王海山,呂文剛，葉 樂，李衛(wèi)東，柯才煥

(1.海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院，海南 三亞572022；2.廈門大學 海洋與地球學院，福建 廈門 361005)

皺紋盤鮑與西氏鮑雜交受精過程熒光顯微觀察

王海山1,2,呂文剛1，葉 樂1，李衛(wèi)東1，柯才煥2

(1.海南熱帶海洋學院 生命科學與生態(tài)學院，海南 三亞572022；2.廈門大學 海洋與地球學院，福建 廈門 361005)

本研究采用熒光顯微技術對皺紋盤鮑(Halilotisdiscushannai)♀×西氏鮑(H.gigantea)♂的受精過程及受精卵的早期發(fā)育進行了觀察,并采用FITC-anti-α-tubulin對精子入卵位置進行標記.結果顯示西氏鮑的精子可正常激活皺紋盤鮑的卵子,精子進入卵子2-5 min后受精卵開始第一次卵裂,釋放出第一極體.隨著受精卵的發(fā)育卵子完成第二次減數分裂,排出第二極體,同時形成早期精卵原核.精卵原核膨脹并彼此融合,受精卵開始進行有絲分裂完成第一次卵裂.通過FITC標記的anti-α-tubulin蛋白免疫熒光觀察,發(fā)現(xiàn)精子在入卵時會在卵膜表面,形成一個類似于受精孔的結構.

雜交鮑;受精;熒光顯微觀察

0 引 言

鮑類作為我國傳統(tǒng)的名貴食材,被譽為四大海味之首.中國的鮑養(yǎng)殖產量約占世界養(yǎng)殖產量的85%左右,長期占據世界第一的位置.2012年我國養(yǎng)殖鮑產量達到90694噸,實現(xiàn)連續(xù)十年的快速增長.其中福建省養(yǎng)殖鮑產量達65247噸,占全國總量72%.豐厚的利益驅使下使得鮑類養(yǎng)殖產業(yè)規(guī)模迅速擴大,但隨之帶來了一系列問題：為了追求低成本高回報的目的,養(yǎng)殖戶對鮑的種質資源缺乏保護意識,長期的近親繁育和累代養(yǎng)殖造成了種質明顯退化,大規(guī)模疾病時有發(fā)生,鑒于以上原因鮑類優(yōu)良品種選育的研究逐漸增多.聶宗慶等進行了皺紋盤鮑、紅鮑和綠鮑的交雜實驗，初期的研究發(fā)現(xiàn)皺紋盤鮑♀×紅鮑♂相對于其他雜交組合具有較快的生長速度并且更適應低溫環(huán)境[1].王仁波等對紅鮑與皺紋盤鮑進行了雜交實驗,指出正反交子代在不同的養(yǎng)殖條件下都比父母本具有較高的生長速度[2].燕敬平等以盤鮑和皺紋盤鮑作為親本培育出雜交鮑苗,與皺紋盤鮑自繁鮑苗相比雜交鮑苗在殼長生長和存活率方面均表現(xiàn)出較強的雜種優(yōu)勢[3].孫振興等報道了皺紋盤鮑與盤鮑的正交組合雜交子代養(yǎng)殖四個月后的濕重(36.9%)和干重(29.2%)均顯著高于盤鮑自繁子代[4].柯才煥等對雜色鮑、皺紋盤鮑、盤鮑三種鮑之間的種間雜交組合進行研究,發(fā)現(xiàn)不同的組合的受精1.0%-53.6%,雜交后的受精卵的胚胎和幼體均發(fā)育正常[5].蔡明夷等認為雜色鮑與盤鮑種間雜交受精率受卵排放后時間和精子濃度的影響比較大,在后續(xù)的工作中蔡明夷等又證明了雜色鮑♀×盤鮑♂種間雜交子代實際上是含有少量父本基因的雌核發(fā)育體[6-8].孫振興等發(fā)現(xiàn)西氏鮑♀×皺紋盤鮑♂的雜交子代在養(yǎng)殖一年半以后生長速度比皺紋盤鮑自繁子代快9.6%[9-10].鄭升陽等對西氏鮑和皺紋盤鮑進行的雜交實驗發(fā)現(xiàn)受精率僅為14%,但是雜交組合西氏鮑♀×皺紋盤鮑♂幼體的成活率和稚鮑過冬的情況相較于皺紋盤鮑具有顯著的優(yōu)勢[11].駱軒等對皺紋盤鮑與西氏鮑種間雜交進行了詳細的研究,發(fā)現(xiàn)西氏鮑♀×皺紋盤鮑♂的雜交組合受精率為19%-65%、孵化率為76%-85%,反交組合的受精率為22%-83%、孵化率為1%-85%.兩種雜交子代在養(yǎng)殖100天后都表現(xiàn)出了顯著超出親本的生長速度,在180天時存活率與純系親本相似[12-14].范飛龍等對綠鮑與皺紋盤鮑進行了雜交實驗發(fā)現(xiàn)雜交子代相較于親本在生長速度和存活率方面均具有一定的雜種優(yōu)勢[15].

