胡春曉，龐建云，汪小涵，沈成英，袁海龍#

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.空軍總醫(yī)院藥學部，北京 100142)

十二味菝葜顆粒質(zhì)量標準研究Δ

胡春曉1，2*，龐建云1，2，汪小涵1，2，沈成英2，袁海龍2#

(1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，四川 成都 611137； 2.空軍總醫(yī)院藥學部，北京 100142)

目的：建立十二味菝葜顆粒的質(zhì)量標準。方法：采用薄層色譜法對十二味菝葜顆粒中的菝葜、槐花、丹參、苦參進行定性鑒別；采用高相液相色譜法對菝契和土茯苓的共同有效成分落新婦苷進行含量測定，色譜柱為Inertsil?ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)為流動相，檢測波長為291 nm。結(jié)果：薄層色譜斑點清晰，分離度好。落新婦苷進樣量在0.015 3～0.306 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2=0.999 9)。精密度、穩(wěn)定性與重復性試驗的RSD均<2%。平均回收率為100.22%(RSD為0.53%，n=6)。結(jié)論：薄層色譜法及高效液相色譜法易于操作、重復性好，可有效控制十二味菝葜顆粒的質(zhì)量。

十二味菝葜顆粒； 質(zhì)量標準； 薄層色譜法； 高效液相色譜法

十二味菝葜顆粒是由菝契、土茯苓、槐花、丹參、苦參等12味中藥組成，是空軍總醫(yī)院的醫(yī)院制劑(批準文號：總L2017001)，具有清熱解毒、涼血散血的功能，用于血熱型尋常型銀屑病的治療，亦可治療血虛、血燥型銀屑病兼有血熱者。為更好地控制該制劑的質(zhì)量、保證其臨床療效，本研究對方中菝葜、槐花、丹參、苦參進行薄層色譜鑒別，并采用高相液相色譜法對制劑中君藥菝契和土茯苓的共同有效成分落新婦苷進行定量研究。

1 材料

1.1 儀器

AgiLent 1260型高效液相色譜儀(美國AgiLent公司)。

1.2 藥品與試劑

菝葜對照藥材(批號：121466-201403)、丹參對照藥材(批號：120923-201414)、蘆丁對照品(批號：100080-201409)、苦參堿對照品(批號：110805-200508)、落新婦苷對照品(純度：93.9%，批號：111798-201504)，上述對照物質(zhì)均購于中國食品藥品檢定研究院；十二味菝葜顆粒(規(guī)格：10 g/袋，自制，批號：20150504、20150505、20150506)；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 菝葜的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻的方法[1-2]，取本品內(nèi)容物3 g，加乙醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液加鹽酸5 ml，加熱回流2 h，放冷，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，蒸至無醇味，殘渣用熱水40 ml溶解，用二氯甲烷振搖提取2次(40、30 ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取菝葜對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方比例制備缺菝葜樣品，同法制得陰性對照溶液。參照《中華人民共和國藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)已烷-乙酸乙酯(V∶V=4∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

1.菝葜對照藥材；2-4.供試品；5.陰性對照1.reference herb of Chinaroot Greenbier Rhizome；2-4.samples；5.negative sample圖1 菝葜TLC圖Fig 1 TLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.1.2 槐花的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻的方法[3-4]，取本品內(nèi)容物1 g，加甲醇10 ml，密塞，振搖10 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取蘆丁對照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例制備缺槐花樣品，同法制得陰性對照溶液。參照《中華人民共和國藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(V∶V∶V=8 ∶1 ∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇試液顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

1.蘆丁對照品；2-4.供試品；5.陰性對照1.reference substance of rutin；2-4.samples；5.negative sample圖2 槐花TLC圖Fig 2 TLC chromatogram of Sophorae flos

2.1.3 丹參的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻的方法[5-6]，取本品內(nèi)容物2 g，加乙醚10 ml，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。按處方比例制備缺丹參樣品，同法制得陰性對照溶液。參照《中華人民共和國藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=6 ∶5 ∶0.8)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以三氯化鐵溶液顯色。結(jié)果顯示，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

1.丹參對照藥材；2-4.供試品；5.陰性對照1.reference herb of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma；2-4.samples；5.negative sample圖3 丹參TLC圖Fig 3 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma

2.1.4 苦參的色譜鑒別：參考相關(guān)文獻的方法[7-8]，取本品內(nèi)容物2 g，加水25 ml，超聲處理30 min，濾過，取續(xù)濾液5 ml，置于分液漏斗中，加濃氨試液調(diào)節(jié)pH至11，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，置水浴后上蒸干，殘渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取苦參堿對照品，加三氯甲烷制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按處方比例制備缺苦參樣品，同法制得陰性對照溶液。參照《中華人民共和國藥典：2015年版》“通則0502”薄層色譜法，吸取上述3種溶液各4 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯-乙酸乙酯-丙酮-濃氨試液(V∶V∶V∶V=2 ∶4 ∶3 ∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。結(jié)果顯示，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖4。

