood of Crucian Carp

LIU Kai，XIE Nan，MA Hengjia et al （Hangzhou Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou，Zhejiang 310024）

Abstract[Objective] To study the anticoagulation effect of different anticoagulants on peripheral blood of crucian carp.[Method] Using crucian carp cultivar “Zhongke No.3” as research object，the anticoagulation effects of five kinds of anticoagulants on peripheral blood of crucian carp were compared.The suitable kind of anticoagulant and its effective concentration for peripheral blood of crucian carp were discussed.[Result] Under these test conditions，except for Lcysteine，other four kinds of anticoagulants could prolong the blood coagulation time more than 61.43 min.The effective anticoagulation concentrations of heparin sodium，sodium citrate，potassium oxalate and EDTA were （0.80±0.17），（1.42±0.14），（1.17±0.14） and （2.33±0.58） mg/mL respectively.Under the microscope，the hemocyte morphology of peripheral blood in crucian carp treated with heparin sodium，sodium citrate，potassium oxalate and EDTA could be well maintained.[Conclusion] The research can provide references for the application of anticoagulants for peripheral blood of crucian carp.

Key wordsCrucian carp；Peripheral blood；Anticoagulant；Anticoagulation effect

動(dòng)物血液中血細(xì)胞隨著血液的循環(huán)流動(dòng)，執(zhí)行著許多生理功能，在氣體運(yùn)輸、機(jī)體免疫和凝血過程中起著重要作用。若要分離出血細(xì)胞，試驗(yàn)中就需要使用抗凝劑。然而，關(guān)于鯽魚外周血的適宜抗凝劑種類和有效抗凝濃度的研究報(bào)道較少。筆者以鯽魚“中科3號(hào)”為研究對象，比較5種抗凝劑對鯽魚外周血的抗凝效果，探討適合鯽魚外周血的抗凝劑種類及有效抗凝濃度，以期為鯽魚外周血抗凝劑的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料試驗(yàn)用鯽魚“中科3號(hào)”采自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院水產(chǎn)研究所，魚體健康，體重400～450 g；草酸鉀、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）和肝素鈉均為國產(chǎn)分析純，L-半胱氨酸為生化試劑（含量>98.5%）。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)共選用5種抗凝劑（草酸鉀、檸檬酸鈉、乙二胺四乙酸二胺、肝素鈉、L-半胱氨酸），根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果將每種抗凝劑均設(shè)置5個(gè)濃度梯度，所有抗凝劑均用0.1 mol/L PBS作為溶劑。

用1 mL的無菌注射器先吸取0.1 mL抗凝劑，再從鯽魚尾部側(cè)線鱗上方插入，從尾部靜脈抽取0.4 mL外周血，混合均勻后，立即注入聚乙烯離心管中。自血液進(jìn)入注射器時(shí)立即開始計(jì)時(shí)，此后每隔15 min輕輕傾斜離心管1次，觀察血液是否流動(dòng)，當(dāng)血液不能流動(dòng)時(shí)停止計(jì)時(shí)，即為血液凝固時(shí)間。每個(gè)抗凝劑濃度重復(fù)3次，血液凝固時(shí)間取3次重復(fù)的平均值。以0.1 mol/L PBS為對照組，以3.7%甲醛固定的外周血細(xì)胞作為形態(tài)對照。

按照以下公式計(jì)算抗凝劑延長血液凝固時(shí)間：抗凝劑延長血液凝固時(shí)間=試驗(yàn)組凝固時(shí)間-對照組凝固時(shí)間。以能延長血液凝固時(shí)間1 h以上并經(jīng)顯微鏡檢查血細(xì)胞形態(tài)完整的抗凝劑作為鯽魚的有效抗凝劑，其對應(yīng)的最低濃度即為該抗凝劑對鯽魚的最低有效濃度。

2結(jié)果與分析

以0.1 mol/L PBS為對照組，鯽魚外周血凝固時(shí)間為（1.43±0.40） min，因此在該試驗(yàn)條件下若試驗(yàn)組抗凝劑延長血液凝固時(shí)間在61.43 min以上，則視為有效抗凝劑。

