閆海霞 關(guān)世凱 黃昌艷 鄧杰玲 何荊洲 張自斌 卜朝陽

摘 要 以羽裂報春苣苔的葉片為外植體，通過研究不同滅菌方法、不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度對組織培養(yǎng)的影響，建立了羽裂報春苣苔的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：羽裂報春苣苔適宜的外植體滅菌方法為采用75%酒精滅菌20 s，無菌水沖洗3次；然后用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次；再用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，成活率為55.40%。不定芽的誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，誘導率達100.00%。在適宜的增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L上，增殖系數(shù)高達8.61；在生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L上，生根率達100.00%，生根時間為19.10 d。移栽基質(zhì)為泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），移栽成活率為99.60%。

關(guān)鍵詞 羽裂報春苣苔；組織培養(yǎng)；二次滅菌；活性炭

中圖分類號 Q949.778.4 文獻標識碼 A

Tissue Culture of Primulina pinnatifida

YAN Haixia， GUAN Shikai， HUANG Changyan， DENG Jieling，

HE Jingzhou， ZHANG Zibin， BU Zhaoyang*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract With the leaves of Primulina pinnatifida as the explants， the tissue culture technique system of P. pinnatifida was studied based on the effects of sterilization methods， plant growth regulator types and concentrations. The results showed that the suitable method for the sterilization of the explants was the leaves were sterilized in 75% alcohol for 20 seconds， then soaked in 0.1% HgCl2 for 6 minutes， and soaked in 0.1% HgCl2 for another 6 minutes. The survival rate of the explants was 55.40%. The suitable culture medium for adventitious bud induction was MS+6-BA 1.0-2.0 mg/L+NAA 0.01-0.1 mg/L， the most suitable culture medium for adventitious bud multiplication was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+activated carbon 0.1 g/L， and the multiplication coefficient was 8.61. The optimum culture medium for rooting culture was MS+IBA 0.5 mg/L+activated carbon 0.1 g/L， and the rooting rate was 100%. For the cultivation， the suitable ratio of transplanting medium of the in vitro plantlets was peat ∶ perlite ∶ sand 4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）， and the survival rate of transplanting of the in vitro plantlets reached 99.60%.

Key words Primulina pinnatifida； tissue culture； secondary sterilization； activated carbon

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.015

羽裂報春苣苔（Primulina pinnatifida）屬苦苣苔科報春苣苔屬的多年生草本植物[1]，中國是該種的分布中心，主要分布點為廣西、廣東北部、貴州東南部、湖南南部、江西、福建西部、浙江南部和西部。羽裂報春苣苔畏熱，忌陽光直射，需要較高的空氣濕度和土壤濕度，因此常見于海拔600～1 500 m的谷林中石上或溪邊。全草可供藥用，用于治療跌打損傷等癥；此外，還具有極高的觀賞價值，應(yīng)用前景廣闊。

目前有關(guān)羽裂報春苣苔的研究極少，僅在資源調(diào)查中有涉及[2-3]。羽裂報春苣苔可以采用種子繁殖或葉片扦插，但種子細小，采收及播種較繁瑣，且繁殖速度慢，系數(shù)小。而組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖周期短、繁殖系數(shù)大，后代整齊一致，并且能保持母本的優(yōu)良性狀，已被廣泛應(yīng)用于該屬的其他植物上[4-14]，但未見關(guān)于羽裂報春苣苔組織培養(yǎng)的報道。本研究以羽裂報春苣苔的葉片為外植體，對其開展組織培養(yǎng)技術(shù)研究，擬建立其組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以便生產(chǎn)大量的種苗應(yīng)用于生產(chǎn)和資源保護。

1 材料與方法

1.1 材料

羽裂報春苣苔來自廣西農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒滅菌 2016年3～4月份，取羽裂報春苣苔的葉片，用洗衣粉溶液浸泡25～30 min后在流水下沖洗干凈（30 min），并用軟毛刷輕輕刷洗葉片；然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺；先用棉球蘸取75%酒精拭擦葉片表面，無菌水沖洗3次，將葉片按照表1的滅菌方法進行滅菌，每種滅菌劑滅菌后均要用無菌水沖洗3次，使用0.1%升汞滅菌過程中要輕輕震蕩使升汞充分接觸葉片；將葉片切成3 cm×3 cm大小，接入MS培養(yǎng)基，每種滅菌方法處理數(shù)量為50個，每個處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照時間為每天14～16 h，下同。連續(xù)15 d觀察污染、成活情況，并統(tǒng)計、計算污染率、成活率：

