李小霞 桂小薇 肖仲久

摘要[目的]對(duì)貴州省赤水河流域茅臺(tái)段土壤中放線菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)與DNA提取。[方法]從赤水河流域采集土壤樣本，采用土壤稀釋分離法和劃線純化相結(jié)合的方法進(jìn)行放線菌分離與培養(yǎng)，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。利用CTAB法提取放線菌基因組DNA。[結(jié)果]共分離到6株放線菌。0.001 g/mL土壤懸液最適宜分離放線菌。提取的放線菌DNA條帶完整，大小約為23.13 kb。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為放線菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供試驗(yàn)材料和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞放線菌；赤水河流域；土壤；分離；培養(yǎng)；DNA提取

中圖分類號(hào)S154.38+3；Q939.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）08-0004-03

Isolation， Culture and DNA Extraction of Actinomycetes from Soil in Maotai Section of Chishui River Basin

LI Xiaoxia1， 2， GUI Xiaowei1，XIAO Zhongjiu1， 2

（1.College of Biology，Agricultural Science and Technology，Zunyi Normal College，Zunyi， Guizhou 563006；2.Key Laboratory of Regional Characteristic for Conservation and Utilization of Plant Resource in Chishui River Basin， Zunyi， Guizhou 563006）

Abstract[Objective] To isolate and culture actinomycetes in the soil from Maotai Section of Chishui River Basin in Guizhou to make DNA extraction.[Method] Soil samples were collected from Chishui River Basin to isolate and culture actinomycetes by using dilution method and scraping line method.And their morphological characteristics were observed.The genomic DNA was extracted from actinomycetes by using CTAB method.[Result] 6 strains of actinomycetes were isolated.The suitable concentration of soil suspension for the isolation of actinomycetes was 0.001 g/mL.The extracted DNA from actinomycetes had complete bands with the size of about 23.13 kb.[Conclusion] The research results can provide test materials and theoretical basis for further exploitation and utilization of actinomycetes.

Key wordsActinomycete；Chishui River Basin；Soil；Isolation；Culture；DNA extraction

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31600030）；貴州省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目（黔科合J字LKZS〔2012〕18號(hào)）；貴州省科技創(chuàng)新人才團(tuán)隊(duì)建設(shè)項(xiàng)目（黔科合人才團(tuán)隊(duì)〔2012〕4004號(hào)）。

放線菌是屬于一類具有分支狀菌絲體、以孢子繁殖的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞DNA的GC含量較高[1]。土壤是人類賴以生存的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是放線菌生活的最主要場(chǎng)所。放線菌是一類重要的可再生資源，因?yàn)槟墚a(chǎn)生許多種抗生素而受到重視，是一種重要的資源微生物。目前臨床上使用的抗生素，有60%以上是由放線菌發(fā)酵生產(chǎn)的[2]。放線菌還能產(chǎn)生酶抑制劑、免疫抑制劑及其他生理活性物質(zhì)，如他汀類藥物（Statins）已經(jīng)成功應(yīng)用于臨床上高脂血癥和糖尿病的治療，此外，產(chǎn)生的酶（如纖維素酶）早已在工業(yè)上應(yīng)用。放線菌在生產(chǎn)微生物農(nóng)藥、農(nóng)用抗生素、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及石油脫蠟、污水凈化等方面也有廣泛應(yīng)用。

赤水河是我國(guó)長(zhǎng)江上游支流，全長(zhǎng)523 km，流域面積2.04 萬(wàn)km2，于仁懷市南部龍井鄉(xiāng)進(jìn)入貴州省，該段流域?qū)儆谂瘻貛Ц咴瓪夂?，是我?guó)茅臺(tái)酒以及董酒、習(xí)酒、郎酒等數(shù)十種聞名中外美酒的發(fā)源地，因其獨(dú)特的地理環(huán)境，蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源[3]。筆者對(duì)赤水河流域土壤放線菌進(jìn)行了分離、培養(yǎng)與DNA提取，旨在為放線菌的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用提供試驗(yàn)材料和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試土樣及其預(yù)處理

