高燦燦，劉佳玫，栗軍杰，陸兆新，呂鳳霞，張充，趙海珍，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南京210095）

檢測(cè)乙酰微小桿菌的雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法的建立

高燦燦，劉佳玫，栗軍杰，陸兆新，呂鳳霞，張充，趙海珍，別小妹*1

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南京210095）

以鮮切葉菜中的乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）為研究對(duì)象，建立定量檢測(cè)E.acetylicum的雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）方法。以前期試驗(yàn)發(fā)掘到的微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）的特異性基因P401_RS0117025和E.acetylicum的特異性基因oxi_50582462為檢測(cè)靶點(diǎn)，對(duì)其設(shè)計(jì)特異性探針，并對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以12株E.acetylicum為陽(yáng)性對(duì)照，以4株微小桿菌屬內(nèi)其他種的菌株以及10株非微小桿菌的腐敗菌/致病菌作為陰性對(duì)照，對(duì)建立的RT-PCR進(jìn)行特異性檢測(cè)；通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備、靈敏度、可重復(fù)性來(lái)評(píng)價(jià)該方法的有效性。最后，應(yīng)用該RT-PCR方法對(duì)不同貯藏日期鮮切葉菜中的E.acetylicum進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：本研究設(shè)計(jì)的探針特異性良好；檢測(cè)靶點(diǎn)P401_RS0117025與oxi_50582462的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值分別為0.994和0.999，且重復(fù)性好；該方法的DNA檢測(cè)限為1.629×10－7ng/μL，純菌菌落檢測(cè)限為3.4 CFU/mL，并能對(duì)鮮切葉菜中的E.acetylicum進(jìn)行靈敏檢測(cè)。此外，還建立了“Ct（閾值）-Nt（菌體濃度）”的數(shù)量關(guān)系，能對(duì)供試樣品中的E.acetylicum進(jìn)行絕對(duì)定量。總之，本研究建立了準(zhǔn)確、靈敏、高效檢測(cè)食品中腐敗菌E.acetylicum的RT-PCR定量方法，為食品貨架期預(yù)測(cè)提供了理論依據(jù)。

乙酰微小桿菌；雙重實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；TaqMan探針

SummaryExiguobacteriumsp.has been figured out to be the main spoilage bacteria on many kinds of food,and it has the potential to be the main spoiler.BacteriaExiguobacteriumhave already been isolated from extreme environment and they have evolved and acquired some resistance including thermotolerance,cold resistance,alkali resistance,and osmotolerance.TheExiguobacteriumcan normally metabolize under 4℃storage temperature.Further,Exiguobacteriumhas strong proteolysis ability to damage nutrient and food,and it can form biofilm,not only increasing the resistance to detergents and preservatives,but also consuming nutrients to grow and reproduce.The present study aims to establish a rapid identification method ofExiguobacterium acetylicumbased on a double real-time polymerase chain reaction(RT-PCR).

The study took the genesP401_RS0117025andoxi_50582462,which were screened in the early experiment and were specific toExiguobacteriumsp.andE.acetylicumrespectively,as detection targets.The specificity of the PCR assay was verifiedwith the DNA of 12E.acetylicumstrains and 14 non-E.acetylicumstrains;the effectiveness of the assay was evaluated by the foundation of standard curve,as well as its repeatability.The sensitivity of different DNA and cell concentrations was identified.

The results demonstrated that the specific genes and primers of the early experiment were both well-specific.The specific evaluation experiment results showed that the probes T-291 and T-2B were also well-specific.TheR2values of standard curve were 0.994 and 0.999,respectively,indicating that the assay was credible,and the RT-PCR showed high repeatability.When DNA of different concentrations were added as templates,there was no obvious different in standard deviation of threshold(Ct), and the coefficient of variation of the same concentration was fluctuation during 0.51 to 1.12.Even though at 1.629×10－4ng/μL, its repeatability was well maintained,which indicated that the assay could show high repeatability at the low DNA concentration. The sensitivity-evaluation showed that the DNA detection limit of the assay was 1.629×10－7ng/μL,and the detection limit of pure bacteria colonies was 3.4 CFU/mL without enrichment culture.In addition,the high-sensitivity resulted in its outcoming of short-time cast,for it did not need the step of enrichment culture,which was different from other studies.Finally,the mathematical relationship betweenCtandNt(colony-forming units,CFU)was developed by software Origin 9.It wasCt=－1.759×Nt+31.678, theR2value of which was 0.939.When applied to the fresh-cut leafy vegetables,the assay and the equation could detect rapidly and accurately the CFU on them.

In sum,this study establishes an accurate,sensitive and efficient double RT-PCR assay to detect quantitatively food spoilage bacteriaE.acetylicum.It lays a theoretical basis for food shelf-life prediction,and provides some references to the supply chain of fresh-cut vegetables.

