寧衛(wèi)衛(wèi) 曾園園 朱健潔 劉澤毅 郭圓圓 黃建安

·基礎(chǔ)研究·

miR-124對非小細胞肺癌細胞增殖的影響及其機制

寧衛(wèi)衛(wèi) 曾園園 朱健潔 劉澤毅 郭圓圓 黃建安

目的 探討miR-124對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖的影響及其機制。方法 采用CCK8法和克隆形成實驗評估m(xù)iR-124對細胞增殖能力的影響。采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot檢測miR-124轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)PIM3的表達水平。通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測miR-124對PIM3熒光素酶活性的影響，證實miR-124可靶向作用于PIM3的3’UTR區(qū)。采用qRT-PCR和Western blot檢測si-PIM3轉(zhuǎn)染后細胞內(nèi)PIM3的表達情況，采用CCK8法和克隆形成實驗檢測沉默PIM3后對細胞增殖能力的影響。結(jié)果 ①miR-124模擬物組的細胞活性(OD值)低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義，且呈時間依賴性；miR-124模擬物組的克隆形成數(shù)明顯少于其對照組。②miR-124模擬物組的miR-124過表達后，其PIM3表達低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義。③含野生型結(jié)合位點(PIM3 3’UTR區(qū)完整片段)的miR-124模擬物組的熒光素酶活性低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義；含突變型結(jié)合位點(PIM3 3’UTR區(qū)突變片段)的兩組無明顯差異。④si-PIM3組的PIM3被沉默后，其表達水平明顯低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義；si-PIM3組的細胞活性(OD值)低于其對照組，差異有統(tǒng)計學意義，且呈時間依賴性；si-PIM3組的克隆形成數(shù)明顯少于其對照組。結(jié)論 miR-124可通過靶向作用于PIM3的3’UTR區(qū)下調(diào)后者的表達而抑制NSCLC細胞的增殖。

非小細胞肺癌；miR-124；PIM3；細胞增殖

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:697～701)

MicroRNAs (miRNAs)是1類長約20～25 bp的非編碼RNA，其可通過與下游靶基因的mRNA進行堿基互補配對，而從轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因表達。現(xiàn)已證實，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。其中，miR-124被認為在多種實體腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中擔任著“抑癌基因”的角色。例如miR-124可抑制腫瘤細胞的增殖[1-2]，促進腫瘤細胞的凋亡[3-4]，以及抑制腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移等[5-8]。本研究中，我們通過TargetScan 6.2在線軟件預(yù)選出PIM3作為miR-124的靶基因之一，并通過雙熒光報告載體系統(tǒng)和細胞實驗證實了miR-124對PIM3的作用機制以及對非小細胞肺癌(NSCLC)細胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)

人NSCLC細胞株A549購買自中國科學院上海細胞研究所。細胞培養(yǎng)在含10 %胎牛血清(FBS)、L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI-1640 medium(購自美國HyClone公司)中，置于37 ℃含5 %CO2的細胞培養(yǎng)箱中。

1.2 RNA提取，cDNA合成及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

用RNAiso Plus試劑盒(購自日本TaKaRa公司)提取所培養(yǎng)細胞的總RNA。用Reverse Transcriptase M-MLV試劑盒(購自日本TaKaRa公司)進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用于qRT-PCR的miR-124的引物序列由廣州銳博公司合成；PIM3引物序列如下：正向5’-AAGCTCATCGACTTCGGTTC-3’，反向5’-GAGGATCTCCTCGTCCTGCT-3’；GAPDH引物序列如下：正向：5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，反向：5’-GGCATGGACTGTGGTCATGG-3’。 用SYBR Premix ExTaqTM試劑(購自日本TaKaRa公司)，基于ABI StepOne Plus Real-Time PCR系統(tǒng)(購自美國Applied Biosystems公司)進行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序如下：50 ℃，2 min；預(yù)變性95 ℃，10 min；然后變性95 ℃，15 s；退火延伸60 ℃，1 min；一共進行40次循環(huán)。每次在延伸階段讀取熒光值。PIM3和miR-124的mRNA值分別以內(nèi)參GAPDH和U6作為標準化參照，其相對表達量用2-ΔΔCt(Ct代表循環(huán)閾值)值計算表示。

