潘文平，康 浩，康 永

（1．荔浦師范學校, 廣西 桂林 546600；2．南寧市第一中學,廣西 南寧 530012；3．西北工業(yè)大學, 陜西 西安 710072）

構筑山羊卵母細胞體外成熟體系的研究

潘文平1，康 浩2，康 永3

（1．荔浦師范學校, 廣西 桂林 546600；2．南寧市第一中學,廣西 南寧 530012；3．西北工業(yè)大學, 陜西 西安 710072）

通過探討不同濃度的FSH、LH及HMG對山羊的卵母細胞體外成熟體系影響因素，構筑山羊的卵母細胞的體外成熟體系，為山羊核移植及以后的優(yōu)良育種奠定基礎。

卵母細胞；FSH；LH；HMG；體外成熟；山羊

卵母細胞的發(fā)育成熟是一極其復雜和動態(tài)的過程。這一過程中除了mRNAs轉錄以及蛋白質合成外，還存在其他物質發(fā)生降解現象[1]。在體外進行卵母細胞成熟培養(yǎng)過程中，通常以排出第一極體來判斷其成熟性，該過程也是核成熟的標志。除了卵母細胞的核成熟以外，其胞質的成熟也很重要，尤其是在核移植過程中，卵母細胞胞質的成熟性關系到供體核能否實現再程序化以及重構胚能否分裂發(fā)育[2]。當前使用的卵母細胞成熟體系并非完美無缺，卵母細胞的成熟和后續(xù)發(fā)展的重要物質不能完全合成。卵母細胞體外成熟使用最廣泛、穩(wěn)定的基本培養(yǎng)基為TCM199。

激素是卵母細胞成熟培養(yǎng)的重要成分，尤其是促性腺激素，在成熟期起著重要作用。LH和FSH是使用頻率較高的促性腺激素[3]。卵泡刺激素(FSH)是調節(jié)卵泡發(fā)育的重要激素，能促進卵泡顆粒細胞加速有絲分裂和分泌卵泡液，使卵泡成熟排卵[4]。LH可以恢復卵母細胞減數分裂，成熟的卵泡分泌前列腺素[5]。另外，人們還通過添加一些生長激素、生長因子和其他添加物質，如卵泡液、非離子型表面活性劑、副甲狀腺素相關蛋白(PTHrP)、成熟分裂激活物(MAS)等物質來提高卵母細胞的體外發(fā)育和成熟。

本文通過探討山羊卵母細胞在不同FSH、LH濃度下卵母細胞的體外成熟的效果，以期建立山羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系，對山羊的繁殖、育種提供科學依據，同時為山羊的種質資源保護給予參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山羊卵巢采集于桂林某屠宰場。TCM199，上海聯碩生物科技有限公司；鏈霉素、青霉素，華北制藥股份有限公司；表皮生長因子、轉鐵蛋白等三價因子(ITS)、尿嘧啶、透明質酸酶，核染色劑Hochest33342、BSA、丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)，Sigma公司；肝素鈉，蘇州市蘇牧動物藥業(yè)有限公司；LH、FSH,寧波第二激素廠；HMG，西寶生物科技(上海)股份有限公司。

1.2 主要儀器

倒置熒光顯微鏡：日本，OLMPUS，IX71；CO2培養(yǎng)箱：上海旦鼎國際貿易有限公司MM-02470-00；體視顯微鏡：麥克奧迪 SMZ-168；電熱恒溫鼓風干燥箱：上海蘇達實驗儀器；雙重純水蒸餾器：上海亞榮生化儀器廠；超凈工作臺：江蘇凈化儀器制造廠；恒溫水浴鍋：北京長安科學儀器廠；超低溫冰箱：美國，FORMA SCIENTIFIC；手術器械：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。

