何曉梅，谷仿麗，2，黃仁術(shù)，韓邦興，2，陳乃富，2

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

白及多糖超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性

何曉梅1，谷仿麗1，2，黃仁術(shù)1，韓邦興1，2，陳乃富1，2

(1.皖西學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.植物細(xì)胞工程安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 六安 237012)

研究野生白及多糖的超聲波輔助提取工藝、sevage法脫蛋白及體外抗氧化活性。通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定白及多糖最佳超聲波提取條件為：超聲時(shí)間50 min、超聲溫度60 ℃、超聲波功率400 W、液固比(mL/g)50∶1、提取2次，在上述超聲波提取條件下，白及多糖得率為(26.023±0.076)%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明：白及多糖對(duì)·O2-、·OH和DPPH·具有清除作用；當(dāng)濃度為10 mg/mL時(shí)，脫蛋白白及多糖對(duì)·O2-、·OH和DPPH·自由基的清除率分別為25.32%、88.20%、94.34%，而未脫蛋白的清除率分別為23.15%、63.84%、86.72%。為白及多糖在自由基清除劑、食品添加劑等中的應(yīng)用提供了科學(xué)的參考依據(jù)。

白及；多糖；超聲波提??；sevage法脫蛋白；抗氧化活性

白及又名白芨、連及草、苞舌蘭、箬蘭、甘根、白根、百笠、紫蕙，為蘭科白及屬多年生草本植物白及[Blettilastriata(Thunb.) Reichb.f.]的干燥塊莖。全世界白及屬植物有9種，我國(guó)有4種，即華白及B.sinensis(Rolfe)Schltr.、黃花白及B.ochraceaSchltr.、小白及B.formosana(Hayata) Schltr.及白及[1，2]，野生品白及主產(chǎn)于我國(guó)河南、甘肅、陜西、山東、安徽、江蘇、浙江、福建、廣東、廣西、江西、湖南、湖北、四川、貴州、云南等省區(qū)。白及是研究較多、應(yīng)用較廣的一味中藥，被《中國(guó)藥典》(1995、2005年版)收錄。白及具有收斂止血、清熱利濕、消腫生肌止痛、延緩皮膚衰老之功效，臨床上廣泛用于治療咳血、吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚凍瘡和皸裂、肺結(jié)核咳血、潰瘍病出血等癥，療效顯著。白及用藥歷史久遠(yuǎn)，藥用價(jià)值高，特別是白及塊莖含有黏液質(zhì)多糖，具有抗癌、防癌、抗腫瘤、抗菌、止血、保護(hù)胃黏膜、促進(jìn)傷口愈合、促進(jìn)糖尿病創(chuàng)面愈合、抗氧化、增強(qiáng)免疫力等[3-5]作用。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)白及多糖的研究主要集中于采用不同的試驗(yàn)方法優(yōu)化白及多糖的水提工藝[6-10]以及研究白及多糖及其衍生物作為醫(yī)藥材料[11-14]。研究表明很多疾病是由自由基代謝出現(xiàn)紊亂導(dǎo)致的[15]，目前有許多關(guān)于植物多糖具有抗氧化能力(清除自由基能力)的研究和報(bào)道[16]，但是很少報(bào)道白及多糖的抗氧化作用。本研究以大別山產(chǎn)野生白及為實(shí)驗(yàn)材料，在傳統(tǒng)水提法的基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助處理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上采用正交實(shí)驗(yàn)得出白及多糖的最優(yōu)提取條件，并對(duì)白及多糖進(jìn)行體外抗氧化活性研究，旨在為白及多糖在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和試劑

材料：大別山產(chǎn)野生白及BletillaStriata干燥塊莖——2015年9月份采挖，除去須根，洗凈，置沸水中煮至無(wú)白心，曬至半干，除去外皮，曬干，收藏。

試劑：石油醚、無(wú)水乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、三氯甲烷、正丁醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、牛血清白蛋白、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、水楊酸、DPPH·(1,1-二苯基-2-苦基肼)等試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。