1.3 構(gòu)建PIM3 3’UTR-熒光素酶報告載體，瞬時轉(zhuǎn)染和熒光檢測

我們先用TargetScan 6.2在線軟件預(yù)選出PIM3基因3’UTR區(qū)內(nèi)可以與miR-124相結(jié)合的一片段，然后將該段序列以原序列或?qū)⑵渫蛔兊姆绞竭M行合成延伸，最后亞克隆到psiCHECK2載體中。用miR-124模擬物(購自上海吉瑪公司)、miR-NC(購自購自上海吉瑪公司)和Lipofectamine 2000(購自美國Invitrogen公司)瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞株48 h后，收集細胞。用購自美國Dual-Luciferase Report Assay試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.4 細胞增殖檢測

瞬時轉(zhuǎn)染48h后，將A549細胞株接種到96孔板中(2×103個細胞/孔)，每組設(shè)3個平行復孔，并設(shè)置調(diào)零孔(不接種細胞，僅加入RPMI 1640培養(yǎng)基)。用Cell Counting Kit-8 檢測試劑盒(購自中國武漢博士德公司)分別檢測接種24 h、48 h和96 h后的細胞活性。檢測時每孔加10 μl CCK8檢測試劑，于37 ℃孵育4 h后，用酶標儀測定450 nm波長的吸光度值(OD值)。

1.5 細胞裂解和Western-Blot實驗

當A549細胞在細胞培養(yǎng)瓶中長到80 %～90 %時，用RIPA buffer(購自美國Cell Signaling Technology公司)和蛋白酶抑制劑以及磷酸酶抑制劑(購自美國Sigma公司)裂解細胞，收獲蛋白質(zhì)。 SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)；蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上；免疫反應(yīng)(一抗、二抗孵育)；化學發(fā)光(ECL試劑盒)；顯影和定影。一抗?jié)舛?抗β-actin單抗為1∶3000，抗PIM3多抗為1∶1000)，二抗?jié)舛?山羊抗鼠為1∶2000，山羊抗兔為1∶2000)。ECL試劑盒購自美國Thermo Scientific公司；一抗(抗PIM3多體、抗β-actin單體)和辣根過氧化物酶標記的二抗(山羊抗鼠、山羊抗兔)均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 miR-124對NSCLC細胞增殖的影響

將miR-124及其對照模擬物瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞株后，采用qRT-PCR和CCK8法檢測，結(jié)果顯示miR-124過表達(圖1A)可以明顯抑制細胞增殖，且呈時間依賴性(圖1B)?？寺⌒纬蓪嶒炓沧C實了這一點(圖1C)。

2.2 miR-124直接作用于PIM3的3’UTR下調(diào)其的表達

用TargetScan 6.2在線軟件預(yù)測并選出PIM3可能是miR-124調(diào)控的下游靶基因之一，然后通過細胞轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，miR-124的過度表達可明顯抑制腫瘤細胞內(nèi)PIM3的表達。為了探討miR-124對PIM3的作用機制，用miR-124結(jié)合位點的PIM3 3’UTR片段的原序列(野生型)和突變序列(突變型)分別亞克隆到psiCHECK2雙熒光載體中，將由此得到的重組載體與miR-124模擬物或其對照模擬物共同瞬時轉(zhuǎn)染到A549細胞株中。后續(xù)的熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，具有野生型結(jié)合位點的miR-124模擬物組的熒光素酶活性較對照組明顯減弱，而突變型結(jié)合位點的miR-124模擬物組與對照組的熒光素酶活性無明顯差異，表明miR-124可以直接特異性地結(jié)合到PIM3的3’UTR區(qū)。因此，這些結(jié)果強有力地證明了miR-124可通過直接作用于PIM3的3’UTR區(qū)而下調(diào)后者的表達。

2.3 miR-124和PIM3對NSCLC細胞增殖的影響

將si-PIM3及其對照模擬物瞬時轉(zhuǎn)染A549細胞株后，采用CCK8法檢測，結(jié)果顯示PIM3被沉默后(圖2 A,B)，腫瘤細胞的增殖能力均明顯減弱，且呈時間依賴性(圖2C)。類似的結(jié)果也出現(xiàn)在miR-124及其對照組模擬物轉(zhuǎn)染細胞后的CCK8檢測結(jié)果(圖1B)及克隆形成實驗的結(jié)果中(圖1C,2D)。綜上，推斷miR-124可通過削弱PIM3的“促癌”作用而抑制NSCLC細胞增殖。