不同地理群體的同種鮑類的種內雜交也能獲得很好的雜種優(yōu)勢,是培育優(yōu)良種類的另一個有效手段.張國范等通過對日本和中國兩個群體皺紋盤鮑之間的種內雜交發(fā)現(xiàn),雜交子代的生長速度和成活率比對照群體具有顯著的雜種優(yōu)勢,并在此基礎上培育出了我國第一個養(yǎng)殖貝類新品種“大連一號”雜交鮑[16].游偉偉等采用日本和臺灣兩個群體的雜色鮑進行了種內雜交,在其中的一個雜交組合中存活率的雜種優(yōu)勢率達到了40.6%,在回交之后生長速度的雜種優(yōu)勢率達到了48.6%,經過多年的努力培育出了福建省第一個養(yǎng)殖貝類新品種“東優(yōu)一號”[17].本課題組先后多次從日本引進西氏鮑,并在福建海區(qū)進行人工馴養(yǎng)至性腺發(fā)育成熟,從2005年11月開始利用西氏鮑與皺紋盤鮑進行種間雜交實驗,對二者雜交的可行性進行初步研究,結果表明雜交子代在生長速度及抗逆性上都表現(xiàn)出了一定的雜種優(yōu)勢[18].種間雜交成功與否的前提條件是不同親本的精卵能否互相識別完成受精過程.皺紋盤鮑與西氏鮑具有較近的親緣關系和相同的核型(核型均為2n=20m+16sm)[19],二者種間雜交的成功也間接的證明了這點.對于皺紋盤鮑與西氏鮑種間雜交的受精過程還沒有報道,因此本研究采用熒光顯微技術對皺紋盤鮑與西氏鮑雜交的受精過程以及受精卵早期發(fā)育的過程進行觀察,將會豐富鮑種間雜交的基礎研究,同時也為鮑類科學的雜交育種提供理論支持.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用西氏鮑(代號G)系2003年從日本引進,在福建海區(qū)進行馴養(yǎng)至性腺發(fā)育成熟.皺紋盤鮑(代號D)系引進來自遼寧省大連外海的底播養(yǎng)殖群體,并已在福建海區(qū)連續(xù)繁育數代.從以上親本群體中選擇生長發(fā)育良好、性腺成熟的個體作為種鮑.

1.2 主要儀器與試劑

奧林巴斯BX51熒光顯微鏡、0.2M pH7.4 磷酸緩沖液、2%戊二醛、2.5%多聚甲醛、HOECHST33258 (江蘇碧云天公司)、FITC-anti-α-tubulin (sigma).

1.3.1 催產與受精

親鮑催產采用陰干結合紫外線照射過海水刺激的方法,具體的方法是：在16℃-23℃條件下,陰干1小時,流水1小時然后將西氏鮑雌鮑和皺紋盤鮑雄鮑分別置于不同的容器內,注入照射強度為每小時500 mW-800 mW紫外線處理海水,每隔40分鐘-60分鐘更換一次紫外線處理海水,直至雌雄種鮑產卵和排精為止.待配子開始排放時,迅速將正在排放的親鮑轉移至單獨的容器中產卵、排精.操作全過程嚴防同種精子授精.將獲得的皺紋盤鮑與西氏鮑受精卵按正反交分別放置于獨立容器之中.

1.3.2 雜交鮑受精過程觀察

授精后0-60 min,每隔5 min取樣一次;60-150 min,隔10 min取樣一次.樣品置于2%戊二醛和2.5%多聚甲醛固定液中,更換固定液2次,置于4℃保存.觀察時,棄去固定液,用pH7.4的0.2 M磷酸緩沖液清洗2-3次,加適量的HOECHST33258染液于黑暗環(huán)境下染色 20 min,使用Olympus BX51熒光顯微鏡在365 nm的紫外光下觀察、拍照.

