牛廷獻，王紅義，郭曉宇，陸 璐，申 健，肖 攀，馮小明

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科， 蘭州 730050)

研究報告

蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數(shù)及低氧相關基因的比較

牛廷獻，王紅義，郭曉宇，陸 璐，申 健，肖 攀，馮小明

(蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院動物實驗科， 蘭州 730050)

目的 研究蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數(shù)及低氧相關基因表達量的差異。方法 采用TaqMan探針實時定量PCR(real-time quantitative PCR)技術，檢測蕨麻豬與巴馬小型豬心、肝、脾、肺、腎低氧反應基因表達量的變化。結果 蕨麻豬的腎臟、脾臟指數(shù)低于巴馬小型豬，蕨麻豬的心臟、肺臟指數(shù)高于巴馬小型豬。蕨麻豬血管內(nèi)皮細胞生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF) 與低氧誘導因子-1α (hypoxia inducible factor 1, HIF-1α)在肺、腎中的表達量明顯比普通豬高(P<0.05或P<0.01)；促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)只在肺中比巴馬小型豬高(P<0.05)。結論 不同物種臟器指數(shù)可能是物種對物質(zhì)環(huán)境、能量環(huán)境、外界病原體、能量代謝需求等綜合因素進化適應的結果。蕨麻豬低氧相關基因明顯比巴馬小型豬高，揭示在基因方面蕨麻豬具有較強的高原適應性。

蕨麻豬；巴馬小型豬；臟器指數(shù)；低氧相關基因；比較

小型豬在解剖學，生理學，疾病發(fā)生機理等方面與人相似，在生命科學、人類疾病動物模型及異種器官移植供體等研究領域中具有重要的實驗應用價值[1]。蕨麻豬又稱合作豬，生活在青藏高原甘南藏族自治州合作地區(qū)，常年處于惡劣高寒氣候和低劣的飼養(yǎng)條件下生長，使其具有極強的高原環(huán)境適應能力。并且長期以來在封閉環(huán)境中自繁自養(yǎng)免受外來血緣的雜交影響，從而它形成了一個穩(wěn)定的原始的地方小型豬種。它生長緩慢、體形矮小、繁殖能力強，是典型的高原小型豬種之一[2,3]。高原低氧、高寒環(huán)境使得在此生態(tài)條件下的生物具有巨大的生存并進化選擇的能力。長期生存在高原環(huán)境中，其生物自身組織器官也在高原環(huán)境中慢慢進化，逐步適應高原環(huán)境特點，許多高等哺乳動物都產(chǎn)生了相應的高原適應機制。同時動物遺傳進化的分子生物學機制也受到高原環(huán)境的影響，長期在此生態(tài)體系中，具有適應高原環(huán)境的分子遺傳特性[4,5]，其中低氧誘導因子通路是一個典型的高原適應性密切相關的信號通路，它主要維持低氧環(huán)境下哺乳動物機體內(nèi)氧的穩(wěn)定，從而提升機體的低氧適應能力。本研究對長期生活在高海拔地區(qū)的蕨麻豬和生活在低海拔地區(qū)的巴馬小型豬臟器指數(shù)及各器官低氧相關基因的表達差異進行比較分析，研究蕨麻豬在適應高原環(huán)境的生理功能特點及低氧適應的分子生物學特征。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

蕨麻豬與巴馬小型豬均為雄性各6只，體重(15±3)kg。蕨麻豬為甘南合作地區(qū)散戶飼養(yǎng)，巴馬小香豬購自第四軍醫(yī)大學動物實驗中心(生產(chǎn)許可證號：SCXK(軍)2012-006)。

1.2 試劑

Trizol(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；TaqMan探針(上海生工生物工程有限公司合成)；凝膠回收試劑盒(MN公司)。

1.3 標本采集

動物麻醉處死，取心、肝、脾、肺、腎，用紗布將血漬擦拭干后進行器官稱重，切去少量裝與凍存管，存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 探針及引物