A為qRT-PCR檢測；B為CCK-8檢測；C為克隆形成實驗。

3 討論

非小細胞肺癌(NSCLC)是目前世界上最常見的肺癌類型(>80 %)，其傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)、放療、化療，但其5年中位生存率仍然僅為10 %左右[9]。近年來，分子靶向治療已成為非小細胞肺癌最熱門也最具前景的研究領(lǐng)域，其相關(guān)驅(qū)動基因包括EGFR、KRAS、ELM4-ALK、cMET、ROS1、RET等。但是此類患者往往需承擔更加高昂的藥物費用，且大多也會在一到兩年內(nèi)因出現(xiàn)耐藥而“無藥可醫(yī)”。因此，探索非小細胞肺癌的發(fā)病機制及尋找新的診斷和治療方向很有必要。MicroRNAs(miRNAs)是真核生物體內(nèi)一類長約20～25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA。成熟的miRNAs可通過與其下游靶基因的mRNA進行堿基互補配對，從而使后者發(fā)生降解、影響其穩(wěn)定性或抑制其表達。1種miRNA可有多個靶基因，而多種miRNA也可作用于同1個靶基因。其中，miR-124是一類在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)表達含量最豐富的miRNA，在原腸胚形成和神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。多項研究證實，miR-124多種類型實體腫瘤中低表達，如結(jié)腸癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌等[1-2,4]。近期，Yayun Zhang等[10]和Xie Chao等[11]研究結(jié)果顯示miR-124在NSCLC組織和細胞株中低表達，且與NSCLC轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。同時，后者的進一步研究表明miR-124可直接與其下游靶基因SOX8 mRNA的3’UTR結(jié)合，從而抑制NSCLC細胞增殖。Li XiuMei等[12]研究表明，miR-124可通過靶向作用于STAT3而抑制NSCLC細胞增殖，并可作為術(shù)后患者的一項預(yù)后指標。Yingjia Sun等[13]證實NF-κB介導的miR-124在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NSCLC中低表達；而miR-124可通過靶向作用于MYO10，抑制NSCLC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，Lidong Zu等[14]發(fā)現(xiàn)miR-124和TGF-β信號通路之間存在的反饋回路可能參與NSCLC的轉(zhuǎn)移過程。因此，與其他類型腫瘤一樣，miR-124在NSCLC中呈低表達，其可通過作用于其下游的多種靶基因抑制腫瘤細胞增殖，并可作為NSCLC靶向治療和判斷預(yù)后的一項潛在指標。

A、B分別為qRT-PCR和Western blot檢測；C、D分別為 CCK8法和克隆形成實驗。

本研究中，我們通過TargetScan 6.2在線軟件預(yù)測并選出PIM3作為miR-124的下游靶基因之一。PIM3是原癌基因PIM3家族的新成員，與其余兩個成員PIM1和PIM2有著高度同源的基因序列。因此PIM家族的生物學特性很相似，均可以表達絲/蘇氨酸激酶活性，磷酸化多種特異性底物，調(diào)控細胞周期和凋亡。目前認為PIM3發(fā)揮生物學功能主要有以下幾個途徑：通過磷酸化Bad或上調(diào)Bcl-2表達，抑制細胞凋亡；磷酸化P27、P21、Cdc25A、Cdc25C、C-TAK1等，加速細胞周期進程；通過調(diào)控AMPK、c-Myc和PGC-α或磷酸化EIF4B，提高蛋白合成；通過SOCS6抑制Erk1/2，從而抑制胰島素分泌；調(diào)控內(nèi)皮細胞擴散、遷移和增殖以及胚胎干細胞的自我更新；調(diào)節(jié)Myc的轉(zhuǎn)錄活性等[15]。因此，PIM3的異常表達勢必參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如促進腫瘤增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細胞凋亡及誘導腫瘤血管生成等[16]?，F(xiàn)已證實，PIM3在多種腫瘤，尤其是在內(nèi)胚層衍生器官發(fā)生的腫瘤中異常高表達，如肝癌、胰腺癌和結(jié)腸癌等。然而，PIM3與肺癌的相關(guān)性研究鮮有報道。羅強等[17]和倪志強等[18]研究發(fā)現(xiàn)PIM3在體外肺癌細胞系和術(shù)后肺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織和正常組織，且與腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與肺癌類型等其他臨床病理特征無關(guān)。同時后者還發(fā)現(xiàn)PIM3可能參與抑制非小細胞肺癌細胞凋亡；何凌云等[19]認為PIM3和Cdk-2可協(xié)同高表達參與肺鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程。