其中一部分固定好的樣品采用FITC-anti-α-tubulin進行免疫熒光染色,將樣品置于0.5%的Triton X-100中透化處理30 min之后用200 μg/ml的RNAse在25℃下處理1h.用5%的BSA封閉處理1h,1:50的FITC-anti-α-tubulin染色1h之后用0.01% Triton X-100清洗兩次,10μg/ml的PI復染10min.將樣品清洗兩次后轉移到載玻片上(注意不加蓋玻片)放在熒光顯微鏡下觀察.采用Image-pro plus 6.0軟件對結果進行熒光合成.

受精后取一定量的受精卵放在雙凹鏡里在顯微鏡下連續(xù)觀察,記錄極體排放和發(fā)生卵裂的時間.

2 結果

2.1 皺紋盤鮑與西氏鮑雜交受精過程觀

圖1 鮑精子入卵位置

Hoechst與DNA雙鏈中的小溝(minor groove)結合在365 nm的激發(fā)光下呈明亮的藍色熒光,實驗結果顯示精子、卵子和胚胎中的雙鏈DNA均被染色呈亮藍色,胞質的背景清晰無干擾.受精卵發(fā)育過程中的染色體形態(tài)及行為可以被很好地觀察到(圖1).體外受精的軟體動物,精子入卵的時間有兩種類型,一種是胚泡存在,初級卵母細胞處于第1次成熟分裂之前;另一種是胚泡消失,初級卵母細胞處于第1次成熟分裂中期[20-22].鮑類的受精過程屬于第二種類型,既精子入卵以后,卵子開始兩次的減數分裂[23-24].

風險是現(xiàn)代社會的結構性特征，而文明的饋贈就是可靠性——擺脫來自自然的、自身的和他人的危險，獲得可靠性。⑦ ［英］齊格蒙·鮑曼著：《尋找政治》，洪濤、周順、郭臺輝譯，上海世紀出版集團2006年版，第8頁。因此，對于包括知識產權風險在內的各類風險的有效控制，是現(xiàn)代社會和人類文明所面臨的重要課題。當然，風險控制有多種路徑，對于知識產權風險的控制究竟應當采取何種路徑、是否須訴諸于法律，則取決于知識產權風險自身的特征。

本研究中發(fā)現(xiàn)有少數的受精卵在顯微鏡下可以觀察到精子在卵膜表面進入卵子的結構,精子呈明亮的藍色,精子周圍卵膜內陷成褶皺孔狀(圖1).受精后2 min,精子粘附在成熟卵子表面的膠膜上,此時卵子處于第一次減數分裂的中前期(圖2a),此時可見卵子染色體位于卵子中央位置.受精后2-5 min,精子完成頂體反應開始進入卵子,由于卵子的胞質作用使精核染色質去致密,同時由于精子的進入卵子開始進行第一次減數分裂,此時可見卵子染色體開始復制分離形成雌性原核與第一極體(圖2b).隨著受精卵的發(fā)育卵子完成第二次減數分裂,排除第二極體(圖2c).同時形成早期精卵原核(圖2d).精卵原核膨脹并彼此融合,受精卵開始進行有絲分裂完成第一次卵裂(圖2.1.2e).胚胎繼續(xù)發(fā)育開始第二次有絲分裂,正常的有絲分裂可見兩個細胞的染色體進行復制分離(圖2f、圖2g).經過多次有絲分裂進入多細胞期(圖2h).

圖2 皺紋盤鮑♀×西氏鮑♂受精過程的熒光顯微觀察

2.2 皺紋盤鮑與西氏鮑雜交受精卵免疫熒光染色

鮑的成熟未受精卵表面是一層極薄的質膜,圍繞其外的是卵黃膜,卵黃膜的外圍是很厚的膠膜,膠膜是由一些不定形物質和分布稀疏的纖維狀細絲所組成[25].通過HOECHST33258染色觀察受精卵早期發(fā)育的過程中發(fā)現(xiàn)部分受精卵表面的精子入卵位置有一個褶皺的孔狀結構.鮑細胞溶素存在于精子的頂體泡內,當精子粘附到卵黃外膜上時就誘發(fā)頂體反應,釋放的lysin以二聚體的形式與卵黃膜相結合,隨后其單聚體形式利用非酶解反應,在卵黃膜上穿一個直徑為3 μm的小孔,直徑1 μm精子就從此處穿過卵黃膜與卵細胞融合[26].但是該研究并沒有對該結構進行詳細的描述,所以有必要對該結構進行更進一步的研究.本研究采用FITC標記的抗α微管蛋白對精子入卵過程進行熒光免疫染色以期對鮑類受精過程及種間雜交提供更多基礎數據.