有關(guān)食品腐敗菌的鑒定與檢測(cè)研究已有許多，但是由于貯藏環(huán)境不同，食品中的主要腐敗菌也不盡相同，其中，在低溫及其他極端環(huán)境（極酸、冷凍等）貯藏的食品中微小桿菌為其主要腐敗菌。例如：蔣榮榮等[1]研究發(fā)現(xiàn)，在直接接觸食品的酸菜外包膜上的微生物中，相對(duì)于真菌與其他細(xì)菌，其主要污染菌為微小桿菌，并成為酸菜中的主要腐敗菌；同樣，崔慧玲等[2]在鮮切生菜的優(yōu)勢(shì)腐敗菌分離研究中指出，貯藏在4℃條件下的鮮切生菜中的主要腐敗菌是微小桿菌；在冷藏的南美白對(duì)蝦[3]和鹽水鴨[4]等產(chǎn)品中均有檢出微小桿菌。此外，從多種其他極端環(huán)境中也分離得到微小桿菌，它們已進(jìn)化出與其生存環(huán)境相對(duì)應(yīng)的嗜極性，包括耐/嗜冷性、耐/嗜熱性、耐/嗜鹽性、耐/嗜堿性等[5]?？梢?jiàn)，微小桿菌在冷藏條件及多數(shù)極端貯藏條件下可以正常代謝。該菌還具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)水解能力[6-7]，導(dǎo)致產(chǎn)品被降解，加速食物腐??；此外，它還能產(chǎn)生物膜[8]，不僅增加了微生物去污劑、防腐劑的抗性，而且通過(guò)捕獲營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，加速其生長(zhǎng)繁殖，并包裹和保護(hù)其他有害細(xì)菌和真菌。就鮮切葉菜而言，由于加工和貯藏條件不同，其上的主要腐敗菌不同于普通蔬菜。鮮切葉菜的生產(chǎn)需要經(jīng)過(guò)多項(xiàng)組織破壞性工藝，導(dǎo)致汁液外流，該營(yíng)養(yǎng)環(huán)境適合多種細(xì)菌生長(zhǎng)[9-10]；但是鮮切葉菜需貯藏在4℃冷藏條件下，該條件不利于一般腐敗菌的代謝，而嗜冷菌得到了滋生[11-12]，這也在一定程度上對(duì)其他腐敗菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了拮抗作用[13-14]。

對(duì)于有害細(xì)菌的檢測(cè)已有多種方法被研究并成功應(yīng)用。其中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）不僅具有普通PCR的優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速、重復(fù)性佳、特異性好[15-17]，而且它可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)[18]；此外，它還可以通過(guò)不同的引物設(shè)計(jì)在同一反應(yīng)體系中同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行擴(kuò)增；最重要的是，它可以實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。KOBAYSHI等[19]對(duì)RTPCR法、組織學(xué)檢驗(yàn)法、快速尿素酶檢驗(yàn)法、細(xì)菌培養(yǎng)和尿素呼氣試驗(yàn)在臨床樣品胃組織檢測(cè)中的靈敏度和特異性的研究結(jié)果表明，RT-PCR方法的靈敏度和特異性均為100%，為各種方法之最佳。PATEL等[20]用分子信標(biāo)為探針的RT-PCR方法與傳統(tǒng)的生理生化檢測(cè)方法對(duì)感染沙門(mén)菌的雞肉進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法檢測(cè)需要3～8 d，而RT-PCR檢測(cè)僅需18 h，并且靈敏度高。RIBERIO等[21]在幽門(mén)螺旋桿菌（Helicobacter pylori）的檢測(cè)中指出，RTPCR一次可以檢測(cè)96個(gè)樣品，實(shí)現(xiàn)了一次性高通量檢測(cè)。ZHAI等[22]建立了檢測(cè)海德?tīng)柋ど抽T(mén)菌血清型B的雙重RT-PCR方法，該方法具有較強(qiáng)的抗背景干擾能力，在被感染3.6×105CFU/mL鼠傷寒沙門(mén)菌或3.3×104CFU/mL大腸埃希菌背景下，對(duì)海德?tīng)柋ど抽T(mén)菌的最低檢出限為2.2 CFU/mL，表現(xiàn)出很好的特異性?？梢?jiàn)，RT-PCR快速檢測(cè)技術(shù)不僅顯示出了更好的時(shí)效性、特異性等傳統(tǒng)方法的優(yōu)點(diǎn)，也逐步被開(kāi)發(fā)并在實(shí)際中得到了應(yīng)用。

