閆佳敏+王瑞玲+馬琴+崔桂麗+王亞靜

【摘要】 目的：探討絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）通路在高糖高脂誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞肥大中的作用。方法：高糖（33 mmol/L）及不同濃度脂（250、500、1000 ?mol/L）不同時間（12、24、36、48 h）干預(yù)H9c2細(xì)胞，應(yīng)用乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH的活性，采用RT-PCR技術(shù)分別檢測肥厚指標(biāo)心房鈉尿肽（ANP）、α-心肌肌動蛋白（α-SKA）的mRNA表達(dá)，利用蛋白免疫印跡（Western blot）技術(shù)檢測p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK、p-p38/T-p38的活化程度。結(jié)果：結(jié)果顯示上清LDH的活性與高糖高脂處理間具有濃度及時間依賴性，高糖高脂顯著增加ANP和α-SKA的mRNA表達(dá)（P<0.05），在高糖高脂（33 mmol/L+500 ?mol/L）36 h時ANP、α-SKA的mRNA表達(dá)最高（P<0.01）。與對照組相比，高糖高脂顯著促進(jìn)MAPK信號活化，其中p-ERK和p-JNK的活化分別增加了1.39倍和1.47倍（P<0.05），而p-p38活化增加了3.34倍（P<0.01）。結(jié)論：高糖高脂可導(dǎo)致H9c2細(xì)胞損傷并顯著促進(jìn)細(xì)胞肥大，在此過程中MAPK信號通路差異調(diào)控作用扮演重要角色。

【關(guān)鍵詞】 H9c2； 高糖高脂； 心肌肥厚； 糖尿病心肌病； MAPK

The Role of MAPK Signaling Pathway in Diabetic Cardiomyopathy/YAN Jia-min，WANG Rui-ling，MA Qin，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（10）：005-009

【Abstract】 Objective：To investigate the role of mitogen-activated protein kinase （MAPK） pathway in high glucose and high fat induced hypertrophy of H9c2 cells.Method：H9c2 cells were treated with high glucose（33 mmol/L） and different concentrations of lipids（250，500，1000 μmol/L） at different time （12，24，36，48 h）.The activity of LDH in cell culture medium was detected by lactate dehydrogenase（LDH） kit.Quantitative Real-time PCR（RT-PCR） was used to detect the mRNA expression of atrial natriuretic peptide （ANP） and α-skeletal muscle actin （α-SKA） in hypertrophic myocardium.The activation of p-ERK/T-ERK，p-JNK/T-JNK and p-p38/T-p38 were detected by Western blot.Result：The results showed that the activity of supernatant LDH was concentration and time dependent with high glucose and high lipid treatment.Hyperglycemia and hyperlipidemia significantly increased the mRNA expression of ANP and α-SKA，the mRNA expression of ANP and α-SKA was the highest at high glucose and high fat （33 mmol/L+500 μmol/L） for 36 h（P<0.05）.Compared with the control group，high glucose and high fat significantly promoted MAPK activation.Among them the activation of p-ERK and p-JNK were increased by 1.39-fold and 1.47-fold（P<0.05），while p-p38 activation was increased by 3.34-fold（P<0.01）.Conclusion：High glucose and high fat can cause H9c2 cell damage and promote cell hypertrophy，in which MAPK signal pathway play an important role in the regulation of differences.

【Key words】 H9c2； HGHL； Myocardial hypertrophy； DCM； MAPK

First-authors address：Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.10.002