由于鮑類卵子外圍包被著一層厚厚的膠狀物具有很強的粘附性[27],所以FITC-anti-α-tubulin會有一部分被膠質膜吸附造成淺綠色的熒光背景.熒光染料PI(碘化丙啶)是一種可對DNA染色的細胞核染色試劑,它是一種溴化乙啶的類似物,在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光.實驗結果可以看到由于鮑類細胞外膠膜的影響FITC-anti-α-tubulin探針并不能很好進入卵子,即對細胞內骨架不能有效的標記.本研究中沒有觀察到理想的紡錘絲等結構.但是在精子進入卵子的位置存在一個可見明亮綠色信號的孔狀結構.為了方便說明我們暫稱該結構為精孔.實驗結果顯示雜交鮑的受精卵經過抗α微管蛋白標記后均呈現(xiàn)強烈的綠色信號(圖3a).該信號的位置隨機出現(xiàn)在卵膜的表面上,也即是說精子進入卵子的位置是隨機的不存在特定位置.該結構在卵子膠膜內部發(fā)生于卵黃膜上,顯微鏡下觀察該孔狀結構附近卵黃膜呈褶皺狀內陷,對該結構測量直徑大約15 μm(圖3b、圖3c).精孔形成后精子入卵排出第一極體時可見卵黃膜與質膜之間距離明顯變大(圖3d).受精卵繼續(xù)發(fā)育排出第二極體(圖3e).當受精卵完成第一次和第二次卵裂是仍可見精孔結構存在(圖3f、圖4a).當受精卵開始第三次卵裂形成8細胞時精孔絕大部分消失(圖4b、圖4c).

圖3 皺紋盤鮑♀×西氏鮑♂受精孔熒光顯微觀察

圖4 皺紋盤鮑♀×西氏鮑♂受精孔熒光顯微觀察

3 討論

皺紋盤鮑與西氏鮑雜交過程與皺紋盤鮑自交過程類似,精子入卵之后卵子開始進行第一次減數分裂釋放第一極體,精子向雌性原核移動并解凝形成雄性原核.受精卵釋放第二極體之后雌性原核融合進行有絲分裂形成第一次卵裂.本研究通HOECHST33258染色雜交鮑受精過程進行跟蹤觀察表明,來自皺紋盤鮑的大部分異源精子可以順利的進入西氏鮑的成熟卵子,并且激活卵子恢復并完成二次減數分裂;同時卵子也可激發(fā)精子完成去致密等一系列變化.精卵原核的融合以及早期胚胎進行正常發(fā)育證實了異源精子參與了后代遺傳物質的組成.種間雜交最大的障礙即是種間的生殖隔離,遠緣雜交受精不親和現(xiàn)象十分常見,例如導致雌核發(fā)育生殖,如銀鯽♀×興國江鯉♂的雜交精子無法在卵子中膨大形成雄性原核以固縮狀的形態(tài)存在從而導致雌核發(fā)育生殖[28].而皺紋盤鮑♀×西氏鮑♂的種間雜交在適宜的條件下最高可達到81%的受精率,反交亦能達到50%受精率[29].究其原因除了水溫、pH、鹽度以及卵齡的客觀因素之外,最主要的是皺紋盤鮑與西氏鮑的精卵間的識別機制.細胞溶素(lysin)作為在成熟的鮑類精子頂體泡內重要的功能蛋白對兩性配子相互識別起著關鍵作用[30].lysin作為進化速度最快蛋白之一皺紋盤鮑與西氏鮑的lysin完整的cDNA序列幾乎完全一致[13],這也在一定程度上解釋了皺紋盤鮑與西氏鮑種間雜交出現(xiàn)較高受精率的原因.