本研究以鮮切葉菜中的乙酰微小桿菌（Exiguobacterium acetylicum）為研究對(duì)象，以前期試驗(yàn)發(fā)掘的特異性基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)，運(yùn)用已篩選到的特異性引物和設(shè)計(jì)的TaqMan探針建立并優(yōu)化反應(yīng)體系，最終建立快速、準(zhǔn)確、靈敏、可重復(fù)、高效的檢測(cè)E.acetylicum的雙重RT-PCR方法，為在低溫或其他極端環(huán)境中貯藏的食品的主要腐敗菌控制提供快速檢測(cè)方法，進(jìn)而為食品貨架期預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

以12株乙酰微小桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，以4株微小桿菌屬內(nèi)其他種的菌株和10株非微小桿菌的腐敗菌/致病菌作為陰性對(duì)照（表1），檢驗(yàn)引物的特異性。

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

Luria-Bertani（LB）液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水定容至1 L，完全溶解后分裝，121℃滅菌20 min，待用。LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入1.8%瓊脂，121℃滅菌20 min，待用。引物、T-291和T-2B探針（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成）；實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒[2×Premix Ex TaqTM（Probe qPCR），購(gòu)買(mǎi)自TaKaRa公司，大連]；基因組DNA提取試劑盒（Omega Bio-Tek,Norcross,GA,美國(guó)）。

1.1.3 儀器

Nanodrop 2000核酸濃度測(cè)定儀（上?；蛴邢薰荆籐DZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺(tái)（江蘇省蘇州市凈化設(shè)備有限公司）；HYL-A全溫?fù)u瓶柜（江蘇省太倉(cāng)市強(qiáng)樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；5418高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）；DK-8 D型電熱恒溫水槽（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；WH-3微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（StepOnePlusTMsystem，ABI公司，美國(guó)）；AY 120電子天平（SHIMADZU公司，日本）；JS-380c全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀（上海培清科技有限公司）。

表1 菌株及RT?PCR檢測(cè)結(jié)果Table 1 Strains used and their RT-PCR specificity

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌基因組DNA提取與測(cè)定

參照細(xì)菌基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)菌基因組，并通過(guò)核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定基因組DNA提取液的濃度。

1.2.2 引物及探針的設(shè)計(jì)與合成

在前期試驗(yàn)中參考ZHAI等[22]的方法，通過(guò)生物信息學(xué)比對(duì)與普通PCR檢測(cè)，發(fā)掘出2組特異性引物（表2）：微小桿菌屬特異性引物EaG-291（基因P401_RS0117025），以及乙酰微小桿菌特異性引物EaS-2B（基因oxi_50582462）。

本試驗(yàn)使用軟件Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)這2對(duì)引物對(duì)應(yīng)的TaqMan探針，并對(duì)所設(shè)計(jì)的探針的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，最后，運(yùn)用這2對(duì)引物與探針共同建立一個(gè)RT-PCR反應(yīng)體系。

表2 檢測(cè)E.acetylicum的RT-PCR的引物及探針Table 2 Primer and probe sets for RT-PCR detection ofE.acetylicum

1.2.3 引物和探針濃度優(yōu)化

前期試驗(yàn)通過(guò)普通PCR方法對(duì)這2對(duì)引物的退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，退火溫度為54℃時(shí)，條帶亮度更為清晰且沒(méi)有產(chǎn)生明顯的二聚體；因此，本試驗(yàn)選擇54℃為其最優(yōu)退火溫度。

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒[2×Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)]使用說(shuō)明書(shū)構(gòu)建反應(yīng)體系，其中，20 μL總反應(yīng)體系中包含PCR混合物10 μL，ROX染料0.4 μL，模板DNA 2 μL，選擇2個(gè)引物（EaG-291和EaS-2B）的濃度在0.2～0.6 μmol/L之間，2條探針（T-291和T-2B）的濃度在0.1～0.3 μmol/L之間，用ddH2O補(bǔ)至足量，分別組合進(jìn)行RT-PCR，通過(guò)比較獲得熒光信號(hào)所需閾值Ct的大小來(lái)判斷引物和探針的最優(yōu)濃度比例。每個(gè)反應(yīng)設(shè)置3個(gè)平行，并以ddH2O作為陰性對(duì)照。反應(yīng)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，54℃退火15 s，72℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)；同時(shí)，在延伸階段采集熒光信號(hào)。

1.2.4 特異性評(píng)價(jià)

用表1中的細(xì)菌基因組DNA作為模板，按照

1.2.3 節(jié)建立的RT-PCR方法分別進(jìn)行擴(kuò)增，用以評(píng)價(jià)探針與所建體系的特異性。結(jié)果判定依據(jù)：以空白對(duì)照作為參照，Ct值大于35的反應(yīng)判定為陰性，Ct值小于35的反應(yīng)判定為陽(yáng)性。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