污染率/%=污染數(shù)/接種數(shù)×100；

成活率/%=未污染的成活數(shù)/接種數(shù)×100。

1.2.2 初代培養(yǎng) 將已成活的葉片切成1.5 cm×1.5 cm大小，接入初代誘導培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個，每個處理重復(fù)3次；培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計發(fā)生不定芽的葉片數(shù)量，并計算誘導率。

誘導率/%=葉片發(fā)生不定芽的數(shù)量/接種數(shù)×100。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將具有2片以上葉片的不定芽切取下來，接入增殖培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個，每個處理重復(fù)3次；培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計新芽數(shù)量，并計算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=產(chǎn)生新芽數(shù)/接種數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)獲得的具有3～4片葉的組培芽，接種在不同的生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個，重復(fù)3次；培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計生根的植株數(shù)以及生長情況，并計算生根率。

生根率/%=生根植株數(shù)/接種數(shù)×100。

1.2.5 煉苗移栽 將組培苗移出培養(yǎng)室后在自然條件下煉苗4～5 d；洗凈培養(yǎng)基移栽到不同的基質(zhì)上，每種基質(zhì)移栽數(shù)量為50株，每個處理重復(fù)3次，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽網(wǎng)的蔭棚下，透光率為40%～50%；采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣相對濕度，每2 h噴霧1次，噴霧時間每次40 s，確保空氣相對濕度在85%以上，早晚分別澆透水1次；移栽后7～10 d即可成活，成活率達100%。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計成活的植株數(shù)以及生長情況，并計算移栽成活率。

移栽成活率/%=移栽成活植株數(shù)/移栽數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計分析

采用統(tǒng)計軟件SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行差異顯著性測驗（Duncan′s多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒滅菌

由表2可看出，L3的污染率顯著低于L1，其成活率顯著高于L1；L6的污染率顯著低于L4，其成活率顯著高于L4；L9的污染率和成活率均顯著低于L7；L2的污染率顯著高于L3，其成活率顯著低于L3；L5、L6的污染率無顯著差異，但L5的成活率顯著高于L6；L8的污染率和成活率顯著高于L9。由此表明，采用升汞一次滅菌時，當酒精滅菌時間為10～20 s時，隨著升汞滅菌時間的增加，污染率顯著下降，成活率顯著上升；當酒精滅菌時間為30 s時，污染率和成活率均顯著下降。采用升汞二次滅菌時，當酒精滅菌時間為20～30 s時，二次滅菌的成活率顯著上升。由此可知，羽裂報春苣苔的外植體宜采用升汞二次滅菌法，即先用75%酒精滅菌20 s，無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，成活率為55.40%。

2.2 初代培養(yǎng)

由表3可知，9個處理之間的誘導率無顯著差異，均為100.00%，而每個處理的誘導時間卻有所不同。Y1的誘導時間顯著高于其余處理；Y2、Y3、Y4、Y5的誘導時間顯著高于Y6、Y7、Y8、Y9的誘導時間，而Y2、Y3、Y4、Y5之間的誘導時間無顯著差異；Y6、Y8、Y9之間的誘導時間無顯著差異。上述結(jié)果表明，附加了不同植物生長調(diào)節(jié)劑種類和濃度的培養(yǎng)基對不定芽的誘導率影響不大，但對誘導時間有影響?？梢姡参锷L調(diào)節(jié)劑不是羽裂報春苣苔不定芽誘導的必要因素，但卻決定著不定芽誘導時間的長短，一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）有利于縮短誘導時間。在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L上，不定芽誘導率為100.00%，長勢良好，培養(yǎng)時間為20.30～24.50 d（圖1、圖2）。

2.3 增殖培養(yǎng)

由表4可看出，J1、J2、J3的增殖系數(shù)存在顯著差異，其中，J3的增殖系數(shù)顯著高于J1、J2，為8.61；J6的增殖系數(shù)顯著低于J4、J5；J7的增殖系數(shù)顯著低于J8、J9；J3、J6、J9的增殖系數(shù)存在顯著差異。由此表明，在含有0.1 mg/L活性炭的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而顯著增加；在含有0.5 mg/L活性炭的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加先上升后下降，增加趨勢不明顯但下降較顯著；當活性炭含量為1.0 mg/L時，增殖系數(shù)的增加趨勢逐漸不顯著；在含有2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨活性炭含量的增加有顯著變化，呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢，但仍以活性炭為0.1 mg/L的增殖系數(shù)最高。可見，不同的6-BA濃度以及活性炭含量，對羽裂報春苣苔不定芽增殖的影響無明顯的規(guī)律性，但在培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L上，其增殖系數(shù)最高，為8.61，植株長勢好且健壯，是適宜的增殖培養(yǎng)基（圖3、圖4）。