種間雜交受精卵的發(fā)育存在滯后性和不一致性,皺紋盤鮑與西氏鮑無論正反交組合的受精卵發(fā)育均滯后于自交組合,由于不同種類的生物精卵之間的配體受體存在差異,皺紋盤鮑與西氏鮑lysin序列即使十分接近,精卵識別也會經歷一個復雜的過程.櫛孔扇貝♀×華貴櫛孔扇貝♂受精觀察中,發(fā)現(xiàn)異源核-質及核-核的相互識別協(xié)調有一定困難,可能是造成發(fā)育遲緩的一個原因[31].雜種受精卵在胚胎發(fā)育階段也出現(xiàn)了發(fā)育不一致性.首先是由于生物的個體差異,如精子活力不同,卵子成熟度不一致.在生產實踐中我們發(fā)現(xiàn)鮑卵子的成熟度十分關鍵,直接影響到受精率和胚胎發(fā)育速度.其次雜交兩親本核質不完全相容,并且核質的分裂節(jié)奏不同所導致胚胎發(fā)育的不同步.在這種情況下可能造成染色體的異常分離、丟失、加倍、形態(tài)改變等現(xiàn)象,進而導致部分受精卵發(fā)育的異常,停滯及死亡.

鮑的精子與卵子外膠狀膜吸附后到達卵黃膜,卵黃膜表面的lysin受體(VERL)誘發(fā)精子發(fā)生頂體反應,頂體泡釋放蛋白質到卵黃膜,該蛋白使卵黃膜纖毛舒展進而分開產生一個小孔,精子頭部頂體與卵細胞膜融合[32].采用FITC標記的抗α微管蛋白能特異的結合在微管蛋白上,實驗中觀察到每個受精卵都有一個特異的明亮信號,說明在該位置存在著大量的微管結構.卵黃膜可以分為三層,內外兩層是由一些極細微的纖維狀絲構成.通過實驗結果可以確定精孔是由卵黃膜內纖維絲形成的特殊結構.顯微鏡下觀察到精子進入膠膜達到卵膜之后形成一個褶皺內陷的漏斗形結構,通過測量發(fā)現(xiàn)該結構在膠膜表面的直徑約為15 μm左右,遠大于文獻[32]報道lysin所鉆的直徑為3 μm的孔.究其原因可能是精子內的其他成分與膠膜相結合并在尾部游動的作用下接近卵黃膜誘發(fā)頂體反應.膠膜的作用對于鮑受精是至關重要的,鮑排除體外的無膠膜卵是不能受精的.這也從側面驗證了精子與卵子識別的過程中膠膜會誘導精子發(fā)生一些變化,這種變化極可能是相互的,精子釋放物質膠膜被溶解同時精子也更易于發(fā)生頂體反應.

精孔結構形成于精子頭部與卵黃膜接觸之后,大約持續(xù)到四細胞期以后消失.精子入卵后,卵子發(fā)生皮層反應.卵子皮層中的皮層小泡破裂引起卵膜膨脹,并與卵黃膜形成受精膜.受精膜與質膜之間的間隙稱為卵周隙.關于受精膜的形成有兩種觀點,第一種認為鮑的卵黃膜在受精前已經舉起,并且質膜與卵黃膜之間的間隙達數十微米,不存在受精膜舉起的現(xiàn)象[33].而孫振興等人認為鮑受精后皮層反應舉起形成受精膜[23].本文研究的結果顯示精子入卵之后第一極體排除時卵周隙才明顯增大,這與第二種觀點是一致的.

一般體外受精的軟體動物是單精子入卵,單精受精.本實驗采用的材料是皺紋盤鮑與西氏鮑種間雜交的受精卵，在遠緣雜交過程中精子的濃度要遠高于正常自交精子濃度,另外種間雜交精卵識別十分困難,所以實驗中觀察到了很多疑似多精入卵的現(xiàn)象.通過對一個多精入卵的四細胞胚胎采用不同焦距的觀察發(fā)現(xiàn)該胚胎外卵膜上存在多個精孔信號(圖4d、圖4e),并且該卵子已經發(fā)育至四細胞期.說明多精入卵至少并不影響胚胎的早期發(fā)育.有報道稱在一些軟體動物中存在多精入卵的現(xiàn)象,這其中只有一個精子可以形成雄原核與雌原核結合,因此卵子仍可正常發(fā)育,其他的多余的精子在卵內被逐漸吸收崩解,但吸收時間因種類不同而異,或在減數分裂期間,或遲至第1次卵裂時才被吸收[22, 34].實驗結果顯示多精入卵時只有一個精孔的大小為正常大小(圖4f),這說明只有一個精子完成了頂體反應.我們推測當第一個精子開始頂體反應時卵黃膜舉起形成受精膜,這時卵黃膜發(fā)生了一系列變化停止了與其他精子交互反應使精孔不能順利形成,同時卵周隙增大阻止了其他精子與卵子質膜的接觸,不能傳遞遺傳物質進入卵子.