為了確定該反應(yīng)體系2個(gè)擴(kuò)增曲線的有效性，將過(guò)夜培養(yǎng)的E.acetylicum按1.2.1節(jié)的方法提取基因組DNA與濃度測(cè)定，再用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)謩e作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 靈敏度評(píng)價(jià)

DNA模板靈敏度評(píng)價(jià)：將過(guò)夜培養(yǎng)的E. acetylicum菌液提取基因組DNA，并測(cè)定樣品基因DNA濃度，再用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋至n×10－9ng/μL，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

菌落靈敏度評(píng)價(jià)：將過(guò)夜培養(yǎng)的E.acetylicum菌液用無(wú)菌水10倍梯度稀釋?zhuān)⑦x擇1×10－6、1×10－7和1×10－83個(gè)稀釋梯度涂布平板計(jì)數(shù)，計(jì)算初始菌體濃度。同時(shí)，將每個(gè)稀釋梯度（1×10－1～1×10－9）取1 mL提取基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。

1.2.7 重復(fù)性評(píng)價(jià)

通過(guò)核酸定量?jī)x測(cè)定樣品基因DNA濃度，再用ddH2O進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)沟脴悠分械腄NA濃度為1.629、1.629×10－2和1.629×10－4ng/μL，并進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分析不同梯度濃度的模板對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系的影響，以及在低濃度模板條件下反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

1.2.8 定量關(guān)系擬合

取1 mL不同菌體濃度的E.acetylicum菌液提取的基因組作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，再運(yùn)用軟件Origin 9對(duì)“Ct-菌體濃度（Nt）”之間的數(shù)量關(guān)系進(jìn)行線性擬合。

1.2.9 RT-PCR對(duì)鮮切葉菜中E.acetylicum的檢測(cè)應(yīng)用

參照文獻(xiàn)[23]的方法制備鮮切葉菜，并按150 g分裝在聚乙烯保鮮袋中，4℃貯藏。按照GB 47892—2010的方法洗脫收集鮮切葉菜中的細(xì)菌，按照1.2.1節(jié)的方法提取基因組DNA，按照1.2.3節(jié)建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。在貯藏過(guò)程中，每2 d檢測(cè)1次。

2 結(jié)果

2.1 引物和探針濃度優(yōu)化

2.1.1P401_RS0117025檢測(cè)靶點(diǎn)的引物和探針濃度的優(yōu)化

由表3可見(jiàn)，在RT-PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.4 μmol/L、探針濃度為0.2 μmol/L的組合對(duì)以P401_RS0117025基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)的擴(kuò)增曲線的Ct值達(dá)到最小，為12.24±2.01，明顯優(yōu)于其他試驗(yàn)組合。因此，引物EaG-291和探針T-291的最優(yōu)濃度分別選擇為0.4 μmol/L和0.2 μmol/L。

2.1.2oxi_50582462檢測(cè)靶點(diǎn)的引物和探針濃度的優(yōu)化

由表4可見(jiàn)，在RT-PCR反應(yīng)體系中，引物濃度為0.2 μmol/L、探針濃度為0.2 μmol/L的組合對(duì)以oxi_50582462基因?yàn)闄z測(cè)靶點(diǎn)的擴(kuò)增曲線的Ct值達(dá)到最小，為10.65±0.42，優(yōu)于其他試驗(yàn)組合。因此，引物EaS-2B和探針T-2B的最優(yōu)濃度均選擇為0.2 μmol/L。

綜上，檢測(cè)乙酰微小桿菌的雙重RT-PCR方法的最終反應(yīng)體系為：2×PCR混合物10 μL，0.4 μmol/ L EaG-291前后引物各0.8 μL，0.2 μmol/L T-291探針0.4 μL，0.2 μmol/L EaS-2B前后引物各0.4 μL，0.2 μmol/L T-2B探針0.4 μL，ROX染料0.4 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 4.4 μL，總體積20 μL。

表3 引物和探針濃度對(duì)P401_RS0117025目標(biāo)序列閾值的影響Table 3 Effect of primer and probe concentrations on the threshold(Ct)ofP401_RS0117025target sequence in RT-PCR system

表4 引物和探針濃度對(duì)oxi_50582462目標(biāo)序列閾值的影響Table 4 Effect of primer and probe concentrations on the threshold(Ct)ofoxi_50582462target sequence in RT-PCR system

2.2 特異性評(píng)價(jià)

以表1中的細(xì)菌基因組DNA作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，所有的微小桿菌均能采集到P401_RS0117025基因擴(kuò)增曲線的FAM熒光，但是只有12株E.acetylicum能同時(shí)采集到P401_RS0117025基因擴(kuò)增曲線的FAM熒光和oxi_50582462基因擴(kuò)增曲線的JOE熒光，而對(duì)10株非微小桿菌屬細(xì)菌的DNA擴(kuò)增中2種熒光信號(hào)均未檢測(cè)到（表1）。這表明本研究建立的RT-PCR檢測(cè)體系具有良好的特異性。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

