余 盼

犬精液品質(zhì)檢查技術(shù)概述

余 盼

精液品質(zhì)是公犬繁殖性能最主要的指標(biāo)之一，很大程度決定了與配母犬的受胎率。同時(shí)也是犬人工授精技術(shù)、精液低溫保存技術(shù)等繁殖技術(shù)的基礎(chǔ)。本文主要從精液的一般性狀（精液量、精液顏色和精子密度）、精子活力以及形態(tài)學(xué)三個(gè)方面對犬精液品質(zhì)檢查技術(shù)手段進(jìn)行簡要概述，旨在提高犬精液品質(zhì)檢查技術(shù)。

犬作為寵物、工作用途以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在國內(nèi)外已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)龐大且重要的產(chǎn)業(yè)。隨著養(yǎng)犬行業(yè)的發(fā)展，犬群規(guī)模的逐年擴(kuò)大以及犬育種工作的開展，對犬繁殖性能的要求也越來越高。公犬的精液質(zhì)量與母犬的受胎率息息相關(guān)，通過對與精子功能和形態(tài)學(xué)密切相關(guān)多個(gè)指標(biāo)的客觀評價(jià)，可以提高對精液樣品受孕能力的預(yù)測能力，有效地節(jié)約繁殖成本，提高受胎率。本文主要對犬精液量、精液顏色、精子密度、精子活力、精子形態(tài)學(xué)這五個(gè)方面的檢測方法進(jìn)行簡要綜述。

一、精液量

犬的射精分為三段，富含精子的第二段精液決定了精液的授精能力，因而一般主要收集第二段精液進(jìn)行檢測分析。精液的產(chǎn)生與睪丸的體積密切相關(guān)，不同品種的犬射精量區(qū)別很大。在缺少發(fā)情母犬的誘導(dǎo)、性刺激不足、采精過程感覺到痛苦或者其他環(huán)境因素刺激時(shí)，公犬的射精量可能很少。如果對公犬的生精能力存在疑慮，應(yīng)該檢查其精液樣品的堿性磷酸酶的濃度。堿性磷酸酶的濃度低于5000IU/L表明射精不完全、附睪障礙或發(fā)育不全。精液量的檢查一般有兩種方法，體積法或重量法。體積法即在刻度集精管上讀出精液量，也可以用量筒測量。重量法是指利用電子天平稱量精液的重量，再除以密度1.01g/mL，算出精液體積。一般而言，犬三段射精精液總體積在10mL左右。

二、精液顏色

正常精液的顏色一般為乳白色或白色，精子密度越高，乳白色越濃，透明度相對而言就越低。精液呈水樣或者乳清樣，說明精子密度低；精液呈深黃色，則說明精子中可能混有尿液等雜質(zhì)；精液呈粉紅色或者淡紅色，則表示生殖道有新鮮的創(chuàng)傷；紅褐色精液表明生殖道有陳舊創(chuàng)傷；精液呈淡綠色表明精液中可能有膿液混入……總之，色澤異常的精液都不宜使用。

三、精子密度

（一）目測法

取一滴精液用壓片法鏡檢精子密度，按照精子密度范圍分為密、中、稀三級。估測法評定精子密度具有較大的主觀性，誤差也較大，但是易于一些條件簡陋的犬舍操作。

（二）計(jì)數(shù)法

用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算精子濃度的方法最為準(zhǔn)確，但是操作過程也最為復(fù)雜。具體操作方法為：用移液器準(zhǔn)確吸取50μL樣品，使用3.0%氯化鈉溶液0.95mL與其混合均勻，使之成為20倍的稀釋精液。將備好的血球計(jì)數(shù)板用血蓋片將計(jì)數(shù)室蓋好，用小吸管吸取一滴于血蓋片邊緣，使之自行流入計(jì)數(shù)室，均勻充滿，不允許有氣泡或厚度過大，然后在顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。犬精液密度一般為1～5億個(gè)/mL。通?？衫醚蚣?xì)胞計(jì)數(shù)法對其他密度檢測方法進(jìn)行矯正。

（三）光電比色計(jì)