供試土樣采自貴州省赤水河流域茅臺(tái)段。土樣參照郭斌等[4]的方法進(jìn)行預(yù)處理：選取肥沃的土壤，去除表面落葉及碎石等，取5～10 cm深的土壤，將采集的土樣置于無(wú)菌紙袋中備用，或置于-20 ℃冰箱中保存，注意切勿使土壤變潮生霉[4]，土樣自然風(fēng)干5～30 d；取用時(shí)用研缽盡量將土樣研碎，置于120 ℃烘箱中烘烤60 min，以減少細(xì)菌和真菌的出菌率，增加產(chǎn)孢放線菌的數(shù)量。

1.2培養(yǎng)基

高氏1號(hào)合成瓊脂培養(yǎng)基：KNO3 1.0 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g、可溶性淀粉20.0 g、瓊脂15.0～25.0 g、蒸餾水1 000 mL，pH 7.4～7.6，121 ℃下滅菌20 min。

1.3主要儀器

電熱恒溫培養(yǎng)箱；AR-224CN電子分析天平；Legond 臺(tái)式微量離心機(jī)；WD-9405脫色搖床；DYCZ-20A DNA序列分析電泳槽；SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)；WD-9413A凝膠成像分析儀；GZX-9070MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱等。

1.4主要試劑瓊脂糖、CTAB溶液、氯仿、異丙醇、乙醇等。

1.5試驗(yàn)方法

1.5.1放線菌的分離。采用土壤稀釋分離法分離土壤中的放線菌。①稱取已研細(xì)的土壤樣品1.0 g置于含99 mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩5～10 min，使土樣充分打散，即制成0.01 g/mL濃度的土壤懸液。

②用無(wú)菌移液管吸取0.01 g/mL的土壤懸液0.5 mL，吹入4.5 mL無(wú)菌水中，即為0.001 g/mL土壤懸液，如此重復(fù)，可依次制成0.001、0.000 1、0.000 01 g/mL的土壤懸液。取制成的4種不同濃度的土壤懸液，在每管中加入10%酚液5～6滴[5]，搖勻，靜置片刻，然后各取0.1 mL上述土壤懸液加至高氏1號(hào)瓊脂合成培養(yǎng)基上，用無(wú)菌涂布器平放于平板表面，輕輕地來(lái)回推動(dòng)，使之涂布均勻。每個(gè)濃度做4個(gè)平板；然后，將接種好的平板倒置，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，觀察生長(zhǎng)的菌落，用于進(jìn)一步純化分離。

1.5.2菌株純化。待菌種生長(zhǎng)好后，用接種針從待純化的放線菌菌種挑取少量菌樣，在高氏1號(hào)合成瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離，采用的劃線方法是分區(qū)劃線。待長(zhǎng)出單菌落后，再挑出劃線，依此方法，直至得到無(wú)雜菌污染的菌落[6]。

1.5.3菌株保存。將分離、純化得到的放線菌單菌落轉(zhuǎn)接在高氏1號(hào)合成瓊脂培養(yǎng)基上斜面培養(yǎng)，待其生長(zhǎng)好后，置于4 ℃冰箱中保存，每株菌保存2管。

1.5.4放線菌總 DNA 的提取與檢測(cè)。采用CTAB法提取放線菌總DNA：①將2%CTAB 提取液65 ℃下預(yù)熱10 min；②用無(wú)菌刀片刮取微生物菌落于研缽中，加入1 mL CTAB提取液、72 μL溶菌酶（終濃度20 mg/mL）和適量石英砂進(jìn)行研磨，將其轉(zhuǎn)至滅菌的 2 mL 離心管，加入600 mL氯仿 （三氯甲烷），混合均勻后4 ℃下12 000 r/min離心10 min；

③將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，再次加入600 mL氯仿 （三氯甲烷），混合均勻后4 ℃下12 000 r/min離心10 min；④將上層水相轉(zhuǎn)入新的2 mL離心管中，加入700 μL異丙醇（預(yù)冷），混勻，置于-10 ℃冰箱中10 min；4 ℃下12 000 r/min離心10 min；⑤棄上清液，用 75%乙醇洗滌，7 500 r/min離心 5 min，重復(fù)2次，倒扣于濾紙上晾干；⑥加入 25 μL 無(wú)菌水溶解DNA，4 ℃下保存過(guò)夜；⑦取提取的基因組 DNA 5 μL，進(jìn)行 1.2%瓊脂糖凝膠電泳（電壓 80～100 V， 40～50 min），使用全自動(dòng)凝膠成像分析儀觀察并照相。

