劉秋雨，裴日周，錢林林，連增林

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六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

劉秋雨1，裴日周2，錢林林2，連增林3

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102；2.天地散生物醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)（北京）有限公司，北京 100080； 3.北京亦創(chuàng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究院生物中藥研究所，北京 101111

目的 觀察六氧化四砷（As4O6）對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討其作用機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，不同濃度As4O6對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，半定量RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、細(xì)胞周期蛋白A2（Cyclin A2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、p21和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性（＜0.01）；與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，As4O6濃度為9、12、15 μmol/L時(shí)，MCF-7細(xì)胞凋亡率明顯增加（＜0.05，＜0.01）；As4O6高（3 μmol/L）、低（1 μmol/L）濃度均可有效抑制MCF-7細(xì)胞的遷移能力（＜0.01）；隨As4O6濃度增加，Cyclin E1、Caspase-3、p21 mRNA表達(dá)明顯升高，Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)論 As4O6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、周期、侵襲及遷移能力有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與增強(qiáng)Cyclin E1、Caspase-3、p21及抑制Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達(dá)有關(guān)。

六氧化四砷；乳腺癌細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞增殖；侵襲；遷移；細(xì)胞周期

砷劑是古老的抗腫瘤藥物，以常見(jiàn)的氧化劑和硫化劑等形式存在。《本草綱目》載：“砒石又名信石、砒霜，可治爛肉、蝕瘀及腐瘰。”雖然砷劑被沿用至今，但其毒性限制了其適用范圍。三氧化二砷（As2O3）是最廣為熟知的砷劑，臨床用于急性早幼粒細(xì)胞白血病及多種腫瘤的治療。六氧化四砷（As4O6）對(duì)子宮頸癌細(xì)胞[1]、人胃癌細(xì)胞[2]、上皮癌細(xì)胞[3]等均有一定抑制作用，但其對(duì)乳腺癌的干預(yù)研究鮮有報(bào)道。因此，本研究觀察不同濃度As4O6對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡、周期和侵襲、遷移能力的影響，為As4O6干預(yù)乳腺癌的分子作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物及制備

As4O6，純度99.99%，韓國(guó)Chonjisan Co., Ltd.公司。稱取一定量As4O6溶解于水中，配制成5 mmol/L母液，過(guò)濾，室溫保存?zhèn)溆?，臨用時(shí)以培養(yǎng)基稀釋至不同濃度。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)液，Hyclone公司。MTT（Amresco）、二甲基亞砜（DMSO，Amresco）、青鏈霉素混合液（Solarbio）、RT-PCR試劑盒和Trizol，日本TaKaRa公司。Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），YT-CJ-2ND型超凈工作臺(tái)（北京亞泰），MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學(xué)），MULTLSKAN MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司），BIOMATE型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo公司），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），Champ Gel 5000型全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 MTT法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，0.25%胰酶消化后，用含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋成2.5×104個(gè)/mL細(xì)胞懸液，以200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置空白孔、調(diào)零孔和As4O6給藥孔。As4O6給藥濃度分別為4、8、16、32、64 μmol/L，200 μL/孔，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加100 μL DMSO，室溫振蕩15 min。待沉淀完全溶解后，于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)定光密度（OD）。計(jì)算細(xì)胞存活率（實(shí)驗(yàn)組OD值÷對(duì)照組OD值×100%）。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后加入含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液（0、1、3、6、9、12、15 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集所有細(xì)胞，嚴(yán)格按照Annexin V-FITC試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞凋亡。

2.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲能力

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，以2.5×105個(gè)/mL密度接種于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板后，吸棄上清液，用10 μL吸頭在6孔板上劃“一”字，PBS輕輕沖洗2次。每孔分別加入不含F(xiàn)BS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液（0、1、3 μmol/L），各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，100倍倒置顯微鏡下，分別于藥物作用0、24、48 h拍照。計(jì)算劃痕愈合率[（0 h劃痕面積－24/48 h劃痕面積）÷0 h劃痕面積×100%]。

2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡及遷移相關(guān)基因的表達(dá)

采用Trizol兩步法提取MCF-7細(xì)胞內(nèi)的總RNA，測(cè)定OD260/OD280值。按TaKaRa RT-PCR試劑盒說(shuō)明合成cDNA第一鏈，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR退火溫度及循環(huán)數(shù)：β-actin為58 ℃、30循環(huán)，p21為60.5 ℃、40循環(huán)，細(xì)胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）為58 ℃、30循環(huán)，細(xì)胞周期蛋白A2（Cyclin A2）為57.7 ℃、40循環(huán)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）為60.5 ℃、45循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見(jiàn)表1。