由表1可知，除了L-半胱氨酸不能作為有效抗凝劑外，其余4種抗凝劑延長血液凝固時(shí)間均在61.43 min以上，肝素鈉、檸檬酸鈉、草酸鉀和EDTA的有效抗凝濃度分別為（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL。用3.7%甲醛固定的鯽魚外周血細(xì)胞絕大部分為圓形、橢圓形及梭形等，細(xì)胞形態(tài)完整。肝素鈉、檸檬酸鈉、草酸鉀和EDTA 4種抗凝劑也均能較好地維持鯽魚外周血細(xì)胞的形態(tài)，無細(xì)胞破裂現(xiàn)象（圖1）。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)肝素鈉、檸檬酸鈉、草酸鉀和EDTA的濃度分別達(dá)到（0.80±0.17）、（1.42±0.14）、（1.17±0.14）和（2.33±0.58） mg/mL時(shí)，均可作為鯽魚“中科3號(hào)”的抗凝劑。李義[1]和張峰等[2]研究表明，肝素鈉、檸檬酸鈉、EDTA等也可作為日本沼蝦和刺參的抗凝劑。張明輝等[3]研究表明肝素鈉、檸檬酸鈉、EDTA等不適宜作為中華絨螯蟹的抗凝劑。該試驗(yàn)結(jié)果表明，肝素鈉、檸檬酸鈉、EDTA等在大多數(shù)情況下可作為生物的有效抗凝劑。對少數(shù)物種而言，由于血液凝固機(jī)制的差異或其他原因造成現(xiàn)有抗凝劑的失效。該試驗(yàn)結(jié)果表明，肝素鈉、檸檬酸鈉、EDTA等抗凝劑對不同品種鯽魚外周血的有效抗凝劑量也存在差異，如彭澤鯽的有效抗凝濃度顯著高于“中科3號(hào)”，這可能與魚的體重、生理狀態(tài)等有關(guān)。

肝素鈉抗凝的主要機(jī)制在于它能結(jié)合血漿中的抗凝蛋白，從而阻止血液凝固[4]。用肝素鈉抗凝時(shí)，當(dāng)肝素鈉濃度未達(dá)到有效濃度時(shí)，肝素鈉無法充分結(jié)合血漿中的抗凝蛋白，則無法起到抗凝作用。用肝素鈉抗凝時(shí)發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間內(nèi)肝素鈉抗凝細(xì)胞凝集現(xiàn)象明顯，長時(shí)間后細(xì)胞凝集現(xiàn)象明顯減少。在日本沼蝦[1]、刺參[2]中均有類似發(fā)現(xiàn)，而對于中華絨螯蟹肝素鈉則無法抗凝，可能是因?yàn)楦嗡剽c不能與中華絨鰲蟹中的特異抗凝蛋白結(jié)合。此外，肝素鈉對鯽魚“中科3號(hào)”的有效抗凝濃度為（0.80±0.17） mg/mL，與日本沼蝦（0.6～1.4 mg/mL）類似，高于刺參（0.2～0.6 mg/mL）。

檸檬酸鈉抗凝的主要機(jī)制在于其能與血液中的鈣離子形成不易解離但可溶解的絡(luò)合物，減少血液中鈣離子濃度，從而阻止血液凝固[4]。該試驗(yàn)結(jié)果表明檸檬酸鈉對鯽魚“中科3號(hào)”的有效抗凝濃度為（1.42±0.14） mg/mL，略高于肝素鈉，其對刺參的有效抗凝濃度為3.8～5.4 mg/mL，對血細(xì)胞形態(tài)無顯著影響。Durliat等[5]研究表明10%檸檬酸鈉能很好地阻止血液凝固且不影響血細(xì)胞形態(tài)，這與該試驗(yàn)結(jié)果類似。對日本沼蝦[1]的研究表明檸檬酸鈉的有效抗凝濃度應(yīng)在10 mg/mL以上，且造成細(xì)胞溶血；對中華絨螯蟹[3]的有效抗凝濃度在25 mg/mL以上，也造成細(xì)胞溶血。在鯉魚上[6]，檸檬酸鈉能較好地抗凝血細(xì)胞凝固且維持血細(xì)胞形態(tài)，不發(fā)生溶血。