1.3 試驗方法

1．3．1 卵丘-卵母細胞復合體（COCs）的收集

從屠宰場剛宰殺的母羊體內剪下卵巢，保存在加有雙抗(青霉素與鏈霉素)的30～35℃滅菌生理鹽水的保溫瓶中，4 h內運回實驗室用于試驗。用預溫30～35℃的滅菌生理鹽水清洗卵巢3遍，用剪刀進行修剪卵巢,減去多余的脂肪和結締組織，以減少對實驗的干擾。將處理好的卵巢放入盛有采卵液的平皿中，用無菌手術刀片切開卵巢表面2～6 mm大小的卵泡，使之釋放出卵泡液和COCs。用排卵針撿取卵丘-卵母細胞復合體，檢出的COCs分為A，B，C 3級：A級，卵丘細胞完整，卵母細胞胞質均勻；B級，卵丘細胞不完整，卵母細胞胞質均勻；C級，卵母細胞裸露，或胞質略有退化。選擇A，B 級進行培養(yǎng)。

采卵液：TCM199 + 1%FBS +100 mg/mL肝素鈉+100 IU/mL青霉素+100 IU/mL鏈霉素。

1．3．2 卵丘-卵母細胞復合體的體外成熟培養(yǎng)

將收集到的A、B級COCs用洗卵液清洗3～4次，然后置于預平衡2 ～3 h含1 mL成熟液的U型皿中，進行體外成熟培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為38.5℃、5 % CO2飽和濕度，培養(yǎng)22～24 h。洗卵液：TCM199+2 % FBS。

收集到的卵母細胞分8組,第1組用TCM199作為空白對照組，其他7組使用不同的培養(yǎng)液進行體外成熟培養(yǎng)，同一實驗組重復3次。

對照組：TCM199；基礎成熟液：TCM199 + 10mg/mL BSA + 1× ITS + 50μg/mL尿嘧啶+ 2.5 mmol/L谷氨酰胺+1 mmol/L丙酮酸鈉+50 μg/mL EGF+1μg/mL β-E2

OM Ⅰ：基礎成熟液+100 μg/mL FSH+20 μg/mL LH；OM Ⅱ：基礎成熟液+200 μg/mL FSH+40 μg/mL LH；OM Ⅲ：基礎成熟液+300 μg/mL FSH+60 μg/mL LH；OM Ⅳ：基礎成熟液+0.05 IU/mL HMG；OM Ⅴ：基礎成熟液+0.1 IU/mL HMG；OM Ⅵ：基礎成熟液+0.15 IU/mL HMG；OM Ⅶ：基礎成熟液+0.2 IU/mL HMG。

1．3．3 卵母細胞體外成熟效果判斷

將成熟培養(yǎng)后的COCs放置在含有0.3%的透明質酸酶杜氏磷酸鹽緩沖鹽水輕輕將用移液管從表面去除卵丘細胞的卵母細胞。在體視顯微鏡下，以異物針撥動卵母細胞進行觀察，觀察第1極體是否排出，或使用含有Hochest 33342的洗卵液染色，通過熒光顯微鏡觀察是否有發(fā)光的極體分布于卵母細胞透明帶以內。以排出第1極體的定為成熟，否則定為不成熟。

2 結果與討論

2.1 FSH和LH對山羊卵母細胞體外成熟的影響

研究了不同濃度FSH和LH對山羊卵母細胞體外成熟的影響。觀察COCs在體外培養(yǎng)22 h的卵丘細胞，發(fā)現有增殖現象（圖1）。隨著激素濃度的增加，卵丘細胞增殖速度加快，擴散直徑增大，空白對照(圖1-A)300μg/ mL，LH>60μg/ mL時，卵丘細胞擴散的直徑不再加快，表明激素對山羊卵母細胞增殖有一定的影響。同時，Imagej2x軟件是用來確定不同激素濃度下對卵母細胞的卵丘細胞投影效果。SPSS軟件分析結果表明，無激素添加的對照組的擴散距離與OM I、OMⅡ和 OM Ⅲ的擴散距離有著顯著差異。而OM I、OMⅡ和OMⅢ的擴散距離差異性不大。然而，OMⅡ卵母細胞擴張優(yōu)于OM I和OM Ⅲ，如圖2所示。