表1 基因引物序列

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±表示，多組間比較采用方差分析。＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度As4O6干預(yù)后，MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01）。隨As4O6濃度增加，MCF-7細(xì)胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性，見(jiàn)圖1。

注：與0 μmol/L比較，**P＜0.01

4.2 六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)了不同濃度As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞的凋亡作用，Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)檢測(cè)顯示，細(xì)胞機(jī)械損傷程度非常小，細(xì)胞因機(jī)械損傷的數(shù)目很少（＜1%）。當(dāng)As4O6濃度為1、3、6 μmol/L時(shí)，細(xì)胞凋亡率均＜10%，與對(duì)照組（0 μmol/L）比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。因此，在0～3 μmol/L間選擇適當(dāng)濃度，研究As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移侵襲作用的影響。隨As4O6濃度增加（9、12、15 μmol/L），細(xì)胞凋亡率升高，與0 μmol/L比較，細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4.3 六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力的影響

與0 μmol/L比較，低濃度（1 μmol/L）和高濃度（3 μmol/L）As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞的遷移能力均有明顯抑制作用（＜0.01），隨As4O6濃度增加，抑制作用明顯增強(qiáng)，呈劑量依賴性，見(jiàn)圖3。

4.4 六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因表達(dá)的影響

瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)凋亡（Caspase-3、p21）和周期（Cyclin A2、Cyclin E1）相關(guān)基因表達(dá)情況。結(jié)果表明，As4O6作用于MCF-7細(xì)胞24 h后，隨As4O6給藥濃度增加，Cyclin E1、p21 mRNA表達(dá)呈升高趨勢(shì)，Cyclin A2 mRNA表達(dá)呈遞減趨勢(shì)，呈劑量依賴性；在As4O6高濃度（15 μmol/L）時(shí)，Caspase-3、p21、Cyclin A2、Cyclin E1 mRNA表達(dá)水平與0 μmol/L比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見(jiàn)圖4。

As4O6 0 μmol/L As4O6 1 μmol/L As4O6 3 μmol/L As4O6 6 μmol/L As4O6 9 μmol/L As4O6 12 μmol/L As4O6 15 μmol/L

0 μmol/L1 μmol/L3 μmol/L 0 h 24 h 48 h

As4O6/（μmol/L） 0 3 6 9 12 15 Caspase-3596 bp β-actin206 bp p21426 bp β-actin206 bp Cyclin A2382 bp β-actin206 bp Cyclin E1305 bp β-actin206 bp

注：與0 μmol/L比較，*＜0.05，**＜0.01

圖4 As4O6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞Caspase-3、p21、 Cyclin A2、Cyclin E1基因表達(dá)的影響

4.5 六氧化四砷對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達(dá)的影響

MMP-9與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，其mRNA表達(dá)隨As4O6濃度增加而逐漸降低。高濃度（15 μmol/L）As4O6與0 μmol/L比較，MMP-9 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01），見(jiàn)圖5。

As4O6/（μmol/L） 0 3 6 9 12 15 MMP-9154 bp β-actin206 bp

5 討論

研究表明，As4O6可通過(guò)引起腫瘤細(xì)胞凋亡[4]、抑制腫瘤血管新生[5]、增加實(shí)體腫瘤對(duì)放射的敏感性[6]等多種方式發(fā)揮抗腫瘤藥效作用。但其對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制尚不明確，而乳腺癌在全球女性癌癥患病率排名居首，迫切需要有效的治療藥物。因此，研究As4O6治療乳腺癌的作用機(jī)制十分必要。