1.苦參堿對照品；2-4.供試品；5.陰性對照1.reference substance of matrine；2-4.samples；5.negative sample圖4 苦參TLC圖Fig 4 TLC chromatogram of Sophorae flavescentis radix

2.2 高效液相色譜法測定落新婦苷的含量

參考相關(guān)文獻[9-10]，采用高效液相色譜法測定落新婦苷的含量。

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應性試驗：色譜柱為Inertsil?ODS-3色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)；流速為1.0 ml/min；檢測波長為291 nm；進樣量為10 μl。理論板數(shù)按落新婦苷峰計算應≥5 000。

2.2.2 對照品溶液的制備：取落新婦苷對照品適量，精密稱定，加60%甲醇制成每l ml含15.3 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備：取本品約10 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，精密加入60%甲醇25 ml，稱定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用60%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 ml，稀釋至10 ml，即得。

2.2.4 陰性對照溶液的制備：按處方比例稱取除菝葜和土茯苓的其余藥味，按照制備工藝制成缺菝葜與土茯苓的陰性樣品，按照“2.2.3”項下供試品溶液制備方法操作，制成陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性考察：精密吸取供試品、對照品和陰性對照溶液各10 μl，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進行測定。結(jié)果顯示，陰性對照色譜圖中，在與供試品及對照品色譜圖中相應的保留時間處無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性對照無干擾，見圖5。

A.落新婦苷對照品；B.供試品；C.陰性對照樣品A.reference substance of astilbin；B.sample；C.negative sample圖5 菝葜HPLC圖Fig 5 HPLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.2.6 線性關(guān)系考察：分別精密吸取對照品溶液1、5、10、15、20 μl進樣分析，記錄峰面積。以峰面積(Y)對進樣量(X，μg)進行線性回歸，得回歸方程為：Y=337.49X+1.542 8，r2=0.999 9。結(jié)果表明，落新婦苷進樣量在0.015 3～0.306 0 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗：精密吸取對照品溶液10 μl重復進樣6次，測得峰面積值RSD=0.84%(n=6)，表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定。結(jié)果顯示，落新婦苷峰面積值的RSD=1.37%(n=6)，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗：精密稱取同一批次樣品6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液并測定含量。結(jié)果顯示，RSD=1.29%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗：稱取十二味菝葜顆粒約5 g，精密稱定，精密加入一定量的落新婦苷對照品，按“2.2.1”項同法操作，測定落新婦苷的含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品的含量測定：分別稱取不同批號的十二味菝葜顆粒約10 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，結(jié)果見表2。

表1 落新婦苷加樣回收率試驗結(jié)果

表2 落新婦苷含量測定結(jié)果

3 討論

本實驗建立的十二味菝葜顆粒中菝葜、槐花、丹參、苦參的薄層色譜鑒別法以及落新婦苷的高效液相含量測定方法，簡便可行，方法學考察結(jié)果表明該方法專屬性、精密度、穩(wěn)定性、重復性好，可用于十二味菝葜顆粒的質(zhì)量監(jiān)控。本實驗對三種不同類型的色譜柱進行了考察，包括Kromasil 100-5C18色譜柱、Inertsil?ODS-3色譜柱、Arcus EP-C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)Inertsil?ODS-3色譜柱的分離效果及峰形最好；考察了3種流動相系統(tǒng)，包括乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)基線平穩(wěn)，峰形較好，落新婦苷與其他組分達到基線分離，而乙腈-水系統(tǒng)峰形差，甲醇-0.1%磷酸系統(tǒng)各峰分離度較差，故選擇乙腈-0.1%磷酸系統(tǒng)為流動相。

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Quality Standard for Shi’erwei Baqia ParticlesΔ

HU Chunxiao1，2, PANG Jianyun1，2, WANG Xiaohan1，2, SHEN Chengying2, YUAN Hailong2

(1.College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China)

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Shi’erwei Baqia particles. METHDS: TLC was implemented to identify Chinaroot greenbier rhizome, Sophorae flos, Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma and Sophorae flavescentis radix; and the common active ingredients in Chinaroot greenbier rhizome and Rhizoma smilacis glabrae was determined by HPLC method. The chromatographic column was Inertsil?ODS-3 column(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid(V∶V=16 ∶84), with detection wavelength of 291 nm. RESULTS: Diagnostic and clear spots were showed in TLC chromatogram. Astilbin showed a good linear relationship in the range of 0.015 3-0.306 0 μg(r2=0.999 9). The relative standard deviation values of precision，stability and repeatability were less than 2%. The average recovery was 100.22%(RSD=0.53%，n=6). CONCLUSIONS: The method iseasy to carry out with a good reproducibilty, and could be used to control the quality of Shierwei Baqia particles.

Shierwei Baqia particles; Quality standard; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標準提高科研專項(No.13ZJZ12-5)

R927.2

A

1672-2124(2017)04-0438-04

2017-02-20)

*碩士研究生。研究方向：中藥新制劑、新劑型及新技術(shù)研究。E-mail：1940596849@qq.com

#通信作者：研究員，博士生導師。研究方向：中藥新型給藥系統(tǒng)。E-mail：yhlpharm@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.04.003