18S：p5 AGTCGCCGTGCCTACCAT，p3 CGGGTC GGGAGTGGGTAAT，大小 129 bp，探針CGCCTGCTG CCTTCCTTGGATGTG；VEGF：p5 TTCTTGCCTCGCTC TATCTTC，p3 CGACGAAGGTCTGGAGTGT，大?。?57 bp，探針 CCACTGAGGAGTTCAA CATCGCCAT； EPO：p5 CCGTGACATCCTTAGGTTTGA，p3 AGGT GACTTGGTGCTCCC，大小 210 bp，探針TGTCCACC ACTTCGCTCACCACCA；HIF-1α：p5 CGACAGATAA CACATTAGGACTTC，p3 TGCTACAACATCACCATAC AGT，大?。?22 bp，探針 TGGAAGTCGGACAGCCT CACC。

1.5 RNA提取及逆轉錄cDNA

RNA的抽提及逆轉錄說明書實施。

1.6 RT-PCR

反應體系：Taq酶0.3 μL (5U)，dNTPs 1 μL，上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)，探針1 μL (20 pM)，用水補足到30 μL；。程序為95℃ 5 min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。

1.7 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 蕨麻豬與巴馬小型豬臟器指數(shù)比較

兩種小型豬新鮮器官臟器指數(shù)及比較結果見表1。兩種小型豬肝臟指數(shù)的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，其它肺、脾、心、腎器官臟器指數(shù)均有明顯的差異(P<0.05)。其中蕨麻豬肺、心臟器指數(shù)明顯大于巴馬小型豬，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而蕨麻豬脾、腎器官指數(shù)顯著小于巴馬小型豬，其差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.2 低氧反應基因RT-PCR條件優(yōu)化

組織提取RNA之后，反轉錄成cDNA，然后對VEGF、EPO和HIF-1α進行RT-PCR檢測，以18S作為內(nèi)參。首先對PCR退火溫度進行優(yōu)化，PCR條件的優(yōu)化結果如圖1，可見不同的退火溫度18S、EPO 60℃退火溫度表達量較高，因此選擇60℃為PCR的退火溫度。HIF-1α和VEGF的表達量在55℃時表達量較高，因此選擇55℃為其PCR的退火溫度。其次以4個梯度濃度的質(zhì)粒為模板進行RT-PCR擴增，各基因的擴增曲線線性關系良好，18S r=-0.99982，VEGF r=-0.99796，EPO r=-0.99848，HIF-1α r=-0.99562。

2.3 低氧相關基因的表達量變化

比較蕨麻豬與巴馬小型豬低氧相關基因血管內(nèi)皮細胞生長因子Endothelial growth Factor, VEGF)、促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)、低氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor-1, HIF-1α)在不同器官表達量的差異。結果表明：3個低氧表達基因在蕨麻豬肺組織中表達明顯高于巴馬小型豬(P<0.05)，HIF-1α在腎組織中的表達量蕨麻豬明顯比巴馬小型豬高(P<0.05)；而VEGF在腎中的表達量蕨麻豬顯著高于巴馬小型豬高(P<0.01)(圖2)。

a,b,c,d分別代表18S, HIF-1α, EPO, VEGF；M為marker, N為陰性對照；其中50、55、60分別代表退火溫度50℃、55℃、60℃。圖1 PCR條件優(yōu)化a,b,c,d represent as 18S, HIF-1α, EPO, VEGF；M as marker; N as negative control; 50, 55, 60 represent as 50℃, 55℃, 60℃.Fig.1 The optimized PCR condition

圖2 低氧表達基因在各臟器中的表達量Fig.2 Expression of hypoxia-related genes in the organs

3 討論

高原土生動物高寒環(huán)境低氧適應機制主要研究高原動物的生理功能特點及其低氧調(diào)控的分子機制，是近年高原醫(yī)學研究的熱點。內(nèi)臟器官關系到動物的繁殖、生長發(fā)育、季節(jié)及棲息環(huán)境變化，是動物生理功能的物質(zhì)基礎，其器官質(zhì)量及指數(shù)反映動物的生理功能，可以間接反映出動物對特定環(huán)境適合度，通常被作為一種與動物代謝功能相關的指標[7,8]。