不同濃度梯度DNA擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，用2個(gè)熒光擴(kuò)增曲線繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值分別為0.994和0.999。說(shuō)明建立的RT-PCR反應(yīng)體系的有效性較高。

圖1 檢測(cè)靶點(diǎn)P401_RS0117025(A)和oxi_50582462(B)基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of RT-PCR for targets ofP401_RS0117025(A)andoxi_50582462(B)genes

圖2 檢測(cè)靶點(diǎn)P401_RS0117025（A）和oxi_50582462（B）基因的RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of RT-PCR for targets ofP401_RS0117025(A)andoxi_50582462(B)genes

2.4 靈敏度評(píng)價(jià)

2.4.1 DNA模板靈敏度評(píng)價(jià)

由表5可見(jiàn)：當(dāng)反應(yīng)體系中基因組DNA濃度≥1.629×10－6ng/μL時(shí)，2對(duì)引物均能獲得陽(yáng)性結(jié)果；當(dāng)基因組DNA的濃度達(dá)到1.629×10－7ng/μL時(shí)，P401_RS0117025基因擴(kuò)增曲線的Ct值為36.06± 0.46，結(jié)果為陰性，oxi_50582462基因的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。因此，該RT-PCR反應(yīng)體系的DNA檢測(cè)限為1.629×10－7ng/μL。

2.4.2 菌落靈敏度評(píng)價(jià)

由表6可見(jiàn)：當(dāng)E.acetylicum的菌體濃度≥3.4 CFU/mL時(shí)，2對(duì)引物均能獲得陽(yáng)性結(jié)果；當(dāng)其濃度為3.4×10－1CFU/mL時(shí)，檢測(cè)結(jié)果為陰性。因此，該RT-PCR反應(yīng)體系的純菌菌落檢測(cè)限為3.4 CFU/mL。

2.5 重復(fù)性評(píng)價(jià)

從表7可以看出，當(dāng)DNA濃度為1.629、1.629× 10－2和1.629×10－4ng/μL時(shí)，隨著樣品中基因組DNA濃度的降低，RT-PCR檢測(cè)體系中2條擴(kuò)增曲線的Ct值升高；但是在不同的基因組DNA濃度條件下，該反應(yīng)體系的2個(gè)Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差沒(méi)有明顯變化，在0.30以?xún)?nèi)，變異系數(shù)在0.51～1.12之間變動(dòng)。說(shuō)明該RT-PCR檢測(cè)體系的2對(duì)擴(kuò)增引物與2條探針在DNA濃度較低（1.629×10－4ng/μL）時(shí)仍能保持較好的重復(fù)性。

表5 E.acetylicumDNA模板的RT-PCR靈敏度測(cè)定Table 5 Sensitivity of RT-PCR assay for DNA template

表6 E.acetylicum純菌菌落的RT-PCR靈敏度測(cè)定Table 6 Sensitivity of RT-PCR assay in pure culture ofE.acetylicum

表7 RT-PCR檢測(cè)體系的可重復(fù)性分析Table 7 Repeatability analysis of RT-PCR assay

2.6 定量關(guān)系擬合

運(yùn)用已建立的RT-PCR方法，對(duì)E.acetylicum不同菌體濃度菌液提取的基因組進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表8。通過(guò)軟件Origin 9對(duì)“Ct-Nt”之間的數(shù)量關(guān)系進(jìn)行線性擬合，得到如下方程：Ct=－1.759×Nt+31.678，其R2=0.939，擬合效果較好。

表8 RT-PCR檢測(cè)E.acetylicum不同菌體濃度的Ct值Table 8 Ctvalue of RT-PCR detecting different cell concentrations ofE.acetylicum

2.7 RT-PCR對(duì)鮮切葉菜中E.acetylicum的檢測(cè)應(yīng)用

采用建立的RT-PCR方法對(duì)低溫條件下不同貯藏時(shí)間的鮮切葉菜上的E.acetylicum進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果（表9）表明，在無(wú)前增菌條件下，本文建立的RTPCR方法能夠很好地對(duì)鮮切葉菜中的E.acetylicum進(jìn)行檢測(cè)；結(jié)合2.6節(jié)中的定量方程可對(duì)鮮切葉菜上的特定腐敗菌E.acetylicum進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)。

表9 低溫條件下RT-PCR對(duì)鮮切葉菜中E.acetylicum的檢測(cè)結(jié)果Table 9 Detection result ofE.acetylicumon fresh-cut leafy vegetables(FCLVs)at low temperature by RT-PCR