[1]Nie Z.Q.A review of abalone culture in China [M].Fisheries and Culture.Oxford,Blackwell，1992: 592-602.

[2]王仁波,范家春.紅鮑人工育苗及其與皺紋盤鮑雜交試驗的初步研究[J].大連水產學院學報, 1999,14(3): 64-66.

[3]燕敬平,張榭令.日本盤鮑與皺紋盤鮑雜交育種技術研究[J].海洋水產研究, 1999, 20(1): 35-39.

[4]Sun Z., Chang L., Song Z.Effects of hybridization betweenHaliotisdiscushannaiandHaliotisdiscus[J].Fisheries Science, 2005, 24: 1-3.

[5]柯才煥,田越,周時強.雜色鮑與皺紋盤鮑, 盤鮑雜交的初步研究[J].海洋科學,2000,24(11): 39-41.

[6]蔡明夷,柯才煥,游偉偉,等.雜色鮑♀×盤鮑♂雜交受精的細胞學研究[J].廈門大學學報(自然科學版), 2007, 46(2): 239-243.

[7]Cai M.Y., Ke C.H., Wang G.Z., et al.Influence factors on fertilization rate in laboratory hybridization betweenHaliotisdiversicolorandH.discusdiscus[J].Journal of Fisheries of China, 2006, 13: 230-236.

[8]Cai M.Y., Ke C.H., Luo X.A., et al.Karyological studies of the hybrid Larvae ofHaliotisdisversicolorsupertextafemaleandHaliotisdiscusdiscusmale [J].Journal of Shellfish Research, 2010, 29(3): 735-740.

[9]孫振興,宋志樂.日本大鮑與皺紋盤鮑雜交的研究[J].齊魯漁業(yè), 2001, 18(3): 25-27.

[10]Sun Z., Song Z., Zhen Z., et al.Hybridization between two species abalone and growth of their F1 hybrid progeny [C].proceedings of the 5th International Abalone Symposium, China: Qingdao, F, 2003.

[11]鄭升陽.日本西氏鮑與皺紋盤鮑雜交試驗初報[J].福建農業(yè)學報, 2006, 21(3): 296-298.

[12]駱軒,游偉偉, 柯才煥,等.西氏鮑與盤鮑雜交育苗的初步研究 [J].廈門大學學報(自然科學版),2006, 45(2): 602-605.

[13]Luo X., Ke C.H., You W.W., et al.Factors affecting the fertilization Success in laboratory hybridization betweenHaliotisdiscushannaiandHaliotisgigantea[J].Journal of Shellfish Research, 2010, 29(3): 621-625.

[14]Luo X., Ke C.H., You W.W.Heterosis analysis on interspcific hybrids betweenHaliotisdiscushannaiandH.gigantea[J].Journal of Shellfish Research, 2012, 31(1): 316-316.

[15]范飛龍.綠鮑的引種及與皺紋盤鮑的種間雜交研究[D].廈門:廈門大學,2012.

[16]張國范.海洋貝類遺傳育種研究20年[J].廈門大學學報(自然科學版),2006, 45(2): 190-194.

[17]You W.W., Ke C.H., Luo X., et al.Growth and survival of three small abaloneHaliotisdiversicolorpopulations and their reciprocal crosses [J].Aquaculture Research, 2009, 40(13): 1474-1480.

[18]駱軒,游偉偉,柯才煥,等.西氏鮑與盤鮑雜交育苗的初步研究[J].廈門大學學報(自然科學版),2006,45(5) : 602-605.

[19]Wang, H.S., Luo X., You W.W., et al.Cytogenetic analysis and chromosomal characteristics of the polymorphic 18S rDNA ofHaliotisdiscushannaifrom Fujian, China[J].PLOS ONE, 2015, 10(2): e0113816.

[20]Chen, D.Y., Frank, J.L.Sperm nuclear dispersion coordinate with meiotic maturation in fertilizedSpisulasolidissimaeggs[J].Developmental Biology, 1983,99(1): 217-224.