心臟不僅是全身組織的供氧中樞，也是清除低氧代謝產(chǎn)物乳酸的主要器官之一。心臟質(zhì)量的增加可提高動物的御寒的能力[9]。本研究中發(fā)現(xiàn)蕨麻豬的心臟指數(shù)均明顯大于巴馬小型豬，這是因為蕨麻豬常年生活在高原低氧高寒環(huán)境中，心臟指數(shù)的增大可以提高其抗寒冷的能力，并具有強大的供養(yǎng)及氧代謝能力應對低氧環(huán)境。肺臟是動物體內(nèi)外氣體交換場所，同時肺臟在動物呼吸過程中起到維持體溫恒定，并具有承載氧氣的能力。高海拔地區(qū)動物適應低氧環(huán)境的一個途徑就是增加肺臟容積和擴散能力[10]。蕨麻豬棲居于高海拔地區(qū)受到低溫和低氧雙重脅迫，低氧刺激被動增加肺承載氧的能力，這可能使得氧耗與代謝產(chǎn)熱的速率降低[11]。而動物自身對環(huán)境的生存選擇性使得對這種制約產(chǎn)生應對機制，肺臟指數(shù)的變大不僅可以應對低氧，具有強大的氧承載能力；同時還可以應對高寒，保證了動物體溫的恒定[12]。

本研究中發(fā)現(xiàn)蕨麻豬的肝臟指數(shù)與巴馬小型豬比較沒有統(tǒng)計學差異，脾、腎臟指數(shù)均低于巴馬小型豬。肝臟與動物的能量消耗、代謝及產(chǎn)散熱密切相關。脾臟是T、B細胞定居與抗原產(chǎn)生免疫應答的場所，脾臟紅髓中的巨噬細胞可清除血液中的外來抗原[13]，同時可合成免疫活性物質(zhì)，是哺乳動物體內(nèi)重要免疫器官。蕨麻豬生活的環(huán)境溫度較低，環(huán)境中的微生物和細菌相對較少，因此被細菌微生物等感染的幾率較小，并不需要增加脾臟大小來增強免疫力。有研究顯示，溫度較低對應的食物質(zhì)量和獲得性也低，同時維持較大的脾臟也需消耗很大能量[14]。先前研究顯示生理指標中蕨麻豬的紅細胞計數(shù)(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞積壓(HCT)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCMH)均極顯著高于巴馬小香豬(P<0.01)，血小板(PLT)、紅細胞分布列寬變異系數(shù)(RDW-CV)和紅細胞分布寬度標準差(RDW-SD)與巴馬小香豬有顯著差異(P<0.05)；生化指標中蕨麻豬γ-谷氨?；D移酶(GGT)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CRE)極顯著高于巴馬小香豬(P<0.01)。這提示蕨麻豬具有低氧適應的生理生化表征，與巴馬小香豬比較有獨特的高原適應性[15]。

高原土生動物低氧適應性主要研究了低氧適應基因的表達及其調(diào)控機制。具有代表性的低氧適應相關基因有：低氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor 1, HIF-1)、血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)。HIF-1是動物機體不同組織細胞形成缺氧耐受的分子生物學機制，可參與細胞內(nèi)氧平衡狀態(tài)的調(diào)節(jié)，導致許多抗低氧的基因表達，在低氧適應機制中起到重要的作用[16]，HIF-1引發(fā)缺氧耐受的重要蛋白質(zhì)分子，是介導哺乳動物細胞適應低氧環(huán)境的核轉錄因子。本研究發(fā)現(xiàn)蕨麻豬HIF-1α在肺、腎中的表達量明顯比巴馬小型豬高。蕨麻豬長期生活在高原地區(qū)，形成了獨特的高原適應能力，從而具有低氧適應性，伴隨著肺動脈壓的上升，肺血管對低氧的適應能力增強，對低氧反應的更具敏感性。所以，蕨麻豬HIF-1α在肺中的表達量明顯比巴馬小型豬高。至今已對藏羚羊、牦牛、藏雞、高原鼠兔等高原土生動物 HIF-1α的表達進行了大量研究，其結果顯示，HIF-1α在高原土生動物的多種組織中均有表達，并表現(xiàn)出顯著的組織差異性。在與低海拔對照組的比較結果顯示，高原土生動物HIF-1α在各組織中的表達量普遍增高。研究證明，藏羚羊、藏系綿羊與平原綿羊相比較，HIF-1α蛋白的表達量在肺、肝、腎組織中高于低海拔綿羊[17]，與高原鼠兔、牦牛以及本研究相一致。而蕨麻豬的肺、腎和腦組織中HIF-1α的高表達可能是通過血管擴張和新生血管生成從而增加局部組織供氧，增強了它對低氧的適應能力[18]。因此，HIF-1α組織特異性表達及表達增高可能是高原土生動物所具有的共性，它的低氧特異性表達可能是高原土生動物適應高原低氧環(huán)境的分子基礎。