草酸鉀的抗凝機(jī)理是與血液中的鈣離子結(jié)合形成不溶性的草酸鈣沉淀，阻止血液凝固從而起到抗凝的作用[4]。草酸鉀對鯽魚“中科3號(hào)”的有效抗凝濃度為（1.17±0.14） mg/mL，試驗(yàn)中未觀察到明顯的白色絮狀沉淀，顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)良好，但高濃度下有明顯的溶血現(xiàn)象。但是，血液學(xué)研究中較少使用草酸鹽抗凝，因其可能存在溶血及影響血液中某些物質(zhì)的生物活性。在日本沼蝦[1]及中華絨螯蟹[3]上，草酸鉀均能抗凝血液，但都引起血液溶血。在對刺參[2]的研究中，1.0～1.5 mg/mL草酸鉀能有效抗凝，且不影響血細(xì)胞形態(tài)，但1.5 mg/mL草酸鉀抗凝2 h以上出現(xiàn)溶血及破裂現(xiàn)象，與該試驗(yàn)結(jié)果類似。在對鯉魚[6]的研究中也發(fā)現(xiàn)，草酸鉀能較好地抗凝血細(xì)胞凝固，但紅細(xì)胞會(huì)發(fā)生溶血現(xiàn)象。

EDTA是通過絡(luò)合血液中的鈣離子而阻止血液發(fā)生凝固的[4]。在日本沼蝦[1]的研究中，1.5 mg/mL的EDTA可以使其血液超過72 min不凝固且能維持血細(xì)胞形態(tài)無變化；在刺參[2]的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)EDTA濃度為1.5 mg/mL時(shí)，其細(xì)胞存活率也最高。當(dāng)EDTA濃度≥2.0 mg/mL時(shí)，刺參血細(xì)胞的凝集程度減輕，但細(xì)胞形態(tài)保持較差，細(xì)胞存活率低。在中華絨螯蟹[3]上，EDTA對其細(xì)胞有一定的破壞作用，且其有效抗凝濃度為15.0 mg/mL。該試驗(yàn)結(jié)果表明，EDTA對鯽魚“中科3號(hào)”的有效抗凝濃度為（2.33±0.58） mg/mL，略高于日本沼蝦和刺參，對鯽魚血細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。

該試驗(yàn)結(jié)果表明，L-半胱氨酸不能延長鯽魚“中科3號(hào)”的血液凝固時(shí)間在61.43 min以上，可能與試驗(yàn)濃度過低有關(guān)，但半胱氨酸在0.1 mol/L PBS中溶解度有限。在對日本沼蝦[1]的研究中，L-半胱氨酸濃度在1.0 mg/mL以上時(shí)，可使其血液凝固時(shí)間超過86 min，且能較好地維持血細(xì)胞的形態(tài)。在中華絨鰲蟹[3，7]的研究中也有類似的發(fā)現(xiàn)。當(dāng)L-半胱氨酸濃度太低時(shí)，對中華絨鰲蟹的血液無明顯抗凝作用，當(dāng)L-半胱氨酸濃度達(dá)100 mg/mL時(shí)，則可對其血液有效抗凝，且細(xì)胞存活率在90%以上。在對對蝦[8]的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸的有效抗凝濃度為150 mg/mL。

該試驗(yàn)結(jié)果可為鯽魚外周血抗凝劑的應(yīng)用提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1]

李義.6種常用抗凝劑對日本沼蝦血淋巴液抗凝效果的研究[J].水利漁業(yè)，2001，21（6）：41-42.

[2] 張峰，宋志東，劉洪偉，等.4種抗凝劑對刺參體腔細(xì)胞的抗凝效果[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（1）：87-89.

[3] 張明輝，陸宏達(dá).中華絨螯蟹血淋巴液抗凝劑的篩選[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2005，32（增刊）：93-99.

[4] 張鏡如，喬健天.生理學(xué)[M].4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997：71-73.

[5] DURLIAT M，VRANCKX R.Coagulation in the crayfish Astacus leptodactylus：Attempts to identify a fibrinogenlike factor in the hemolymph[J].Biol Bul，1976，151（3）：467-477.

[6] 李玉榮，李雙安，武現(xiàn)軍，等.不同抗凝劑對鯉魚血細(xì)胞形態(tài)的影響[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)，2005，51（增刊）：95-99.

[7] 劉凱，陸宏達(dá).中華絨螯蟹血細(xì)胞體外吞噬能力的研究[J].南方水產(chǎn)，2007，3（6）：47-51.

[8] 薛清剛，王文興.對蝦疾病的病理與診斷[M].青島：青島海洋大學(xué)出版社，1992：19-32.