王東超，魏穎，高佳琪，孫文，秦靈靈，朱寅荻，徐云玲，石浩霞，劉永巧，屈玲霞，徐暾海，劉銅華

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糖痹康顆粒HPLC指紋圖譜研究

王東超1，2，3，魏穎1，2，3，高佳琪1，2，3，孫文2，3，秦靈靈2，3，朱寅荻4，徐云玲1，2，3，石浩霞1，2，3，劉永巧1，2，3，屈玲霞1，2，3，徐暾海1，2，3，劉銅華2，3

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)教育部重點實驗室，北京 100029； 3.中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)北京市重點實驗室，北京 100029；4.溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江溫州 325035

目的 建立糖痹康顆粒HPLC指紋圖譜，科學(xué)評價并有效控制其質(zhì)量，確保其生產(chǎn)的穩(wěn)定性。方法 采用德國默克RP-18 endcapped色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，檢測波長240 nm，進樣量20 μL。采用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》對10批糖痹康顆粒制劑進行相似度評價，并對處方中的9味藥進行相關(guān)性分析。結(jié)果 以漢黃芩苷為參照峰，初步建立糖痹康顆粒HPLC指紋圖譜，10批糖痹康顆粒制劑的HPLC指紋圖譜相似度在0.90以上，標示出25個共有色譜峰，其中18個歸屬到方中各藥材。結(jié)論 該方法分離效果好、準確、簡單，可為糖痹康顆粒質(zhì)量評價提供參考。

糖痹康顆粒；指紋圖譜；相似度

糖尿病的慢性并發(fā)癥如糖尿病周圍神經(jīng)病變、糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變也逐漸成為危害人類健康的殺手[1-2]。糖痹康顆粒由黃芪、桂枝、女貞子、黃芩等中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、解毒化瘀通絡(luò)功效，治療糖尿病周圍神經(jīng)病變療效顯著且安全穩(wěn)定[3-10]。目前糖痹康顆粒制劑尚無明確的質(zhì)量控制標準，制備工藝也待考察。為了建立糖痹康顆粒制劑的質(zhì)量標準，符合現(xiàn)代中藥制劑規(guī)范要求，保證臨床用藥安全有效，本研究建立糖痹康顆粒HPLC指紋圖譜。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀（型號Alliance e2695，PDA檢測器）；Millipore-Q超純水制備儀，法國密理博公司；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；MS205DU電子天平、ML54電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；移液槍，德國Brand公司。

糖痹康顆粒由本實驗室按制劑工藝要求自制；芍藥苷（批號B21148，HPLC≥98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號PM0515SA13，HPLC≥98%）、特女貞苷（批號Z21S3B1，HPLC≥98%）、芍藥內(nèi)酯苷（批號YN1111WA14，HPLC≥91.4%）、千層紙素A（批號Y29D6Y17716，HPLC≥98%）、紅景天苷（批號C30S6Q4065，HPLC≥98%）、Oroxyloside（批號Y19D5J1，HPLC≥98%）、白楊素（批號BA0410BA13，HPLC≥98%）、黃芩苷（批號P03M7F10367，HPLC≥98%）、漢黃芩苷（批號ZM0509BA13，HPLC≥98%）、黃芩素（批號C02A6Y1，HPLC≥98%）、漢黃芩素（批號P19O6F4649，HPLC≥98%），上海源葉生物科技有限公司；芒柄花素（批號111703-200603，HPLC≥98%），中國食品藥品檢定研究院；黃芪（批號1410073，產(chǎn)地甘肅）、女貞子（批號1410025，產(chǎn)地江蘇）、桂枝（批號1410028，產(chǎn)地廣東）、赤芍（批號1410059，產(chǎn)地吉林）、黃芩（批號1410079，產(chǎn)地北京）、黃連（批號1411030，產(chǎn)地湖北）、水蛭（批號140043，產(chǎn)地安徽）、延胡索（批號1405036，產(chǎn)地浙江）、雞血藤（批號1408046，產(chǎn)地廣西），北京市雙橋燕京中藥飲片廠，均符合2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定；水為Millipore-Q制超純水；乙腈（色譜純），Sigma；甲酸（色譜純），F(xiàn)isher Scientific；甲醇（分析純），北京化工廠。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：德國默克RP-18 endcapped色譜柱（5 μm， 250 mm×4.6 mm）；流動相：A為乙腈，B為0.1%甲酸水，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：240 nm；進樣量：20 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取10批糖痹康顆粒，各2.00 g，分別置50 mL量瓶中，加入70%甲醇適量，超聲處理（400 W，40 Hz）40 min，定容至刻度，搖勻，過濾，取濾液，作為供試品溶液，進樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，供HPLC檢測分析。