在高原低氧環(huán)境，動物的缺氧代償機制會引起血管增生，VEGF是促進血管增生并增加血管通透性的關鍵因子[19]，HIF作為上游基因會調(diào)節(jié)下游的VEGF、EPO促進毛細血管增生[20]，同時VEGF也與炎癥、缺氧及高原習服等因素密切相關[21,22]。EPO基因在低氧條件下表達水平明顯增加，同時紅細胞數(shù)明顯增多[23]。一般而言，低氧刺激腎臟感受器后，腎臟加速分泌EPO并刺激骨髓加速RBC的成熟，所以血液中EPO數(shù)量會提高。此外，EPO可調(diào)節(jié)骨髓中造血干細胞向紅細胞增殖、分化和成熟，使血液中的Hb含量升高，使得機體的缺氧的代償性能力增強以提高對低氧環(huán)境的適應水平[24,25]。而本研究中EPO只在肺表達水平明顯高于巴馬小型豬，而兩者腎臟中表達量比較沒有統(tǒng)計學意義，其具體原因有待深入研究。有研究報道藏豬[26]EPO的表達量也高于低海拔地區(qū)的豬，這與本研究結果相一致，由此可推論EPO基因的低氧特異性高表達可能是高原豬低氧適應的分子基礎之一。我們對高原蕨麻豬與巴馬小型豬低氧相關基因VEGF、EPO及HIF-1α進行了比較，其表達量表現(xiàn)出明顯的組織差異性，藏羚羊的低氧相關基因表達量也顯現(xiàn)組織差異性[17]。

高原低氧適應性是高原醫(yī)學和生理學研究的重點，蕨麻豬生存在惡劣高寒氣候，使其具有適應高原環(huán)境的獨特的生理及生物學特性。但其低氧適應機制的研究還不夠深入，亟需利用現(xiàn)代分子生物學的方法，在分子水平上深入研究，發(fā)掘其高原特性及低氧適應的詳細機制，為開發(fā)研究具有高原特性的實驗動物和人類高原疾病的防治研究提供基礎理論依據(jù)。

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Comparison of organ coefficients and expression of hypoxia-related genes in the Bama and Juema minipigs

NIU Ting-xian, WANG Hong-yi,GUO Xiao-yu, LU Lu, SHEN Jian, XIAO Pan, FENG Xiao-ming

(Department of Animal Experiment, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Military Command, Lanzhou 730050, China)

Objective To compare the organ coefficients and expressions of hypoxia-related genes in Bama and Juema pigs. Method Real-time quantitative PCR was used to detect the changes of hypoxia gene expressions in the heart, liver, spleen, lung, and kidney of Juema and Bama miniature pigs. Results The organ coefficients of kidney and spleen of Juema pigs were significantly lower than Bama miniature pigs (P<0.05 for both). The heart and lung coefficients of Juema pigs were significantly higher than that of Bama miniature pigs (P<0.05 for both)．The VEGF and HIF-1α expressions in the lung and kidney in Juema pigs were significantly higher than Bama pigs (P<0.05 orP<0.01). Only the EPO expression in in the lung of Juema pigs was significantly higher than that of the Bama miniature pigs (P<0.05). Conclusions These results indicate that the variation in organ coefficients may be resulted from evolutionary factors such as adaptiveness to environmental physical and energy conditions, pathogens, and energy metabolism demands, etc. in combination. Juema miniature pigs showing a significantly higher expression of hypoxia-related genes than that in Bama minipigs indicate that it has a strong plateau adaptability by higher gene expressions.

Juema minipig; Bama minipig; Organ coefficient；Hypoxia-related gene; High plateau

甘肅省自然科學基金項目(1308RJZA178)。

牛廷獻(1966-)，男，主任技師，主要研究方向：人類疾病動物模型的建立及相關研究。E-mail: niutx10000@163.com。

馮小明(1980-)，男，主管技師，主要研究方向：實驗動物質(zhì)量控制及開發(fā)研究。Email: fxm8006@163.com。

R-33

A

1671-7856(2017) 04-0009-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.04.002

2016-09-22