王月秋++李珊珊++曾紅++張景海

【摘 要】大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素53位均為天冬氨酸，但目前尚無這個(gè)殘基在毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的報(bào)道。本研究采用突變分析的方法考察Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9鎮(zhèn)痛活性的關(guān)聯(lián)，構(gòu)建突變體D53A，D53E，D53N和D53K，小鼠扭體法測(cè)定重組BmK9及其突變體的鎮(zhèn)痛活性。結(jié)果顯示除D53E這一保守取代外，其余三個(gè)突變都導(dǎo)致了鎮(zhèn)痛活性的顯著降低。目前的研究結(jié)果提示，Asp53與東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

【關(guān)鍵詞】Asp53 BmK9 鎮(zhèn)痛活性 定點(diǎn)突變 結(jié)構(gòu)功能關(guān)系

東亞鉗蝎（BmK）作為傳統(tǒng)中藥用于治療多種慢性疼痛已有幾千年的歷史，迄今為止，發(fā)現(xiàn)了十余種多肽類的東亞鉗蝎毒素具有鎮(zhèn)痛活性[1-5]。它們都是60-76個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈多肽，屬于蝎長(zhǎng)鏈神經(jīng)毒素，具有共同的結(jié)構(gòu)核心[6]。這些毒素結(jié)構(gòu)的相似性是否意味著它們有著共同的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)位點(diǎn)值得關(guān)注，研究者通過基因突變分析的方法對(duì)幾個(gè)毒素的結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛活性關(guān)系進(jìn)行了考察，揭示了幾個(gè)位點(diǎn)與鎮(zhèn)痛活性的關(guān)聯(lián)[5，7-11]。最近，鄧?yán)淼葓?bào)道了兩個(gè)保守的酪氨酸（Tyr5 和Tyr42） 在BmK AGP-SYPU1[12]鎮(zhèn)痛活性中的作用，但有關(guān)東亞鉗蝎毒素鎮(zhèn)痛活性相關(guān)位點(diǎn)的信息還非常有限。

BmK9是從東亞鉗蝎蝎毒獲得的65個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的單鏈鎮(zhèn)痛活性肽[5]，編碼BmK9前體（GenBank ID： DQ981785）的全長(zhǎng)cDNA已被克隆。BmK9的53位是一個(gè)天冬氨酸，在大多數(shù)的東亞鉗蝎鎮(zhèn)痛肽中該位點(diǎn)都被天冬氨酸占據(jù)（圖1所示），但是目前還沒有Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中作用的研究。本研究對(duì)BmK9在53位進(jìn)行定點(diǎn)突變以考察53位天冬氨酸在鎮(zhèn)痛活性中的作用。基于獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，討論了Asp53在BmK9鎮(zhèn)痛活性中的重要性。

通過ClustalW2進(jìn)行比對(duì)[13]（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）。在序列中插入空隙（用“-”表示）以獲得最大相似性，氨基酸殘基的編號(hào)及序列一致性以BmK9為依據(jù)，53位殘基用箭頭指示?；驇?kù)序列號(hào)如下：BmK9 （DQ981785），BmK AngM1 （AF164203），BmK AGAP（AF464898），BmK AGP-SYPU1 （GU726488），BmK AGP-SYPU2 （GU726489），BmK dITAP3 （AF064821）[14]，BmK IT2 （UniProtKB/Swiss-Prot： P68727）[15]，BmK IT-AP （AF156171），BmK AS （AF079060）和BmK AS1 （AF079061）[16]。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pSYPU-BmK9和pSYPU由實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，用于表達(dá)的宿主菌BL21（λDE3）購(gòu)于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；限制性內(nèi)切酶，T4 DNA 連接酶，Taq DNA聚合酶和引物來自南京金斯瑞生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；金屬離子螯合親和層析及陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)購(gòu)于瑞典Pharmacia公司；SPF級(jí)昆明種小白鼠由北京華富康生物科學(xué)公司（NO： SCXK-[京]2009-004，北京，中國(guó)）提供。其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)BmK9的序列設(shè)計(jì)4個(gè)下游引物：D53A，5′-CGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT AGC GGG CA-3′； D53N，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT ATT GGG CA-3′；D53E，5′-CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT TTC GGG CA-3′；D53K，5′ -CCGGAATTCT TTA GCG ATG ACA TTT TCC TGG TAC TCT AAT CGG TAC ACT CTT GGG CA-3′。以質(zhì)粒pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。產(chǎn)物酶切后克隆至載體pSYPU，熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取陽(yáng)性克隆菌落PCR驗(yàn)證后測(cè)序。