3 討論

本文以鮮切葉菜中的主要腐敗菌E.acetylicum為研究對(duì)象，發(fā)掘了特異的TaqMan探針，并建立了檢測(cè)該菌的雙重RT-PCR。該方法特異性好、靈敏度高、檢測(cè)快速，并且能對(duì)樣品中的E.acetylicum進(jìn)行定量檢測(cè)。

本研究使用前期試驗(yàn)中發(fā)掘到的特異性靶點(diǎn)（P401_RS0117025和oxi_50582462）與引物（EaG-291和EaS-2B），對(duì)檢測(cè)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了特異性TaqMan探針（T-291和T-2B），使用該探針建立了針對(duì)食品中E.acetylicum的RT-PCR檢測(cè)方法。雖然在DEBORA等[24]的研究中建立了分離嗜常溫與嗜熱特性的微小桿菌的RT-PCR方法，但其主要是針對(duì)不同環(huán)境偏好特性的微小桿菌的區(qū)分。本研究建立的方法主要解決對(duì)食品中主要腐敗菌E.acetylicum的檢測(cè)，且對(duì)該腐敗菌的研究在國(guó)內(nèi)外也是首次提出，為低溫或極端環(huán)境貯藏的食品的質(zhì)量監(jiān)督提供了新的、特定的檢測(cè)指標(biāo)與方法。

本研究建立的方法在供試的16株微小桿菌與10株非微小桿菌的致病菌/腐敗菌中表現(xiàn)出良好的特異性，說(shuō)明該方法對(duì)分離菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株都表現(xiàn)出較高的特異性。而且該檢測(cè)體系在線性相關(guān)分析中2條擴(kuò)增曲線的R2值均能達(dá)到0.99以上，與WALL等[25]建立的RT-PCR檢測(cè)體系的相關(guān)性一致，即優(yōu)化后的反應(yīng)體系具有良好的有效性。此外，在重復(fù)性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中該方法的變異系數(shù)在0.51～1.12之間變動(dòng)，說(shuō)明該方法具有良好的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

該RT-PCR方法對(duì)基因組DNA的最低檢出限為1.629×10－7ng/μL；且在檢測(cè)前無(wú)前增菌處理的情況下，對(duì)純菌菌落的最低檢出限即可達(dá)到3.4 CFU/ mL。而GALLELLI等[26]建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法對(duì)假單胞菌的最低檢出限為5×104～5×105CFU/ mL。說(shuō)明本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度高。

傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定方法需要前增菌與分離單菌落，并需生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合分子生物學(xué)共同進(jìn)行鑒定，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大。本研究建立的檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)少，在很大程度上優(yōu)于傳統(tǒng)方法。雖然RT-PCR方法在一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間，但是王建昌等[27]建立的大腸埃希菌O157:H7的RT-PCR檢測(cè)方法仍需要6～10 h的前增菌試驗(yàn)，這對(duì)于保質(zhì)期極短的冷藏食品并不適宜。本研究建立的檢測(cè)方法靈敏度高，在無(wú)前增菌條件下，對(duì)純菌菌落的最低檢出限可達(dá)3.4 CFU/mL，比普通的RT-PCR檢測(cè)更加快速，這對(duì)于貨架期短、需低溫貯藏的食品中的E.acetylicum檢測(cè)具有重要意義。

為防止假陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，本研究采用微小桿菌屬特異性基因P401_RS0117025和E.acetylicum特異性基因oxi_50582462作為檢測(cè)靶點(diǎn)，同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。這種試驗(yàn)設(shè)計(jì)能夠很好地排除假陽(yáng)性結(jié)果，提高了方法的特異性和準(zhǔn)確性[15-16]。同時(shí)，本研究還探索了Ct值與Nt（菌體濃度）之間的線性關(guān)系，并建立起“Ct-Nt”關(guān)系方程。該方程能對(duì)樣品中的E. acetylicum進(jìn)行絕對(duì)定量，從而為低溫或極端環(huán)境貯藏的食品的貨架期預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。并且，在對(duì)樣品檢測(cè)中，本研究建立的RT-PCR方法能夠快速、靈敏地對(duì)鮮切葉菜中的E.acetylicum進(jìn)行特異性檢測(cè)，體現(xiàn)了很好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

4.1 本研究設(shè)計(jì)了特異性探針。針對(duì)前期試驗(yàn)發(fā)掘到的Exiguobacteriumsp.特異性基因P401_RS0117025設(shè)計(jì)TaqMan探針T-291，針對(duì)E. acetylicum特異性基因oxi_50582462設(shè)計(jì)TaqMan探針T-2B；經(jīng)12株E.acetylicum、4株Exiguobacteriumsp.和10株非微小桿菌驗(yàn)證顯示，2條探針的特異性良好。

