邊小娜+張家新

摘 要：褪黑素對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的降低非常有效。它通過活性氧和活性氮物質(zhì)的直接解毒手段實(shí)現(xiàn)這種作用，也可以間接通過結(jié)合褪黑素受體刺激抗氧化酶同時(shí)抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton / Haber-Weiss反應(yīng)的過渡金屬離子，減少破壞性毒性羥基自由基的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的減少。在降低氧化應(yīng)激能力方面，褪黑素的代謝產(chǎn)物也具有類似的功能。褪黑素在細(xì)胞內(nèi)的普遍存在但不均等的分布，包括其在線粒體中的高濃度，可能有助于其抵抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的能力。該文就褪黑激素的抗氧化作用研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要綜述。

關(guān)鍵詞：褪黑激素；抗氧化；自由基

中圖分類號(hào) R96 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）09-0024-04

Abstract：Melatonin is uncommonly effective in reducing oxidative stress under a remarkably large number of circumstances. It achieves this effect via direct detoxification of reactive oxygen species and active nitrogen substances. It can bind to the melatonin receptors which indirectly stimulate antioxidant enzymes and chelate transition metals which are involved in the Fenton/Haber-Weiss reactions；in doing so，melatonin reduces the formation of the devastatingly toxic hydroxyl radical resulting in the reduction of oxidative stress. The metabolic products of melatonin also have similar functions in reducing oxidative stress. Melatonin's ubiquitous but unequal intracellular distribution，including its high concentrations in mitochondria，likely aid in its capacity to resist oxidative stress and cellular apoptosis. In this paper，the progress of anti-oxidation of melatonin is briefly reviewed.

Key words：Melatonin；Antioxidant；Free radical

褪黑激素（melatonin，MT）是一種由哺乳動(dòng)物松果體分泌的吲哚類激素，具有調(diào)節(jié)情緒、睡眠、免疫、性行為、生殖及晝夜節(jié)律等多種生理功能。近年來研究表明，褪黑激素對(duì)衰老、腫瘤生長(zhǎng)、慢性病以及老年病的發(fā)生和發(fā)展起著重要的調(diào)節(jié)作用。20世紀(jì)90年代初，Tan等[1]首次報(bào)道MT具有抗氧化作用，是一種高效的內(nèi)源性自由基清除劑，能有效清除羥自由基、過氧亞硝基陰離子等活性氧。許多研究表明，MT的抗氧化作用是其抗衰老、預(yù)防老年病、預(yù)防慢性病發(fā)生的重要因素。

褪黑激素（melatonin，MT），是一種由松果腺分泌的吲哚類激素，其化學(xué)名稱是N-乙酰基-5-甲氧基色胺。吲哚環(huán)上存在5-甲氧基和N-乙?；?，這兩個(gè)基團(tuán)是MT清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）的必需基團(tuán)，其中5-甲氧基可以在生理狀態(tài)下極大的增強(qiáng)MT捕獲自由基的能力，且N-乙?；梢员Ｗo(hù)MT不被單胺氧化酶降解。此外，MT結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有游離的巰基和羥基，自身不容易發(fā)生氧化還原反應(yīng)。MT是完全依賴向親電子中間體和部分還原的缺電子生物大分子提供電子而發(fā)揮其抗氧化效應(yīng)[2]，也就是說MT是提供電子來清除ROS的抗氧化劑。

1 褪黑素——調(diào)節(jié)其它抗氧化酶的活性

抗氧化物酶活性在正常光照下呈現(xiàn)內(nèi)源性節(jié)律。隨著時(shí)間的推移，這些周期性的改變可能取決于褪黑激素的晝夜節(jié)律。將動(dòng)物暴露于恒定光照下，消除內(nèi)源性褪黑激素節(jié)律性變化，發(fā)現(xiàn)該動(dòng)物的抗氧化物酶活性夜間上升的現(xiàn)象消失。這說明褪黑素生理水平的變化足以改變抗氧化防御體系。眾所周知，讓動(dòng)物連續(xù)暴露于光照下可以使其夜間褪黑素不再升高，這與雞的幾個(gè)組織中GSH-Px和SOD活性在夜間增加減少相關(guān)[3]。在其他嚙齒動(dòng)物也有類似的發(fā)現(xiàn)，由松果體切除術(shù)引起的褪黑激素缺乏可降低大鼠幾種組織中的GSH-Px活性水平[4]。添加外源性褪黑素可以使大鼠和雞的組織中GSH-Px、SOD的活性增強(qiáng)[5-8]。機(jī)體內(nèi)褪黑激素的改變可以使抗氧化酶活性改變。