[21]Longo, F.J., Mathews, L., Hedgecock, D.Morphogenesis of maternal and paternal genomes in fertilized oyster eggs (Crassostreagigas): effects of cytochalasin B at different periods during meiotic maturation[J].Biological Bulletin, 1993,185(2): 197-214.

[22]樓允東,鄭德崇.組織胚胎學[M].北京:農業(yè)出版社,1981.

[23]孫振興,謝嘉琳.皺紋盤鮑受精過程的電鏡觀察[J].動物學研究,1997,18(3): 253-257.

[24]蔡明夷,柯才煥,游偉偉,等.雜色鮑♀×盤鮑♂雜交受精的細胞學研究[J].廈門大學學報(自然科學版), 2007, 46(2): 239-243.

[25]Vacquier, V.D., Carner, K.R.Stout, C.D.Species-Specific sequences of Abalone lysin, the sperm protein that creates a hole in the egg envelope[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1990,87(15): 5792-5796.

[26]孫振興,王如才.皺紋盤鮑卵的形態(tài)與超顯微結構[J].中國水產科學,1997,4(1): 68-74.

[27]朱藍菲,蔣一珪.銀鯽不同雌核發(fā)育系的生物學特性比較研究[J].水生生物學報,1993,17(2):112-120.

[28]駱軒.西氏鮑與皺紋盤鮑雜交的遺傳基礎研究[D].廈門:廈門大學, 2005.

[29]Shaw, A., Mcree, D.E., Vacquier V.D.The crystal structure of lysin, a fertilization protein[J].Science, 1993,262(5141): 1864-1867.

[30]Lee, Y.H., Vacquier,V.D.Evolution and systematics in Haliotidae (Mollusca: Gastropoda): Inferences from DNA sequences of sperm lysin[J].Marine Biology, 1995.,124(2): 267-278.

[31]畢克,包振民,黃曉婷,等.櫛孔扇貝♀×華貴櫛孔扇貝♂受精及早期胚胎發(fā)育過程的細胞學熒光顯微觀察[J].中國海洋大學學報(自然科學版),2005,35(2):283-286.

[32]Mozingo, N.M., Vacquier, V.D., Chandler, D.E.Structural features of the abalone egg extracellular matrix and its role in gamete interaction during fertilization[J].Molecular reproduction and development, 1995,41(4): 493-502.

[33]Lewis, C.A., Talbot, C.F., Vacquier, V.D.A protein from abalone sperm dissolves the egg vitelline layer by a nonenzymatic mechanism[J].Developmental biology, 1982,92(1): 227-239.

[34]Raven, C.P.Morphogenesis: The analysis of molluscan development[M].Oxford: Pergamon Press, 1966.

(編校：李由明)

Cytological Observation on Cross Fertilization ofHalilotisdiscushannaiandHalilotisgiganteawith Fluorescent Microscope

WANG Hai-shan1,2, LU Wen-gang1, YE Le1, LI Wei-dong1, KE Cai-huan2

(1.School of Life Sciences and Ecology, Hainan Tropical Ocean University, Sanya Hainan 572022, China;2.Colleges of Ocean and Earth Sciences, Xiamen University, Xiamen Fujian 361005, China)

The current study was conducted on the fertilization process and the early development of fertilized eggs by the fluorescence microscopy technique.The position of sperm into the eggs was labeled by FITC-anti-α-tubulin.The results showed that sperm ofH.giganteapenetratedH.discushannaieggs.The first cleavage and the first polar body were released in after 2-5min of sperm-egg fusion.With the completion of the second meiotic division of the fertilized egg, the second polar body was released, forming the early male and female pronucleus.Then two pronucleus began to swell and started mutual fusion, and the fertilized eggs began to undergo mitosis to complete the first cleavage.The immunofluorescent observation with the FITC labeled anti-α-tubulin probe detected a pore structure similar to micropylar on the surface of egg membrane.

crossbreeding abalones; fertilization; fluorescent observation

格式：王海山,呂文剛,葉樂,等.皺紋盤鮑與西氏鮑雜交受精過程熒光顯微觀察[J].海南熱帶海洋學院學報，2017，24(2)：1-6+73.

2017-03-03

海南省高等學?？茖W研究項目(HNKY2016-43)

王海山(1983-),男,遼寧葫蘆島人,海南熱帶海洋學院生命科學與生態(tài)學院講師,博士,研究方向為海洋生物多樣性.

Q75

A

2096-3122(2017) 02-0001-06

10.13307/j.issn.2096-3122.2017.02.01