4.2 建立了E.acetylicum的雙重TaqMan探針的RT-PCR檢測(cè)方法。對(duì)體系中引物EaG-291、EaS-2B與探針T-291、T-2B優(yōu)化后，得到最優(yōu)的反應(yīng)體系為EaG-291 0.8 μL，EaS-2B 0.4 μL，T-291 0.4 μL，T-2B 0.4 μL，PCR混合物10 μL，ROX染料0.4 μL，模板DNA 2 μL，以無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL。

4.3 對(duì)建立的RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。由該反應(yīng)體系繪制的2條標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2分別為0.994和0.999，且經(jīng)12株E.acetylicum和4株Exiguobacteriumsp.驗(yàn)證，呈現(xiàn)出良好的特異性。該方法的DNA靈敏度為1.629×10－7ng/μL，純菌菌落靈敏度為3.4 CFU/mL，且在不同濃度的DNA模板條件下均呈現(xiàn)出較好的可重復(fù)性。

4.4 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線建立了Ct值與Nt之間的數(shù)量關(guān)系方程：Ct=－1.759×Nt+31.678。同時(shí)，本研究建立的雙重RT-PCR方法可對(duì)樣品中的E.acetylicum進(jìn)行絕對(duì)定量，從而可為低溫或極端環(huán)境貯藏的食品的貨架期預(yù)測(cè)提供理論依據(jù)。

[1]蔣榮榮,趙煒,王洋,等.酸菜包外包膜污染菌分析.中國(guó)釀造, 2013,32(1):133-136. JIANG R R,ZHAO W,WANG Y,et al.Analysis of polluted microorganisms on the outer packages of Chinese sauerkraut.China Brewing,2013,32(1):133-136.(in Chinese with English abstract)

[2]崔慧玲,陳安鈞,羅嬋,等.鮮切生菜貯藏過(guò)程中優(yōu)勢(shì)腐敗細(xì)菌的多樣性分析.食品與發(fā)酵工業(yè),2014,40(7):223-229. CUI H L,CHEN A J,LUO C,et al.The diversity analysis of dominant spoilage bacteria in fresh-cut lettuce during storage.Food and Fermentation Industries,2014,40(7):223-229.(in Chinese with English abstract)

[3]趙海鵬,謝晶,嚴(yán)文蓉.南美白對(duì)蝦冷藏過(guò)程中的細(xì)菌分離、初步鑒定及菌相分析.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2011,27(1):164-168. ZHAO H P,XIE J,YAN W R.Isolation and identification of bacteria inPenaeus vannammeiduring cold storage and analysis of composition of microorganism.Jiangsu Journal of Agricultural Sciences,2011,27(1):164-168.(in Chinese with English abstract)

[4]LIU F,WANG D Y,DU L H,et al.Diversity of the predominant spoilage bacteria in water-boiled salted duck during storage.Journal of Food Science,2010,75(5):317-321.

[5]VISHNIVETSKAYA T A,KATHARIOU S,TIEDJE J M.TheExiguobacteriumgenus:Biodiversity and biogeography.Extremophiles,2009,13(3):541-555.

[6]HARADA J,TAKAKU S,WATANABE K.An on-demand metalloprotease from psychro-tolerantExiguobacterium undaeSu-1,the activity and stability of which are controlled by the Ca2+concentration.Bioscience,Biotechnology and Biochemistry,2012, 76(5):986-992.

[7]SOROKULOVA I,KRUMNOW A,GLOBA L,et al.Efficient decomposition of shrimp shell waste usingBacillus cereusandExiguobacterium acetylicum.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2009,36:1123-1126.

[8]KUMAR C G,ANAND S K.Significance of microbial biofilms in food industry:A review.International Journal of Food Microbiology,1998,42(1/2):9-27.

[9]FALAH A M F,NADINE M D,SURYANDONO A.Effects of storage conditions on quality and shelf-life of fresh-cut melon (Cucumis MeloL.)and papaya(Carica PapayaL.).Procedia Food Science,2015,3:313-322.

[10]MUKHOPADHYAY S,RAMASWAMY R.Application of emerging technologies to controlSalmonellain foods:A review.Food Research International,2012,45(2):666-677.

[11]RANIERI M L,IVY R A,MITCHELL W R,et al.Real-time PCR detection ofPaenibacillusspp.in raw milk to predict shelf life performance of pasteurized fluid milk products.Applied and Environmental Microbiology,2012,78(16):5855-5863.

[12]LEE D H,KIM J B,KIM M,et al.Microbiota on spoiled vegetables and their characterization.Journal of Food Protection,2013,76(8):1350-1358.

[13]PINTO L,IPPOLITO A,BARUZZI F.Control of spoilerPseudomonasspp.on fresh cut vegetables by neutral electrolyzed water.Food Microbiology,2015,50:102-108.

[14]BOWER C K,DAESCHEL M A.Resistance responses of microorganisms in food environments.International Journal of Food Microbiology,1999,50(1/2):33-44.