2.2.2 陽性對照品溶液的制備 分別將黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭、延胡索、雞血藤粉碎，過40目篩，各取2.00 g粉末，按“2.2.1”項下方法制備黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、水蛭、延胡索、雞血藤陽性對照品（單味藥）溶液，進樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，供HPLC檢測分析。

2.2.3 陰性對照品溶液的制備 分別取各味藥陰性對照樣品（缺少某一味藥）2.00 g，按“2.2.1”項下方法，制備成黃芪陰性對照品溶液、女貞子陰性對照品溶液、桂枝陰性對照品溶液、赤芍陰性對照品溶液、黃芩陰性對照品溶液、黃連陰性對照品溶液、水蛭陰性對照品溶液、延胡索陰性對照品溶液、雞血藤陰性對照品溶液，進樣前用0.45 μm微孔濾膜過濾，供HPLC檢測分析。

2.2.4 混合對照品溶液的制備 分別取適量對照品黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素、千層紙素A、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、特女貞苷、芒柄花素、芍藥內(nèi)酯苷、紅景天苷、Oroxyloside，置5 mL容量瓶中，70%甲醇定容，供HPLC檢測分析。

2.3 HPLC指紋圖譜的建立和相似度分析

分別準確吸取10批糖痹康顆粒樣品的供試品溶液和混合對照品溶液，采用“2.1”項下色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖。使用國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A版》，將10批糖痹康顆粒樣品（S1～S10）的圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入，選取參照譜，時間窗口設(shè)為0.5，經(jīng)多點校正和數(shù)據(jù)匹配，以中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，進行相似度分析。

10批糖痹康顆粒樣品的相似度良好，均大于0.90。根據(jù)HPLC圖譜中各色譜峰的相對保留時間，確定共有峰，并選取25個共有峰為特征指紋峰，選取分離度好、出峰時間適中、峰面積較大且穩(wěn)定的漢黃芩苷峰作為參照峰。以漢黃芩苷色譜峰為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積值，共有指紋峰特征參數(shù)見圖1～圖3、表2。10批樣品相對保留時間的RSD為0.01%～0.72%，相對峰面積的RSD為0.90%～2.98%，均符合指紋圖譜要求。

注：1.紅景天苷；2.芍藥內(nèi)酯苷；3.芍藥苷；4.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；5.特女貞苷；6.黃芩苷；7.Oroxyloside；8.漢黃芩苷；9.黃芩素；10.芒柄花素；11.漢黃芩素；12.白楊素；13.千層紙素A