另外，近期有學者用雙熒光素酶報告系統(tǒng)篩選出miR-15a/b、miR-16、miR-33a/b、miR-124、miR-195和miR-506能通過直接靶向作用于PIM3的3’UTR而抑制其熒光素酶活性，同時通過細胞實驗證實miR-506可下調(diào)PIM3表達而抑制胰腺癌細胞增殖[20]。本研究中，我們用TargetScan 6.2在線軟件和雙熒光素酶報告系統(tǒng)預(yù)選和證實了PIM3也是miR-124的下游靶基因之一，且首次證實在NSCLC細胞中，miR-124可通過下調(diào)PIM3表達而抑制腫瘤細胞增殖。因此，如果能進一步通過動物實驗和臨床試驗證實，miR-124很可能成為治療NSCLC的新靶點之一。然而，不同miRNA與多種靶基因形成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)極其龐大和復雜，且它們在不同腫瘤中的作用亦可有差別，因此miR-124及其靶基因在NSCLC中的作用機制和潛在價值仍需進一步研究和探索。

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(編輯：吳小紅)

Effect of miR-124 on Cell Proliferation of Non-small Cell Lung Cancer and ItsMechanism

NINGWeiwei,ZENGYuanyuan,ZHUJianjie,etal.

TheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou,215006

Objective To study the effectof miRNA-124 on cell proliferation of non-small cell lung cancer(NSCLC) and its mechanism.Methods The CCK8 assay and colony formation assay were employed to evaluate the impact of miR-124 on cell proliferation.Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and western-blot were used to detect PIM3 expression in the cells transfected with miR-124.The dual luciferase reportor gene assay was performed to detect the influence of miR-124 upon PIM3 luciferase activity,which demonstrated that miR-124 specifically could bind to PIM3 3’UTR.The PIM3 expression in the cells transfected with si-PIM3 was detected with qRT-PCR and western-blot,while effect of PIM3 silencing on cell proliferation was assessed by CCK-8 assay and colony formation assay.Results ①The cell viability (OD value) in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,and in a time-dependent manner.The colony-forming populations of cultural cells in miR-124 mimics group were significantly less than the control group.②PIM3 expression of cells in miR-124 mimics group was lower than the control group,with statistically significant difference,after overexpression of miR-124 in the experimental group.③The luciferase activity of PIM3 with intact 3’UTR region (wildt-ype) in miR-124 mimics group was lower than the control group,and the difference was statistically significant.While no difference was shown in the luciferase activity of PIM3 with mutant 3’UTR region (mutant-type) between the experimental group and the control group.④PIM3 expression of cells in si-PIM3 group (kockdown group) and si-NC group were statistically different.The cell viability (OD value) in si-PIM3 group was lower than the control group,with statistically significant difference,in a time-dependent manner.And the colony-forming populations of cultural cells in si-PIM3 group were extremely less than the control group.Conclusion miR-124 can directly bind to 3’UTR of PIM3,thus reducing PIM3 expression to inhibit proliferation of NSCLC cells.

Non-small cell lung cancer(NSCLC);miR-124;PIM3;Cell proliferation

國家自然科學基金(編號：31270940)，蘇州市臨床醫(yī)學中心(編號：Szzx201502)

215006 蘇州大學附屬第一醫(yī)院(寧衛(wèi)衛(wèi)，曾園園，朱健潔，劉澤毅，郭圓圓，黃建安)；215006 蘇州大學呼吸疾病研究所(曾園園，朱健潔，劉澤毅，黃建安)

黃建安

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.05.001

R734.2

A

1001-5930(2017)05-0697-05

2016-04-11

2017-03-28)