1.2 主要儀器設(shè)備

ZMD-2型電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)、DXF-20C型1000克密封型粉碎機(jī)(西安寶正實(shí)業(yè)有限公司)、RE-52B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海青浦滬西儀器廠)、JK-500B型超聲波清洗器(西安常儀儀器設(shè)備有限公司)、TU1901型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)、GL-21M型冷凍離心機(jī)(貝克曼庫(kù)爾特有限公司)、VD53德國(guó)binder真空干燥箱(艾利特國(guó)際貿(mào)易有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 白及多糖的超聲波輔助提取及sevage法脫蛋白

參照秦亞?wèn)|、魏濤、喬德亮等[17-19]的方法，取干品白及塊莖粉碎，過(guò)20目篩，50 ℃干燥至恒重。精密稱(chēng)取白及粉末5.000 g左右，石油醚(沸程60～90 ℃)脫脂，將脫脂白及粉末于三角燒瓶中加蒸餾水適量攪拌均勻，進(jìn)行超聲提取(超聲頻率20 kHz)、離心上清液濃縮到粘稠狀，冷卻后加95%乙醇，邊加邊緩慢攪拌，使含醇量達(dá)80%，即析出大量白色絮狀沉淀，冰箱靜置過(guò)夜(4 ℃)，離心，將沉淀物再加95%乙醇適量，攪拌，靜置，使之充分脫水，離心，重復(fù)3次，揮干乙醇，加少量蒸餾水，sevage試劑(正丁醇∶氯仿=4∶1)去除游離蛋白，醇沉，低溫干燥，研細(xì)，即得脫蛋白白及多糖。

1.3.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以白及粗多糖得率為考察指標(biāo)，分別研究提取次數(shù)(1次、2次、3次)、超聲提取時(shí)間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)、超聲提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲波功率(100 W、200 W、300 W、400 W、500 W)、液固比(20∶1 mL/g、30∶1 mL/g、40∶1 mL/g、50∶1 mL/g、60∶1 mL/g)對(duì)白及多糖提取效果的影響。

1.3.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用L9(34)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.4 白及多糖含量的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，其標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為：y=11.367x-0.172 7，R2=0.997 4，葡萄糖濃度(mg/mL)在0～0.1之間線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.3.5 白及粗多糖得率的計(jì)算方法

粗多糖得率(%)=[粗多糖質(zhì)量(g)/白及粉質(zhì)量(g)]*100%

1.3.6 蛋白質(zhì)檢測(cè)

采用考馬斯亮藍(lán)G-250(Bradford)法。利用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)到幾乎無(wú)蛋白，即得脫蛋白白及多糖。

1.3.7 白及多糖抗氧化活性研究

1)白及多糖清除超氧陰離子自由基(·O2-)能力：采用改良鄰苯三酚自氧化法[20]。

(·O2-)清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100

式中：A樣品為樣品組鄰苯三酚自氧化速率(ΔA/min)；

A對(duì)照為對(duì)照組鄰苯三酚自氧化速率(ΔA/min)。

2)羥基自由基(·OH)清除率的測(cè)定：·OH清除率的測(cè)定采用水楊酸法[21]。

(·OH)清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100

A空白——不加多糖溶液的吸光度；A樣品——加多糖溶液的吸光度；A對(duì)照——不加H2O2的多糖溶液的吸光度

3)DPPH·清除能力的測(cè)定

參照王玲、何芳等[22，23]的方法略作修改。樣品管中依次加入3 mL不同濃度的多糖溶液和3 mL 10 mmol/L DPPH·溶液充分搖勻；對(duì)照管中用3 mL無(wú)水乙醇代替DPPH·溶液充分搖勻；空白管中用3 mL蒸餾水代替多糖溶液充分搖勻。上述三組溶液避光靜置30 min，測(cè)定517 nm處吸光度值。根據(jù)公式計(jì)算多糖對(duì)DPPH·的清除能力。