2.4 生根培養(yǎng)

從表5可知，S2、S3、S4的生根率顯著高于其他處理，均為100.00%；S8的生根率顯著高于S5、S6、S7，為92.20%；S5的生根率顯著低于其他處理，為79.00%，且其生根時間最長，為29.90 d；S2、S3、S4的生根時間顯著低于其他處理，其中S3的生根時間最短，為19.10 d。由此可知，添加了吲哚丁酸（IBA）的培養(yǎng)基有利于植株的生根，同時有利于縮短生根的時間。綜上可知，羽裂報春苣苔的最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L，生根率達100.00%，生根時間需要19.10 d，植株長勢好且健壯，根多（圖5）。

2.5 煉苗移栽

由表6可看出，不同的移栽基質(zhì)，對羽裂報春苣苔的成活率有不同的影響?；|(zhì)M3的成活率顯著高于其他基質(zhì)，為99.60%，且小苗長勢好，植株健壯；基質(zhì)M1的成活率顯著低于其他基質(zhì)，為88.60%，小苗長勢差，植株細弱。結(jié)果表明，單一使用泥炭，或者將泥炭與珍珠巖或河沙進行混合不利于植株的移栽，而將泥炭、珍珠巖、河沙混合使用，成活率可達99.60%。綜上可知，羽裂報春苣苔的適宜移栽基質(zhì)為M3，泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），植株長勢好且健壯（圖6）。

3 討論

羽裂報春苣苔沒有明顯的地上莖，選取莖段做外植體對母株的傷害極大；花梗也可作為適宜的外植體，但花梗在花期才能取用，取材時間受到了限制；此外，植物帶苞片的花蕾也能作為外植體進行組培快繁[13]，但同樣存在取材時間受限的問題。綜上考慮可知，葉片取材不受時間、季節(jié)的限制，對植株的傷害也極小，是理想的外植體類型。但以葉片為外植體進行滅菌時，由于葉片布滿茸毛、大量外生菌隱藏于茸毛中并滋生[15]，滅菌時間不好把握，容易造成外植體受滅菌劑毒害而死亡或外植體因消毒不徹底而被污染。因此，苦苣苔外植體的表面消毒具有一定的困難，外植體在培養(yǎng)過程中污染率較高、成活率較低。以往的文獻報道中，均采用一次滅菌，用70%酒精表面消毒30～45 s，用無菌水沖洗3次后再放入0.1%升汞浸泡滅菌5～8 min，并不停振蕩，最后再用無菌水沖洗5～8次[16-18]。這種一次滅菌的方法雖然操作過程簡單，但成活率較低。本研究采用升汞二次滅菌的方法對葉片進行滅菌。先用75%酒精滅菌20 s，無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，主要是為了降低升汞對葉片的毒害，從而提高外植體的成活率。采用本滅菌方法，成活率可達55.40%。

苦苣苔科植物的葉片扦插繁殖容易，因此在組培中的植株再生及生根也較容易，但仍需要一定的植物生長調(diào)節(jié)劑刺激，才能達到快速獲得組培苗的目的。在現(xiàn)有的苦苣苔科植物的組織培養(yǎng)研究結(jié)果中，多數(shù)培養(yǎng)基均添加了細胞分裂素和生長素，以此來進行不定芽的誘導和繼代增殖培養(yǎng)，如6-BA和NAA。本研究得出羽裂報春苣苔不定芽的誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L，這與前人的研究結(jié)果是一致的。如王俐等[19]在進行貓耳朵的組織培養(yǎng)時，在MS培養(yǎng)基上添加6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L，出芽率達到100%；此外，還有MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L[13，20]以及MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L[21-22]也取得較好的培養(yǎng)效果。由此表明，植物生長調(diào)節(jié)劑是影響苦苣苔科植物組織培養(yǎng)的重要影響因子；另外，在進行羽裂報春苣苔的初代培養(yǎng)時，不添加任何植物生長調(diào)節(jié)劑也可誘導出不定芽，但所需時間較長，可見6-BA和NAA對不定芽的誘導起促進作用。

本研究以葉片為外植體，建立了羽裂報春苣苔的組織培養(yǎng)體系，適宜的外植體滅菌方法如下：采用75%酒精滅菌20 s，無菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無菌水沖洗3次，成活率為55.40%；不定芽的誘導培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，誘導率達100.00%；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L，增殖系數(shù)高達8.61；生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L，生根率100.00%，生根時間需要19.10 d；移栽基質(zhì)為泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），移栽成活率為99.60%。

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