糖尿病是心血管系統(tǒng)疾病發(fā)病的重要危險因素，糖尿病心肌?。╠iabetic cardiomyopathy，DCM）是一種以心肌肥大、心肌纖維化、細(xì)胞水平鈣轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷、心肌收縮蛋白膠原形成和脂肪酸代謝異常等為特征的一種獨(dú)特的心肌病變[1-3]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，可能涉及代謝紊亂（如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子活性下降、游離脂肪酸增加、胰島素抵抗等）、微血管病變、心臟植物神經(jīng)功能紊亂及心肌纖維化（與高血糖、心肌細(xì)胞凋亡、炎性細(xì)胞因子等有關(guān)）等多種因素的一種，是病因尚不明確的糖尿病主要合并癥之一[4-6]。絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）鏈?zhǔn)钦婧松镄盘杺鬟f網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在DCM的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，其中MAPK成員p38、JNK信號主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡和炎癥等，而ERK介導(dǎo)細(xì)胞增殖增生等[7-9]。越來越多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，MAPK信號家族在心肌肥大的啟動以及心肌肥大病理進(jìn)程中起重要作用[10]。據(jù)此本研究采用高糖高脂處理的H9c2病理變化模型，探討病理進(jìn)程中MAPK家族如何發(fā)揮作用，即凋亡信號及增生信號是如何變化的。本研究旨在通過探討MAPK家族與糖尿病心肌病之間的關(guān)系，試圖闡明凋亡與增生變化規(guī)律，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠胚胎心肌細(xì)胞H9c2（北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，北京）；DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素混合液、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶（博士德生物工程有限公司，武漢）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；葡萄糖D-GLUCOSE（索萊寶生物科技有限公司，北京）；棕櫚酸鈉Sodium palmitate（Sigma，美國）；乳酸脫氫酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京）；Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR測定試劑盒、RNA引物合成（TaKaRa，日本）；無RNA酶槍尖、氯仿、乙醇、DEPC、八聯(lián)管等（生工生物工程股份有限公司，上海）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，上海）；單克隆兔抗p-JNK、p-p38、t-p38抗體、多克隆兔抗p-ERK、t-JNK、t-ERK（CST公司，美國）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（中杉金橋生物技術(shù)有限公司，北京）；Western blotting 發(fā)光液（愛必信生物科技有限公司，上海）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 H9c2心肌細(xì)胞來源于大鼠胚胎期心臟組織，接種于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，將其置于5% CO2、37 ℃孵箱進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%～80%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)分為4組：正常對照組，高糖高脂A組（33 mmol/L葡萄糖+250 ?mol/L棕櫚酸鈉），高糖高脂B組（33 mmol/L葡萄糖+500 ?mol/L棕櫚酸鈉），高糖高脂C組（33 mmol/L葡萄糖+1000 ?mol/L棕櫚酸鈉）。

1.2.2 乳酸脫氫酶測定試劑盒檢測LDH的活性 于六孔板中種植H9c2心肌細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時，按照分組給予不同處理后，在不同時間收集。操作流程根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，操作結(jié)束后用酶標(biāo)儀測定各孔450 nm處的吸光度值計算其活力。

1.2.3 Real-time PCR檢測ANP、α-SKA的mRNA的表達(dá) 按照Trizol說明書步驟提取細(xì)胞總RNA，采用分光光度計檢測RNA樣品的A260/A280比值在1.8～2.0，以確定RNA純度，并計算出RNA的濃度。參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄管放于PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)：37 ℃ 15 min（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85 ℃ 5 s（反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng)），4 ℃。兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，RT-PCR擴(kuò)增的引物序列（表1），按照說明書加入SYBR熒光染料、引物序列以及反轉(zhuǎn)錄后的產(chǎn)物，在Mx 3000p熒光定量PCR儀（Stratagene） 上進(jìn)行，擴(kuò)增反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性：95 ℃，30 s，1個循環(huán)；PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 s、60 ℃ 30～34 s，40個循環(huán)。每組樣品設(shè)置3個復(fù)孔以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

1.2.4 Western blot檢測高糖高脂干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞24 hp-ERK、p-JNK、p-p38的蛋白表達(dá)量 H9c2心肌細(xì)胞接種于六孔板中，培養(yǎng)至70%～80%滿時分為兩組：正常對照組和高糖高脂B組，給予不同的處理，然后待處理時間為24 h時棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗兩次，加入配好的裂解液進(jìn)行裂解并收集于離心管中進(jìn)行超聲破碎和離心。然后用BCA法測定蛋白濃度調(diào)整相應(yīng)的上樣量制備好蛋白樣本。95 ℃煮5 min變性，制備12%SDS分離膠和5%濃縮膠進(jìn)行電泳從而分離蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后使用半干轉(zhuǎn)將已分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，然后再用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。封閉結(jié)束后用TBST洗膜3次，5 min/次，將膜置于相應(yīng)的一抗稀釋液（1∶1000）中4 ℃搖床過夜。次日取出膜用TBST洗膜3次，5 min/次，將膜置二抗稀釋液（1∶10 000）中于搖床上室溫孵育1 h，洗膜后即可進(jìn)行ECL發(fā)光法顯影。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析處理，計量資料采用（x±s）表示，先進(jìn)行數(shù)據(jù)的正態(tài)性檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，符合上述條件者行單因素方差分析比較多組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間對H9c2細(xì)胞中LDH活力的影響 高糖高脂處理H9c2，細(xì)胞上清LDH的活性呈濃度及時間依賴性，隨著濃度和時間的逐漸增加，上清LDH的活性與高糖高脂處理間呈濃度及時間依賴性（P<0.05），見表2。

2.2 高糖高脂可增加H9c2細(xì)胞中ANP mRNA水平的表達(dá) 隨著濃度和時間的逐漸增加，ANP的表達(dá)也逐漸升高，且在高糖高脂B組（33 mmol/L葡萄糖+500 ?mol/L棕櫚酸鈉）干預(yù)細(xì)胞36 h時ANP表達(dá)量達(dá)到高峰（P<0.01）。見表3。