[15]HEID C A,STEVENS J,LIVAK K J,et al.Real time quantitative PCR.Genome Research,1996,6(10):986-994.

[16]NARANG N,FRATAMICO P M,TILLMAN G,et al. Performance comparison of afliCh7real-time PCR assay with an H7 latex agglutination test for confirmation of the H type ofEscherichia coliO157:H7.Journal of Food Protection,2009,72: 2195-2197.

[17]李彬,栗寒,李艷華,等.豇豆花葉病毒和黑眼豇豆花葉病毒RTReal time PCR及IC-RT-Real time PCR檢測(cè)方法研究.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,33(2):105-109. LI B,SU H,LI Y H,et al.Research on RT-Real time PCR and ICRT-Real time PCR detection ofCow pea mosaic virusandBlackeye cow pea mosaic virus.Journal of Nanjing Agricultural University, 2010,33(2):105-109.(in Chinese with English abstract)

[18]張小敏,周斌,何丹妮,等.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)豬源Mx1方法的建立及應(yīng)用.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(1):92-96. ZHANG X M,ZHOU B,HE D N,et al.Establishment and application of the SYBR greenⅠreal-time PCR assay for detection of porcine antiviral protein Mx1 gene.Journal of Nanjing Agricultural University,2013,36(1):92-96.(in Chinese with English abstract)

[19]KOBAYASHI D,EISHI Y,OHKUSA T,et al.Gastric mucosal density ofHelicobacter pyloriestimated by real-time PCR compared with results of urea breath test and histological grading.Journal of Medical Microbiology,2002,51(4):305-311.

[20]PATEL J R,BHAGWAT A A,SANGLAY G C,et al.Rapid detection ofSalmonellafrom hydrodynamic pressure-treated poultry using molecular beacon real-time PCR.Food Microbiology,2006,23:39-46.

[21]RIBERIO M L,ECCLISSATO C C,MATTOS R G,et al. Quantitative real-time PCR for the clinical detection ofHelicobacter pylori.Genetics and Molecular Biology,2007,30(2): 431-434.

[22]ZHAI L G,YU Q,BIE X M,et al.Development of a PCR test system for specific detection ofSalmonellaParatyphi B in foods.FEMS Microbiology Letters,2014,355:83-89.

[23]謝晶,張利平,高志立,等.雞毛菜的品質(zhì)動(dòng)力學(xué)分析及貨架期預(yù)測(cè)模型.食品科學(xué),2014,35(10):268-272. XIE J,ZHANG L P,GAO Z L,et al.Kinetic quality changes and shelf life prediction of Chinese small cabbage(Brassica rapaL. Chinensis group).Food Science,2014,35(10):268-272.(in Chinese with English abstract)

[24]DEBORA F R,JAMES M T.Multi-locus real-time PCR for quantitation of bacteria in the environment revealsExiguobacteriumto be prevalent in permafrost.FEMS Microbiology Ecology,2007,59(2):489-499.

[25]WALL S J,EDWARDS D R.Quantitative reverse transcriptionpolymerase chain reaction(RT-PCR):A comparison of primerdropping,competitive,and real-time PCRs.Analytical Biochemistry,2002,300:269-273.

[26]GALLELLI A,TALOCCI S,PILOTTI M,et al.Real-time and qualitative PCR for detectingPseudomonas syringaepv. actinidiaeisolates causing recent outbreaks of kiwifruit bacterial canker.Plant Pathology,2014,63:264-276.

[27]王建昌,王金鳳,段永生,等.基于內(nèi)參的大腸埃希菌O157:H7實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立.食品科學(xué),2015,36 (20):226-231. WANG J C,WANG J F,DUAN Y S,et al.Development of realtime quantitative PCR assay for the detection ofE.ColiO157:H7 based on internal amplification reference.Food Science,2015,36 (20):226-231.(in Chinese with English abstract)

Identification of Exiguobacterium acetylicum by a double real-time polymerase chain reaction assay.

GAO Cancan,LIU Jiamei,LI Junjie,LU Zhaoxin,Lü Fengxia,ZHANG Chong,ZHAO Haizhen,BIE Xiaomei*（College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China）

Exiguobacterium acetylicum;double real-time polymerase chain reaction;TaqMan probe

Q-31

A

10.3785/j.issn.1008-9209.2016.04.191

Journal of Zhejiang University(Agric.&Life Sci.),2017,43(2):153-162

國(guó)家自然科學(xué)基金（31271828）。

別小妹(http://orcid.org/0000-0002-2175-0164)，E-mail:bxm43@njau.edu.cn

（First author）：高燦燦（http://orcid.org/0000-0003-0122-5335），E-mail:2013108084@njau.edu.cn

2016-04-19；接受日期(Accepted)：2016-06-08