1.2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

將含有重組質(zhì)粒pSYPU-BmK9，pSYPU-BmK9/D53A，pSYPU-BmK9/D53N pSYPU-BmK9/D53E 和 pSYPU-BmK9/D53K 的大腸桿菌接種于含 50 mg·L-1 卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，異丙基-β-D -硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。收集菌體超聲破碎后離心，上清液經(jīng)金屬離子螯合的親和層析柱（Chelating Sepharose Fast Flow， 1.0 cm×6.5 cm）進(jìn)行初步純化，以pH值3.0的0.1 mol·L-1 PBS洗脫目的蛋白。收集目的蛋白，經(jīng)SP Sepharose Fast Flow柱（1.0 cm×20 cm）進(jìn)一步純化，用0～1.0 mol·L-1NaCl水溶液（含50 mmol·L-1PBS，pH值6.6）梯度洗脫目的蛋白。SDS-PAGE 分析重組蛋白純度，考馬斯亮藍(lán)R-250 染色[8]。

1.2.3 鎮(zhèn)痛活性

小鼠醋酸扭體法考察鎮(zhèn)痛活性，用生理鹽水配制合適濃度的重組蛋白溶液進(jìn)行活性檢測(cè)。取18～20g昆明種 SPF 級(jí)小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分組，每組10只，按 0.5mg/kg 的劑量尾靜脈給藥，20min 后按 0.2ml/20g 體重腹腔注射 0.6% 醋酸引起內(nèi)臟痛，5min 后記錄小鼠 10min 內(nèi)的扭體次數(shù)。以重組BmK9 為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照，按照下述公式計(jì)算各個(gè)給藥組的扭體反應(yīng)抑制率。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

以質(zhì)粒 pSYPU-BmK9為模板，T7引物為上游引物，D53A，D53N，D53E和D53K分別為下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物克隆至表達(dá)載體pSYPU，構(gòu)建成功的表達(dá)質(zhì)粒分別熱轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21（λDE3）細(xì)胞，挑取重組子驗(yàn)證。DNA序列測(cè)定顯示 BmK9 及其突變體基因均正確克隆。

2.2 誘導(dǎo)表達(dá)及分離純化

IPTG誘導(dǎo)后，重組蛋白主要以可溶性形式表達(dá)。兩步層析法純化重組蛋白后，15%SDS-PAGE分析重組蛋白（以突變體D53A為例）的純度，結(jié)果見圖2所示，重組蛋白的純度基本達(dá)到電泳純。

泳道1，兩步層析純化的重組BmK9；泳道2，兩步層析純化的突變體D53A；泳道M，低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)品

2.3 鎮(zhèn)痛活性

如表1所示，與生理鹽水組相比，重組BmK9及其突變體均呈現(xiàn)出明顯的鎮(zhèn)痛效果（p<0.05）。與重組BmK9相比，突變體D53A，D53N和D53K的鎮(zhèn)痛活性均顯著降低，而突變體D53E與重組BmK9的鎮(zhèn)痛活性無明顯差別。

3 討論

大多數(shù)來自東亞鉗蝎的具有鎮(zhèn)痛活性的多肽類神經(jīng)毒素的53位都是天冬氨酸，Asp53在這類毒素鎮(zhèn)痛活性中的作用有待鑒定，而定點(diǎn)突變是闡明特定位點(diǎn)氨基酸殘基作用的一種有效途徑。用非極性的甲基（CH3）取代天然毒素的羧甲基（CH2COOH），突變體D53A的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降42%），提示Asp53與BmK9的鎮(zhèn)痛活性相關(guān)，其側(cè)鏈羧基發(fā)揮了關(guān)鍵作用。極性不帶電荷的天冬酰胺取代天冬氨酸的突變D53N也導(dǎo)致鎮(zhèn)痛活性的顯著降低（下降50%），提示Asp53的側(cè)鏈羧基是通過凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮作用。同種電荷取代的突變體D53E的鎮(zhèn)痛活性與BmK9的鎮(zhèn)痛活性幾乎相同，而相反電荷取代的突變體D53K的鎮(zhèn)痛活性顯著降低（下降34%），則進(jìn)一步證實(shí)了53位的側(cè)鏈負(fù)電荷對(duì)毒素鎮(zhèn)痛活性的重要性。

本研究結(jié)果提示東亞鉗蝎神經(jīng)毒素BmK9的Asp53通過其側(cè)鏈羧基的凈電作用在鎮(zhèn)痛活性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這一結(jié)果為蝎毒素結(jié)構(gòu)鎮(zhèn)痛活性關(guān)系研究提供了進(jìn)一步的信息。

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