2結(jié)果與分析

2.1放線菌分離0.1 mL土壤稀釋液在高氏1號(hào)合成瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)放線菌，大多數(shù)放線菌生長(zhǎng)較緩慢，30 ℃下培養(yǎng)5～7 d后，產(chǎn)生可深入培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)菌絲和生長(zhǎng)于表面的氣生菌絲，并形成無(wú)性孢子。放線菌的菌落形態(tài)多干燥致密，不透明，呈粉末狀，由于孢子、氣生菌絲和營(yíng)養(yǎng)菌絲顏色不同，常使菌落正反面呈不同顏色，有橙黃色、灰色、白色、淺棕色、黑色等，有些表面覆蓋1層粉沫狀的孢子（圖1 Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ），有些菌落可以產(chǎn)生水溶性色素（圖1 Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ）。

2.2形態(tài)特征

采用插片法對(duì)培養(yǎng)的放線菌進(jìn)行形態(tài)觀察。先將融化冷卻至60 ℃的高氏1號(hào)合成瓊脂培養(yǎng)基倒在平板上，每皿倒入約20 mL，凝固后將已滅菌的蓋玻片用鑷子傾斜插入平板上（深度約占蓋玻片長(zhǎng)度的1/2），插時(shí)用力要適度，以免將平板底部戳穿；然后，用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量的已純化菌種接種到蓋玻片一側(cè)的基部，且僅接種到其中央位置約占蓋玻片寬度的一半，以免菌絲蔓延到蓋玻片的另一側(cè)。每皿插4片，將平板倒置，30 ℃下培養(yǎng)5～7 d； 取出插片擦去背面附著物，放在載玻片上，分別用低倍光學(xué)顯微鏡、高倍光學(xué)顯微鏡觀察基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的粗細(xì)以及孢子絲排列方式等。從圖2可以看出，基內(nèi)菌絲無(wú)分隔，長(zhǎng)度不定。氣生菌絲發(fā)達(dá)，直生或分支絲狀，成熟后生成孢子絲，孢子絲排列方式隨菌種而不同，有的呈螺旋狀，有的呈波浪彎曲形。由此可見(jiàn)，純化的菌株為放線菌，不是霉菌等非目的菌株。

2.3放線菌的基因組 DNA 提取

可以看出，6號(hào)放線菌總DNA約為23.13 kb，DNA條帶清晰明亮，得率較高，說(shuō)明DNA提取效果較好，因此提取DNA可作為后續(xù)PCR擴(kuò)增的材料。3結(jié)論

（1）用0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 g/mL的土壤懸液進(jìn)行放線菌分離，其中0.01 g/mL土壤懸液長(zhǎng)出的菌落最多，但雜菌也較多，特別是細(xì)菌最多；0.001 g/mL土壤懸液長(zhǎng)出的菌落次之，雜菌較少；0.000 1 g/mL土壤懸液長(zhǎng)出的菌落很少，0.000 01 g/mL土壤懸液幾乎不長(zhǎng)或只長(zhǎng)1～2個(gè)菌落。因此，0.001 g/mL土壤懸液最適宜分離放線菌。

（2）放線菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，肽聚糖含量多，且交聯(lián)程度高，因此其細(xì)胞壁不易破裂。破裂細(xì)胞壁有多種方法，包括

液氮研磨法、酶解法、研缽研磨法等。該研究中采用液氮快速研磨法，并且在提取的過(guò)程中加入溶菌酶，加速了放線菌細(xì)胞壁的破碎，DNA釋放完全，提取效果非常好。此外，在試

驗(yàn)中研磨時(shí)間不易掌握，若研磨時(shí)間過(guò)短會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的DNA不能充分釋放，獲得的DNA量變少，影響試驗(yàn)結(jié)果；若研磨時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易導(dǎo)致DNA片段破裂與降解等。因此，研缽要預(yù)冷，研磨時(shí)間最好控制在2 min以內(nèi)。

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安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年