尹華祺探究了褪黑素對(duì)熱應(yīng)激小鼠的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激時(shí)小鼠的總抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活都降低，而MDA含量升高，這說明熱應(yīng)激已對(duì)小鼠的抗氧化體系造成損害，而褪黑素抗熱應(yīng)激的小鼠總抗氧化能力、SOD酶活、GSH-Px酶活均高于小鼠的生理水平，MDA含量則低于小鼠的生理水平，這表明了褪黑素能降低機(jī)體由熱應(yīng)激引起的氧化損傷[9]。代國杰發(fā)現(xiàn)褪黑素可以顯著降低小鼠因脂多糖（LPS）導(dǎo)致的機(jī)體的ROS水平，提高機(jī)體的T-AOC水平，增強(qiáng)了機(jī)體抗氧化物酶SOD、GSF-Px的活性，提高機(jī)體的抗氧化能力[10]。洪汝濤、陳世林等人用褪黑素處理急性酒精性肝損傷大鼠，發(fā)現(xiàn)褪黑激素能顯著升高抗氧化物酶SOD的活性，增強(qiáng)急性酒精性肝損傷大鼠的抗氧化能力[11]。當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激條件時(shí)，外源性褪黑素可以是機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性和表達(dá)升高，以更好地保護(hù)機(jī)體免受自由基的氧化損傷。

有研究發(fā)現(xiàn)在多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系中添加褪黑激素，褪黑激素可以誘導(dǎo)合成一些新蛋白，而這些蛋白可以調(diào)節(jié)3種抗氧化酶Cu/ZnSOD，MnSOD和GSH-Px基因的表達(dá)。同時(shí)褪黑激素也使編碼Cu/ZnSOD和GSH-Px的mRNA的半衰期減少，而不改變編碼MnSOD的mRNA的半衰期[12]。這表明，培養(yǎng)基中的褪黑素可能誘導(dǎo)產(chǎn)生更多具有較短半衰期的mRNA的水平即前兩種酶。最后，納摩爾濃度的褪黑激素足以誘導(dǎo)抗氧化基因表達(dá)。如上所述，褪黑激素受體參與抗氧化酶基因表達(dá)調(diào)控的可能性極高。

顏賽梅通過培養(yǎng)Muller細(xì)胞，研究褪黑素及褪黑素受體調(diào)節(jié)抗氧化酶活性的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與正常生理?xiàng)l件相比較，高糖條件下Muller細(xì)胞的褪黑素膜受體（MT1/MT2）基因的表達(dá)量顯著升高。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在高糖條件下，細(xì)胞中核因子2相關(guān)因子（Nrf-2）和亞鐵血紅素氧化酶（HO-1）的表達(dá)量在添加褪黑激素組的表達(dá)量顯著高于不添加褪黑素組，同時(shí)在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加褪黑激素和褪黑激素受體拮抗劑luzindole與僅添加褪黑激素相比較，細(xì)胞中核因子2相關(guān)因子（Nrf-2）和亞鐵血紅素氧化酶（HO-1）的表達(dá)量顯著減低[13]，這說明褪黑激素通過與褪黑激素受體結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)NRF-2因子，從而調(diào)控HO-1的活性。Nrf-2是一種重要的抗氧化因子，可以結(jié)合抗氧化反應(yīng)元件（ARE）誘導(dǎo)大部分內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)蛋白的表達(dá)，如亞鐵血紅氧化酶（HO-1）、硫氧化還原蛋白、谷胱甘肽（GSH）等，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)氧化還原的再平衡。蛋白激酶C磷酸化Nrf-2可能是其轉(zhuǎn)錄增加的關(guān)鍵步驟，對(duì)于氧化應(yīng)激敏感的蛋白激酶途徑，如MAPKs家族中的ERKs和P38等可能參與Nrf-2與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）的結(jié)合。褪黑素與褪黑素受體結(jié)合，活化Gq蛋白，激活質(zhì)膜上的磷脂酶C，使質(zhì)膜上PIP2水解成IP3和DAG。IP3與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的IP3配體們鈣通道結(jié)合，開啟鈣通道，使胞內(nèi)鈣離子濃度升高，胞內(nèi)高濃度的鈣離子和DAG可以激活蛋白激酶C（PKC），活化的PKC可以調(diào)節(jié)MAPK家族，從而調(diào)節(jié)抗氧化物酶的表達(dá)。