表2 10批糖痹康顆粒相似度

2.4 各特征峰歸屬考察

陽性對照品和陰性對照品色譜圖對比見圖4。通過保留時間與光譜信息對比，對指紋圖譜中的部分共有峰進行了歸屬。其中峰1、峰6、峰7、峰8均來自赤芍，峰2可能來自桂枝、黃連、女貞子，峰3可能來自赤芍、黃連、女貞子，峰4來自雞血藤，峰5、峰12來自女貞子，峰9來自黃芪，峰10、峰14、峰15、峰16、峰18、峰20、峰22、峰23、峰24、峰25均來自黃芩，峰11來自延胡索或者黃芩，峰13來自赤芍或延胡索，峰17來自黃芩或桂枝，峰19來自桂枝或赤芍，峰21來自雞血藤或黃芪。共指認10個色譜峰：峰4（紅景天苷）、峰7（芍藥內(nèi)酯苷）、峰8（芍藥苷）、峰9（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、峰12（特女貞苷）、峰14（黃芩苷）、峰16（Oroxyloside）、峰18（漢黃芩苷）、峰20（黃芩素）、峰21（芒柄花素）、峰22（漢黃芩素）、峰23（白楊素）、峰25（千層紙素A）。

注：S1.樣品；S2.黃芪（-）；S3.黃芪（+）；S4.女貞子（-）；S5.女貞子（+）；S6.桂枝（-）；S7.桂枝（+）；S8.赤芍（-）；S9.赤芍（+）；S10.黃芩（-）；S11.黃芩（+）；S12.黃連（-）；S13.黃連（+）；S14.水蛭（-）；S15.水蛭（+）；S16.延胡索（-）；S17.延胡索（+）；S18.雞血藤（-）；S19.雞血藤（+）；S20.混合對照品

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 精密吸取70%甲醇溶液20 μL作為空白溶液，注入高效液相色譜儀，按“2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果表明，空白溶液對測定結(jié)果無干擾。

2.5.2 精密度考察 取同一糖痹康顆粒供試品溶液，按“2.1”項色譜條件重復(fù)進樣6次，共有峰相對保留時間RSD值為0.01%～0.98%，共有峰相對峰面積RSD值為0.48%～2.73%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.5.3 重復(fù)性考察 取同一批糖痹康顆粒樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下測定，結(jié)果共有峰相對保留時間RSD值為0.01%～0.36%，共有峰相對峰面積RSD值為0.29%～3.05%，表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

2.5.4 穩(wěn)定性考察 取同一糖痹康顆粒供試品溶液，按“2.1”項色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h進樣，測定指紋圖譜。結(jié)果共有峰相對保留時間RSD值為0.02%～1.05%，共有峰相對峰面積RSD值為0.94%～3.02%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)成分穩(wěn)定，符合指紋圖譜的技術(shù)要求。

3 討論

本試驗分析了100%甲醇、70%甲醇、30%甲醇對糖痹康顆粒提取的影響。結(jié)果顯示，70%甲醇效果較好。同時，試驗考察了不同超聲時間（20、30、40、50、60 min）對糖痹康顆粒提取的影響，結(jié)果顯示，超聲40 min優(yōu)于20、30 min，與50、60 min無差異。所以，選擇70%甲醇超聲40 min。

本試驗考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈- 0.1%甲酸水等多種流動相系統(tǒng)，結(jié)果顯示，選用乙腈- 0.1%甲酸水系統(tǒng)略優(yōu)于其他溶劑系統(tǒng)。故選用乙腈-0.1%甲酸水系統(tǒng)作為流動相。

取混合對照品溶液，在190～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，不同對照品在不同波長處都有最大吸收，黃酮類成分在250～280 nm均有較強吸收，而苷類成分在200～230 nm有較強吸收，為了整體有較好的吸收，選擇240 nm。

本試驗通過對精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性方法學(xué)考察，可知糖痹康顆粒中25個共有峰的相對保留時間和相對保留峰面積的RSD＜3%，表明所建立的指紋圖譜測定方法符合中藥色譜指紋圖譜建立的技術(shù)要求，可用于糖痹康顆粒的測定。通過對10批糖痹康顆粒進行HPLC指紋圖譜構(gòu)建，標定了25個共有峰，對其中13個共有峰進行確認，分析了糖痹康顆粒的HPLC指紋圖譜與各藥飲片HPLC圖譜的相關(guān)性，對25個峰進行可能歸屬，明確18個峰。其中黃芪、女貞子、桂枝、赤芍、黃芩、黃連、延胡索、雞血藤均有體現(xiàn)，而水蛭未能得到體現(xiàn)，可能在204 nm處吸收波長較弱或提取方法不適合。糖痹康顆粒HPLC指紋圖譜未體現(xiàn)共有峰表達的藥材，尚有待進一步研究。10批糖痹康顆粒相似度均在0.90以上，表明糖痹康顆粒的制備工藝穩(wěn)定可行，也表明所建立的指紋圖譜的色譜條件具有較好的適用性，為糖痹康顆粒的有效成分研究及其質(zhì)量評價提供了依據(jù)。