細(xì)胞凋亡和周期是衡量腫瘤細(xì)胞的重要指標(biāo)，細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡之間的失衡也可導(dǎo)致腫瘤生成。本研究結(jié)果表明，As4O6對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖抑制作用明顯，并隨As4O6濃度增加而增強(qiáng)，當(dāng)濃度達(dá)到64 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率＜50%。當(dāng)濃度為9、12、15 μmol/L時(shí)，作用于MCF-7細(xì)胞24 h可明顯引起凋亡。Caspase-3和p21是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的2種基因，正常情況下細(xì)胞質(zhì)中Caspase-3無(wú)活性，以酶原形式存在，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，它被一系列反應(yīng)激活后誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[7]。同時(shí)，p21基因的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，并可使細(xì)胞周期阻滯于G1、G2或S期。而本研究結(jié)果表明，隨As4O6濃度增加，Caspase-3和p21均呈增加趨勢(shì)，且流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞凋亡情況與上述特點(diǎn)相符，提示As4O6可通過(guò)促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡途徑達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖目的。為進(jìn)一步明確As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了細(xì)胞周期相關(guān)基因（Cyclin A2和Cyclin E1）的表達(dá)情況。Cyclin A2為一種細(xì)胞周期的正向調(diào)節(jié)蛋白，可與細(xì)胞周期依賴性激酶（CDK1和CDK2）形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)節(jié)DNA合成和促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂的雙重作用，同時(shí)，Cyclin E1是G1期重要的調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，促進(jìn)細(xì)胞周期的G1/S移行過(guò)程，并且是移行過(guò)程中的主要限速因子，一旦Cyclin E1基因擴(kuò)增或表達(dá)失控則可能誘發(fā)腫瘤[8-10]。本研究結(jié)果表明，As4O6可抑制Cyclin A2基因的表達(dá)，經(jīng)As4O6干預(yù)后，MCF-7細(xì)胞Cyclin A2表達(dá)顯著降低，表明As4O6可以通過(guò)干預(yù)細(xì)胞周期達(dá)到治療目的。而Cyclin E1與Cyclin A2的結(jié)果相反，As4O6干預(yù)后，MCF-7細(xì)胞Cyclin E1表達(dá)顯著升高，這一現(xiàn)象可能與細(xì)胞周期阻滯相關(guān)。因此，更加明確了As4O6對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡和周期相關(guān)基因的作用機(jī)制。

乳腺癌是由乳房組織病變導(dǎo)致的癌癥，由于乳腺癌細(xì)胞喪失了正常細(xì)胞的特性，細(xì)胞之間的黏附能力下降，容易發(fā)生脫落，形成的游離癌細(xì)胞可隨血液或淋巴液散布周身，使乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。MMP-9是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的主要參與者。由于Ⅳ型膠原是構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的基本骨架，而MMP-9分泌的明膠酶可降解Ⅳ型膠原[11]，因此MMP-9在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，經(jīng)As4O6干預(yù)后，MCF-7細(xì)胞MMP-9 mRNA表達(dá)呈降低趨勢(shì)，提示As4O6可通過(guò)抑制MMP-9基因的表達(dá)有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力。進(jìn)一步結(jié)合劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，表明As4O6可有效抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，As4O6可通過(guò)干預(yù)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞阻滯、細(xì)胞侵襲及遷移能力等多途徑發(fā)揮藥效。As4O6可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡，將其阻滯在S期，破壞腫瘤細(xì)胞DNA合成來(lái)抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與p21、Caspase-3、Cyclin E1、Cyclin A2有關(guān)。此外，As4O6可通過(guò)抑制MMP-9分泌，阻止細(xì)胞基底膜降解，達(dá)到對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

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Effects of Tetra-arsenic Oxide on Proliferation, Migration and Invasion of Human Breast Cancer MCF-7 Cells

LIU Qiu-yu1, PEI Ri-zhou2, QIAN Lin-lin2, LIAN Zeng-lin3

Objective To observe the effects of tetra-atsenic oxide (As4O6) on the proliferation, migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells; To explore its potential mechanism. Methods The human breast cancer MCF-7 cells were regarded as the research object and cultured in vitro, with different concentrations of As4O6using to intervene in MCF-7 cells. The cell proliferation was detected by MTT assay; the flow cytometry and wound-healing assay were used to detect the cell apoptosis and migration, respectively. The expressions of Cyclin E1, Cyclin A2, Caspase 3, p21 and MMP-9 mRNA were accessed by semi quantitative RT-PCR. Results As4O6had a significant inhibitory effect on the proliferation of MCF-7 cells in a dose dependent manner. Compared with the control group (0 μmol/L), the apoptosis rate increased significantly when the concentration of As4O6was 9, 12, 15 μmol/L (<0.01). Either As4O6at high (3 μmol/L) or low (1 μmol/L) concentration could effectively inhibit the migration of MCF-7 cells (<0.01). With the increasing concentration of As4O6, the expressions of Cyclin E1, Caspase 3, and p21 mRNA significantly increased, while the expressions of Cyclin A2 and MMP-9 mRNA significantly decreased (<0.05,<0.01). Conclusion As4O6can significantly inhibit the proliferation, cycle, invasion and migration of breast cancer MCF-7 cells, and the mechanism may be related to the increase of expressions of cyclin E1, caspase 3, p21 and inhibition of expressions of cyclin A2 and MMP-9.

tetra-arsenic oxide; breast cancer cells; cell apoptosis; cell proliferation; invasion; migration; cell cycle

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.011

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0044-05

連增林，E-mail：zenglinlian@aliyun.com

（2016-12-09）

（修回日期：2016-12-19；編輯：向宇雁）