2 褪黑素——螯合重金屬鹽離子

盡管銅對(duì)于細(xì)胞生理是必需的，但當(dāng)它處于高濃度時(shí)，它可以參與產(chǎn)生羥基自由基的Fenton/Haber-Weiss反應(yīng)。由于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)抗氧化酶銅超氧化物歧化酶（CuSOD）減少，導(dǎo)致銅的缺乏從而減弱了抗氧化防御進(jìn)程。此外，一些神經(jīng)疾病的共同特征是銅和/或其他金屬的過量，其中包括阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、和肝性關(guān)節(jié)退化（Wilson病），這些條件中的一些相關(guān)的分子損傷可能是過量銅離子的促氧化作用的結(jié)果，所以調(diào)節(jié)銅等金屬離子的水平與細(xì)胞需要一致是極為重要的。在1998年，使用吸收伏安法作為評(píng)估方法，Limson等[14]報(bào)道了褪黑激素可以結(jié)合鋁，鎘，銅，鐵，鉛和鋅，就像金屬硫蛋白。褪黑素與這些金屬的相互作用是濃度依賴性的。褪黑激素參與芬頓反應(yīng)的形式為螯合鐵2+和鐵3+。如果鐵與蛋白質(zhì)例如血紅蛋白結(jié)合，褪黑激素可以將4價(jià)鐵如血紅蛋白氧化鐵蛋白還原回3價(jià)鐵，從而重新構(gòu)建蛋白質(zhì)的生物活性。這將類似于褪黑激素在遇到高毒性羥基時(shí)的還原作用。尤其是在大腦中，由于金屬硫蛋白是蛋白質(zhì)，金屬產(chǎn)生的自由基會(huì)損害過渡金屬與金屬硫蛋白形成的任意結(jié)合鍵，使得金屬硫蛋白在過渡金屬結(jié)合方面起著較不重要的作用。相比之下，在大腦中褪黑素中和所產(chǎn)生的自由基并減少氧化損傷顯得尤其重要。相對(duì)于血液中的濃度，CSF中高水平的褪黑激素可以為腦提供額外的氧化應(yīng)激保護(hù)的可能性[15]。在腦中，褪黑激素除了其直接清除活性和間接抗氧化作用，可以替代或補(bǔ)充金屬硫蛋白作為過渡金屬的主要粘合劑。

Parmar等[16]研究了褪黑素降低肝臟勻漿中銅介導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化的能力。在這項(xiàng)研究中，褪黑激素可以通過直接清除足夠的毒性自由基引發(fā)脂質(zhì)過氧化降低脂質(zhì)損害；通過電化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)褪黑素結(jié)合Cu2+和Cu+，這些功能可能會(huì)降低肝臟脂質(zhì)的氧化。Mayo等[12]研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以降低由Cu2+/H2O2引起的蛋白質(zhì)損傷，而在比較研究中，Gulcin等人[17]發(fā)現(xiàn)褪黑激素具有比α-生育酚或合成抗氧化劑丁基化羥基丁基苯甲醚或丁基化羥基甲苯更高的Fe2+螯合活性。褪黑素還顯著減少Al3+，Zn2+，Cu2+，Mn2+和Fe2+與淀粉樣蛋白β肽的相互作用[18]。

在最近褪黑激素的金屬螯合活性相關(guān)的研究中，發(fā)現(xiàn)褪黑激素結(jié)合銅離子時(shí)產(chǎn)生穩(wěn)定的復(fù)合物有兩種機(jī)制，直接螯合機(jī)制（DCM）和偶聯(lián)去質(zhì)子化螯合機(jī)制（CDCM）。在生理?xiàng)l件下，預(yù)測(cè)CDCM是Cu2+螯合的主要途徑[19]。褪黑激素螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗壞血酸混合物中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。褪黑激素也阻止了Fenton/Haber-Weiss反應(yīng)中的初始步驟，從而降低了氧自由基的形成。在生物體中會(huì)發(fā)生金屬催化產(chǎn)生分子損傷，褪黑素有螯合這些有害離子的能力。