2.3 高糖高脂促進(jìn)α-SKA mRNA的表達(dá) 相比對照組而言，高糖高脂促進(jìn)α-SKA 的表達(dá)，且在36 h高糖高脂B組其表達(dá)達(dá)到最高（P<0.05），這與ANP的結(jié)果一致，據(jù)此確定高糖中濃度脂干預(yù)細(xì)胞36 h為干預(yù)濃度和時間，見表4。

2.4 高糖高脂可誘導(dǎo)MAPK蛋白磷酸化 相比對照組，高糖高脂B組干預(yù)24 h MAPK家族成員p38、ERK、JNK磷酸化水平均增高，比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其中p-ERK的活化水平增加了約1.39倍（0.96±0.16 vs 0.69±0.04），p-JNK的活化水平增加了約1.47倍（1.05±0.21 vs 0.78±0.09），而p-p38的活化水平相對于對照組增加了約3.34倍（2.35±0.35 vs 0.71±0.14），見圖1。

3 討論

糖尿病心肌病是在1972年由Rubler等首先提出的，糖尿病心肌病的定義為有明確糖尿病病史，同時有明確的心肌結(jié)構(gòu)和功能改變，排除缺血性疾病、高血壓及其他可能引起心肌病變的疾病[11-13]。本實(shí)驗(yàn)通過離體實(shí)驗(yàn)用高糖高脂將正常心肌細(xì)胞處理作為體外糖尿病心肌病模型，證實(shí)：高糖高脂可誘發(fā)心肌肥大，進(jìn)而導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)改變；在心肌肥大的發(fā)生及發(fā)展過程中MAPK信號家族具有重要作用。

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素、生活方式等各種原因?qū)е聶C(jī)體持續(xù)高血糖高血脂以及長期代謝紊亂綜合征[14-15]。高糖高脂持續(xù)狀態(tài)下，細(xì)胞外基質(zhì)大量增生、膠原降解異常以及心肌間質(zhì)纖維化，纖維化的增加直接促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖，導(dǎo)致心肌肥大和重構(gòu)，心臟功能受限[16]。目前已有研究利用高糖及不同濃度高脂干預(yù)H9c2心肌細(xì)胞建立糖尿病心肌病模型，通過檢測特異性基因A型心房鈉尿肽（ANP）和α-心肌肌動蛋白（α-SKA）來確定模型的建立成功[17]。據(jù)此筆者采用高糖（33 mmol/L）

及不同濃度高脂（250、500、1000 ?mol/L）干預(yù)細(xì)胞，從而檢測ANP、α-SKA的表達(dá)。相比對照組，高糖高脂顯著增加ANP和α-SKA的mRNA表達(dá)，在高糖高脂（33 mmol/L+500 ?mol/L）36 h時ANP、α-SKA的mRNA表達(dá)最高，因此成功建造了體外糖尿病心肌病模型。

MAPK主要有3個亞組：細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（Extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2）、p38、c-Jun氨基端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terminal kinase/stress activated protein kinase，JNK/SAPK）。每條信號通路都具有高度特異性，具有獨(dú)立的功能，在某些程度上幾條信號通路間存在著一定的關(guān)聯(lián)，很多刺激因素如缺血、缺氧、激素、細(xì)胞因子、細(xì)胞應(yīng)激等各種細(xì)胞外刺激均可誘導(dǎo)其激活，從而成為細(xì)胞增殖、分化、凋亡等與生理過程密切相關(guān)的核反應(yīng)共同通路或匯聚點(diǎn)[18]。有研究已表明ERK主要參與介導(dǎo)細(xì)胞的生長、分化、發(fā)育、增殖等生理病理過程；而p38和JNK則與細(xì)胞炎癥、凋亡、生長、分化、應(yīng)激反應(yīng)等過程有關(guān)[19-20]。在此實(shí)驗(yàn)中，筆者檢測到在糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展過程中ERK、JNK、p38均被激活，且p38的活化水平增加最顯著。這提示筆者p38主導(dǎo)凋亡過程同時伴隨ERK活化而促進(jìn)細(xì)胞增生的現(xiàn)象很有可能是引起DCM發(fā)生發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié)。但細(xì)胞內(nèi)的信號通路是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，是否有其他通路在DCM的發(fā)展過程中發(fā)揮作用還需通過大量研究來進(jìn)一步說明。

綜上所述，筆者通過探討MAPK在由高糖高脂誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞肥厚過程中的作用，揭示以凋亡信號為主導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路及增生通路并存在其中扮演重要角色，從而在機(jī)理方面為DCM的治療提供新的思路，最終為糖尿病心肌病的預(yù)后提供新的靶點(diǎn)。

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