DPPH·清除率(%)=[1-(A樣品-A對(duì)照)/A空白]×100

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取約5.000 g恒重白及粉(以下同)，在液固比(mL/g)20∶1，30∶1，超聲波功率300 W、超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃條件下，進(jìn)行3次超聲波輔助浸提，粗多糖得率見(jiàn)圖1。隨著提取次數(shù)的增加，粗多糖得率依次減少，第1次和第2次浸提得率接近，第3次浸提得率減少明顯。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇2次浸提。

圖1 提取次數(shù)對(duì)粗多糖得率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

在液固比(mL/g)30∶1，超聲波功率300 W，超聲溫度50 ℃，超聲時(shí)間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min條件下，進(jìn)行2次超聲波輔助浸提，粗多糖得率見(jiàn)圖2。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)粗多糖得率的影響

實(shí)驗(yàn)研究時(shí)，將5個(gè)水平15份水溶液按超聲時(shí)間由長(zhǎng)到短的順序進(jìn)行超聲波處理，超聲時(shí)間越長(zhǎng)多糖得率越高。當(dāng)超聲時(shí)間小于40 min時(shí)，多糖得率升高迅速，40 min以后增加較緩慢，綜合考慮效率和得率因素，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為40 min。

2.1.3 超聲溫度對(duì)粗多糖得率的影響

在液固比(mL/g)30∶1，超聲波功率300 W，超聲時(shí)間40 min，超聲溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下，進(jìn)行2次超聲波輔助浸提，粗多糖得率見(jiàn)圖3。

圖3 超聲溫度對(duì)粗多糖得率的影響

隨著超聲溫度的提高，多糖得率逐漸升高。在實(shí)驗(yàn)研究的溫度范圍內(nèi)，多糖得率增加呈現(xiàn)漸升式，考慮到在較高的處理溫度下，白及多糖的粘度特性可能受到影響，因而從提高產(chǎn)物穩(wěn)定性角度考慮，適宜的處理溫度應(yīng)低于80 ℃，本實(shí)驗(yàn)選擇60 ℃。

2.1.4 超聲波功率對(duì)粗多糖得率的影響

在液固比(mL/g)30∶1，超聲提取時(shí)間40 min,超聲提取溫度60 ℃，超聲波功率分別為100 W、200 W、 300 W、400 W、500 W條件下，進(jìn)行2次超聲波輔助浸提，粗多糖得率見(jiàn)圖4。

圖4 超聲功率對(duì)粗多糖得率的影響

隨著超聲波處理功率的增大，白及多糖提取得率先增大后減小，在超聲波功率低于400 W時(shí)，多糖得率隨超聲波功率的增大而提高，在超聲波功率高于400 W時(shí)，多糖得率又隨超聲波功率的增大而降低，可能是由于大的超聲波提取功率所產(chǎn)生機(jī)械效應(yīng)作用使多糖的糖苷鍵被打斷，多糖結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致多糖得率降低，因此選擇超聲波處理功率為400 W。

2.1.5 液固比對(duì)粗多糖得率的影響

在超聲時(shí)間40 min，超聲溫度70 ℃，液固比(mL/g)分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1條件下，進(jìn)行2次超聲波輔助浸提，粗多糖得率見(jiàn)圖5。

圖5 液固比對(duì)粗多糖得率的影響

當(dāng)液固比小于40時(shí)，多糖得率隨液固比增加而增加。因?yàn)殡S著溶劑量的增加，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)形成的濃度差越大，胞內(nèi)物質(zhì)擴(kuò)散越快，浸出物越多，浸提液中糖含量越高。但當(dāng)液固比大于40時(shí)，即隨著溶劑量的繼續(xù)增加，多糖得率增加緩慢，趨于平衡，可能是由于雜質(zhì)浸出量的增加，同時(shí)，考慮到溶劑量過(guò)高，不利于后續(xù)濃縮、純化等過(guò)程。故后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇液固比為40 mL/g。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果和方差分析表分別見(jiàn)表1和表2。

極差R值分析表明，影響白及多糖得率因素主次順序?yàn)椋阂汗瘫取党暡üβ省党暅囟取党晻r(shí)間。方差分析結(jié)果表明，各因素對(duì)多糖得率影響都不顯著。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，白及多糖超聲輔助提取的最優(yōu)條件為A3B1C2D3，即超聲時(shí)間50 min、超聲溫度60 ℃、超聲波功率400 W、液固比為50 mL/g。在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，白及多糖得率為(26.023±0.076)%。