3 褪黑素代謝產(chǎn)物抗氧化

褪黑激素的直接自由基清除活性已確定25a了。該過程的后續(xù)報(bào)告還確定了當(dāng)褪黑素清除兩種自由基時(shí)形成的一種新的褪黑素代謝物—環(huán)-3-羥基褪黑素C3OHM。研究發(fā)現(xiàn)C3OHM及其下游代謝物N-乙?；?N-甲酰基-5-甲氧基神木胺（AFMK）和N-乙?；?5-甲氧基神經(jīng)胺（AMK）都是褪黑素的抗氧化相關(guān)物，他們以及褪黑素都可以減緩分子，細(xì)胞和組織，包括人類細(xì)胞的氧化損傷[20-22]。因此，褪黑激素的第一代，第二代和第三代代謝物都已被證明是極好的自由基清除劑。褪黑激素的這些級(jí)聯(lián)產(chǎn)物可能使其能夠清除多達(dá)10種自由基產(chǎn)物，這與對(duì)單個(gè)氧化分子解毒的經(jīng)典自由基清除劑形成鮮明的對(duì)比。

研究發(fā)現(xiàn)褪黑激素以及其代謝物C3OHM，AFMK和AMK都具有螯合銅的能力，降低氧化應(yīng)激。通過比較褪黑激素、C3OHM、AFMK和AMK的螯合銅能力，發(fā)現(xiàn)褪黑激素及其代謝物結(jié)合銅離子機(jī)制是一樣的[23]，在生理?xiàng)l件下，預(yù)測(cè)CDCM是Cu2+螯合的主要途徑。褪黑激素及其代謝物螯合Cu2+并完全抑制Cu2+/抗壞血酸混合物中誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激[19]。類似地，褪黑激素、C3OHM和AFMK阻止了Haber-Weiss反應(yīng)中的初始步驟，從而降低了氧自由基的形成。在這些發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，褪黑激素除了作為自由基清除級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的初始分子，也參與金屬螯合級(jí)聯(lián)反應(yīng)[24]，從而降低機(jī)體內(nèi)由金屬離子引起的氧化損傷。

4 褪黑素——線粒體的靶向抗氧化劑

在正常需氧細(xì)胞中，線粒體發(fā)生氧化磷酸化產(chǎn)生大量ATP供細(xì)胞正常所需外，也產(chǎn)生大量的活性氧，與此同時(shí)細(xì)胞中也有一些常規(guī)的抗氧化劑來抵消ROS。但是這些常規(guī)的抗氧化劑不能在線粒體中大量存在，如內(nèi)源性輔酶Q10和維生素E。為實(shí)現(xiàn)他們?cè)诰€粒體中的大量存在，輔酶Q10和維生素E需要與親脂性焦磷酸磷銨素陽離子（TPP）共軛[24，25]。TPP與Q10或維生素E的共軛物MitoQ或MitoE可以快速穿過細(xì)胞和線粒體膜，并且結(jié)合的物質(zhì)在線粒體積聚的濃度比未結(jié)合的抗氧化劑高達(dá)幾百倍。而褪黑素可以自由快速穿過線粒體膜，在線粒體中發(fā)揮直接抗氧化功能。Lowes等人比較了褪黑素與兩種線粒體靶向抗氧化劑MitoQ和MitoE在減少氧化損傷中的相對(duì)作用，發(fā)現(xiàn)這3種物質(zhì)在減少氧化損傷和抑制促炎細(xì)胞因子方面具有相同的保護(hù)作用[26]。褪黑素可以像MitoQ和MitoE一樣快速穿過細(xì)胞和線粒體膜，并且在線粒體中積聚結(jié)合的的濃度比常規(guī)的抗氧化劑高達(dá)幾百倍，是線粒體的靶向抗氧化劑。這將與褪黑素水平在肝線粒體中比血漿線粒體中高得多結(jié)果一致[27，28]，這與線粒體可能是細(xì)胞內(nèi)褪黑激素合成的位點(diǎn)的設(shè)想一致[29]。褪黑素在線粒體中的定位可能是其強(qiáng)抗氧化活性的的關(guān)鍵。

褪黑素對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的降低非常有效。它通過活性氧和活性氮物質(zhì)的直接解毒手段實(shí)現(xiàn)這種作用，也可以間接通過結(jié)合褪黑素受體刺激抗氧化酶同時(shí)抑制促氧化酶的活性，或者螯合涉及Fenton/Haber-Weiss反應(yīng)的過渡金屬離子，減少破壞性毒性羥基自由基的形成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激的減少。在降低氧化應(yīng)激能力方面，褪黑素的代謝產(chǎn)物也具有類似的功能。褪黑素在細(xì)胞內(nèi)的普遍存在但不均等的分布，包括其在線粒體中的高濃度，可能有助于其抵抗氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的能力。

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