[1] DESHPANDE A D, HARRIS-HAYES M, SCHOOTMAN M. Epidemiology of diabetes and diabetes-related complications[J]. Phys Ther,2008, 88(11)：1254-1264.

[2] REUTENS A T, ATKINS R C. Epidemiology of diabetic nephropathy[J]. Contrib Nephrol,2011,170：1-7.

[3] 呂翠巖,張勝容,趙文景,等.糖痹康治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的臨床研究[J].天津中醫(yī)藥,2016,33(1)：5-8.

[4] 呂翠巖.糖痹康干預(yù)糖尿病周圍神經(jīng)病變臨床及作用機制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[5] 張宏.糖尿病周圍神經(jīng)病變證候規(guī)律研究及糖痹康干預(yù)高糖環(huán)境內(nèi)皮細胞的機制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2012.

[6] 謝勤.糖痹顆粒對DM大鼠周圍神經(jīng)病變防治作用的機制研究[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué),2014.

[7] 易文明.糖痹康治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的療效觀察及機制研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué),2015.

[8] 張雅嫻.糖痹康方治療糖尿病周圍神經(jīng)病變的隨機對照研究[D].蘭州：甘肅中醫(yī)學(xué)院,2014.

[9] 呂翠巖,張勝容,徐暾海,等.糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)p38絲裂素活化蛋白激酶及血漿腫瘤壞死因子-α表達的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2016,23(3)：67-69.

[10] 呂翠巖,李秋明,毛穎秋,等.糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠血漿β-內(nèi)啡肽的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2014,21(4)：49-52.

Study on HPLC Fingerprints ofGranules

WANG Dong-chao1,2,3, WEI Ying1,2,3, GAO Jia-qi1,2,3, SUN Wen2,3, QIN Ling-ling2,3, ZHU Yin-di4, XU Yun-ling1,2,3, SHI Hao-xia1,2,3, LIU Yong-qiao1,2,3, QU Ling-xia1,2,3, XU Tun-hai1,2,3, LIU Tong-hua2,3

Objective To establish the HPLC fingerprints ofGranules; To scientifically evaluate and effectively control the quality ofGranules; To ensure its production stability. Methods HPLC was performed on the column of Germany Merck RP-18 endcapped (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) with mobile phase of acetonitrile-0.1% formic acid water; column temperature was 40 ℃; flow rate was 1.0 mL/min; detection wavelength was 240 nm; volume injection was 20 μL. Fingerprint Similarity Evaluation Software (edition 2004A) of Chinese Pharmacopoeia Commission was used to evaluate the similarity of the 10 batches ofGranules, and to analyze the correlations of 9 ingredients inGranules. Results Wogonoside was used as the reference peak, and the common mode for the HPLC fingerprints was set up. The similarities of the 10 batches ofGranules were above 0.930, and altogether 25 common peaks in the chromatograms were found, of which 18 peaks were assigned to Chinese materia medica inGranules. Conclusion The method has good separability and is accurate and simple, which can provide references for the quality control ofGranules.

Granules; fingerprints; similarity

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.019

R284.1

A

1005-5304(2017)06-0075-04

國家科技重大專項-重大新藥創(chuàng)制（2012ZX09102201-001）

徐暾海，E-mail：thxu@yahoo.com

（2016-10-25）

（修回日期：2016-11-22；編輯：陳靜）