圖1 FSH與LH對山羊卵丘-卵母細胞復合體擴散度的影響（100×）

圖2 不同FSH和LH激素濃度卵母細胞的擴增距離

在山羊卵母細胞成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的FSH和LH對卵母細胞成熟率影響不同。成熟培養(yǎng)液分別加入100 μg/mL FSH和20 μg/ mL LH后，卵母細胞成熟率為57.9%，與參照組的成熟率有較大差異。成熟培養(yǎng)液分別加入200 μg/mL FSH、40 μg/mL LH的OMⅡ成熟率為68.8%，與參照組的成熟率有較大差異。添加300 μg/mL FSH和60 μg/mL LH的OM Ⅲ成熟率54.6%，與對照組差異顯著(表1)。OMⅡ的成熟率與OMⅠ和OM Ⅲ的成熟率差異顯著。結果表明，成熟液中FSH和LH濃度適中對山羊卵母細胞體外成熟有重要影響，高濃度激素對卵母細胞成熟有抑制作用。

表1 不同FSH和LH濃度對山羊卵母細胞體外成熟的影響

2.2 HMG對卵母細胞體外成熟的影響

HMG（FSH∶LH≈1∶1）可以在卵母細胞成熟中取代FSH和LH激素添加。HMG可促進卵母細胞的增殖(圖3)。經過22 h的培養(yǎng)，卵丘細胞擴散直徑表現為對照組(圖3A)

圖3 HMG對卵丘-卵母細胞復合體(COCs)擴散的影響(100×)

在成熟培養(yǎng)液中添加不同濃度的HMG，卵母細胞的成熟率不同見表2。

表2顯示，添加0.1 IU/mL HMG的成熟率為69.6%，與對照組差異性顯著。這表明 0.1 IU/ mL HMG添加培養(yǎng)液中有利于卵母細胞的成熟。而隨著濃度不斷增加成熟率降低，說明過多的HMG對山羊卵母細胞的成熟有抑制作用。

表2 HMG濃度對山羊卵母細胞體外成熟的影響

3 結論

(1) 成熟液Ⅰ、成熟液Ⅱ、成熟液Ⅲ中卵母細胞成熟率在68.8%～54.6%。在成熟液Ⅰ、成熟液Ⅱ中，隨著激素濃度的增加，成熟率與濃度呈正相關。在成熟液Ⅱ、成熟液Ⅲ中，隨著激素濃度的增大，卵母細胞的成熟率有著較大差異。成熟率為(73.0～53.6)%的卵母細胞，其HMG的濃度在0.1 IU/mL～0.2 IU/mL。

(2) 隨著激素濃度的增加，成熟率下降。HMG含有1∶1的 FSH和LH，已被證明是用來代替FSH和LH的成熟培養(yǎng)山羊和牛卵母細胞。本研究比較了FSH和LH對山羊卵母細胞成熟的影響。結果表明，200 μg/L FSH和40 μg/L LH對卵母細胞成熟的影響略低于0.1 IU/mL HMG，這與其他研究結果稍微不同，可能是由于激素的不同生產廠家造成的。筆者認為該差異有可能是因為激素來源不同引起的。

(3) 山羊卵母細胞以同樣的方式不添加激素也會獲得一定的成熟率。在成熟培養(yǎng)過程中，山羊卵母細胞第1極體的排出受FSH和LH和HMG的濃度影響較大，但濃度過高也會對山羊卵母細胞成熟率有抑制作用。

[ 1 ]孫曉萍, 郎俠, 楊博輝, 等． 提高山羊繁殖性能的幾種方法[J]． 畜牧與飼料科學, 2010, 31(3): 91-92．

[ 2 ]Edwards R G． Maturation in vitro of mouse, sheep, cow, pig, rhesus, monkey and human ovarian oocytes[J]． Nature, 1965, 208: 349-351．

[ 3 ]武浩．小鼠、山羊交互異種核移植研究[D]． 楊凌: 西北農林科技大學, 2004．

[ 4 ]石德順, 盧克煥． 牛卵泡液對牛卵母細胞體外成熟的影響[J]． 廣西農業(yè)大學學報,1994, (13): 1-5．

[ 5 ]徐建祥, 周木清, 陳小武, 等． 不同條件對牛卵母細胞體外成熟的影響[J]． 黑龍江動物繁殖, 1996, 4(2): 13-14．

S826.3

A

1005-2739（2017）03-0015-05

2017-02-15

潘文平(1983-), 女，廣西桂林人，本科，從事生物教學及新型生物材料應用研究工作。

康永, 男，陜西富平人，博士。

E-mail：kangyong_1204@163．com