表1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 方差分析表

2.3 白及多糖抗氧化活性

圖6 未脫蛋白白及多糖對(duì)自由基的清除作用

圖7 脫蛋白白及多糖對(duì)自由基的清除作用

根據(jù)1.3.1的方法分別得到未脫蛋白和脫蛋白白及多糖干品，研碎，稱(chēng)重，溶解，配成不同濃度的溶液，研究其對(duì)超氧陰離子、羥基自由基和二苯基苦酰肼基自由基的清除作用，結(jié)果如圖6和7。圖6和圖7表明：白及多糖對(duì)·O2-、·OH 和DPPH·自由基具有清除作用；相同質(zhì)量濃度的脫蛋白白及多糖較未脫蛋白的白及多糖對(duì)自由基的清除能力強(qiáng)，說(shuō)明有機(jī)溶劑sevage試劑(正丁醇和氯仿)的加入沒(méi)有對(duì)多糖的活性產(chǎn)生影響；當(dāng)實(shí)驗(yàn)濃度為10 mg/mL時(shí)，脫蛋白白及多糖對(duì)·O2-、·OH和DPPH·自由基的清除率分別為25.32%、88.20%、94.34%，而未脫蛋白的清除率分別為23.15%、63.84%、86.72%。

3 結(jié)語(yǔ)

(1)以白及多糖得率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定超聲輔助提取最優(yōu)條件為：超聲時(shí)間50 min、超聲溫度60 ℃、超聲波功率400 W、液固比(mL/g)50∶1、提取2次，在上述超聲波提取條件下，白及多糖得率為(26.023±0.076)%。

(2)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，白及多糖具有清除超氧陰離子自由基、羥基自由基和二苯基苦酰肼基自由基的能力，但清除能力不同。

(3)有機(jī)溶劑sevage試劑的使用不影響白及多糖的活性。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and in vitro Antioxidant ActivitiesEvaluation of Polysaccharides fromBlettilastriata

HE Xiaomei1, GU Fangli1,2, HUANG Renshu, HAN Bangxing1,2, CHEN Naifu1,2

(1.CollegeofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WestAnhuiUniversity,Lu’an237012,China；2.AnhuiProvinceEngineeringTechnologyResearchCenterofPlantCellEngineering,Lu’an237012,China)

The ultrasonic-assisted extraction technology of crude polysaccharide from wildBlettilastriata, Sevag’s deproteination and its antioxidant activities of the polysaccharide were investigated. On the basis of single factor test，extraction technology condition was optimized by orthogonal test．Our results showed the best extracting condition was as follows: extracting time 50 min，extracting temperature 60℃，ultrasonic power 400W，water-material ratio(mL / g)50:1 and extracting 2 times．Under the above conditions，the extraction rate of the crude polysaccharide can reach to (26.023±0.076)%．Meanwhile，the scavenging activity of the polysaccharide on ·O2-, ·OH and DPPH· free radicals were significant．The clearance rates of the deproteinizedBlettilastriatapolysaccharide was up to 25.32%, 88.20% and 94.34% respectively，and the undeproteinizedBlettilastriatapolysaccharides up to 23.15%, 63.84%, 86.72% respectively. The study will provide scientific basis and reference for application ofBlettilastriataPolysaccharide in the field of free-radical scavengers and food additives．

Blettilastriata; Polysaccharide; ultrasonic extraction; Sevage’s deproteination；antioxidative activity

2016-11-08

安徽省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2017A407)；中央財(cái)政林業(yè)科技推廣示范項(xiàng)目(2016TG05)；皖西學(xué)院校級(jí)自然科學(xué)研究項(xiàng)目(WXZR201622)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31271853)；安徽省級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(201610376035)。

何曉梅(1974-)，女，安徽霍山人，碩士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)。

TS202.3

A

1009-9735(2017)02-0001-05