根據(jù)精子密度越大透光性越差的特點(diǎn)，將精液透光度與標(biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比較，能迅速準(zhǔn)確地測出精子濃度。具體操作為：利用分光光度計(jì)在550nm的測定波長下，讀取已知濃度的精液OD值，從而分析出精子密度與OD值之間的線性回歸方程，再讀取待測精液的OD值即可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出精液的實(shí)際濃度?，F(xiàn)在也有許多不同品牌的犬用便攜式精子密度儀，其原理也是根據(jù)光電比色，在儀器中編寫特定的計(jì)算公式，使實(shí)驗(yàn)操作人員能夠快速測定精液密度。在實(shí)際操作過程中只需要將少量樣品加入專用的比色皿卡槽，5秒鐘即可讀取精子密度，檢測速度快，結(jié)果可靠。光電比色計(jì)的缺點(diǎn)是操作較為繁瑣，需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算精子密度與OD值之間的線性回歸方程。便攜式精子密度儀通過載入固定數(shù)學(xué)模型進(jìn)行計(jì)算，測得結(jié)果誤差范圍較大。

（四）計(jì)算機(jī)輔助分析（computer-assisted semen analysis，CASA）法

CASA最早出現(xiàn)在二十世紀(jì)九十年代，是將計(jì)算機(jī)技術(shù)和精液的圖像處理技術(shù)應(yīng)用于精子動(dòng)力學(xué)分析，對精子運(yùn)動(dòng)圖像分析，提供精子動(dòng)力學(xué)量化數(shù)據(jù)。CASA檢測系統(tǒng)通過錄像機(jī)或計(jì)算機(jī)視頻技術(shù)與顯微鏡連接組成，快速捕捉單個(gè)精子運(yùn)動(dòng)軌跡，采集精子的不同運(yùn)動(dòng)軌跡圖像并進(jìn)行快速、動(dòng)態(tài)處理分析，從而鑒定精液的質(zhì)量。因其需要對單個(gè)精子的運(yùn)動(dòng)軌跡進(jìn)行捕捉，在計(jì)算分析過程中，通過對捕捉精子數(shù)的計(jì)算，可以準(zhǔn)確獲得精子密度信息。實(shí)際操作過程中，只需要按照要求，將處理后的精液樣品加5～10μL到預(yù)熱的載玻片上，蓋上蓋玻片，按要求操作電腦軟件分析系統(tǒng)，即可獲得準(zhǔn)確的精子密度以及其他的動(dòng)力學(xué)信息。CASA檢測系統(tǒng)相對于光電比色法對精子密度的計(jì)算更為準(zhǔn)確，但是對儀器設(shè)備的要求比較高，一般適用于專門化的檢測機(jī)構(gòu)或?qū)嶒?yàn)室使用。

四、精子活力

精子活力是評價(jià)精子授精能力的重要指標(biāo)之一，也是最早發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用最廣泛的精子功能指示因子。精子對溫度極為敏感，在檢測過程中要嚴(yán)格控制精液溫度。具體操作：取約5μL精液（凍精分別直接置于37℃水浴中解凍后取樣）置于預(yù)熱后的載玻片上加蓋玻片，立即在37℃載物臺上用200倍～400倍相差顯微鏡下觀察活力，也可通過電視顯微裝置在熒光屏上觀察活力。每樣片觀察3個(gè)視野，并應(yīng)觀察不同液層的精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，進(jìn)行全面評定。原精精子活力一般在70～90%，一段時(shí)間沒有配種的種犬精子活力可能會低一點(diǎn)。精子活力檢測最常用的方法有以下幾種：

（一）目測評分法

用直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占總精子數(shù)的百分比表示，一般采用十級評分法，如精子呈直線前進(jìn)運(yùn)動(dòng)占總數(shù)90%，則為0.9級，80%即為0.8級，依次類推。原精的精液密度大，很難區(qū)分單個(gè)精子的運(yùn)動(dòng)方式，影響活力評定的準(zhǔn)確性，一般進(jìn)行精子活力評定時(shí)，要將原精進(jìn)行稀釋，稀釋后濃度約為2500萬個(gè)/mL。目測法是最簡單快捷的檢測方法，缺點(diǎn)是主觀性太強(qiáng)，對于精子受精能力預(yù)測的準(zhǔn)確性相對較低。

（二）計(jì)算機(jī)輔助分析（CASA）法

計(jì)算機(jī)輔助分析方法允許實(shí)驗(yàn)人員收集到客觀、準(zhǔn)確的活精子占精液中精子的百分比，同時(shí)可以獲得其運(yùn)動(dòng)質(zhì)量的詳細(xì)參數(shù)。CASA系統(tǒng)可以跟蹤拍攝單個(gè)精子活動(dòng)軌跡，采集精子不同運(yùn)動(dòng)軌跡圖像并進(jìn)行快速、動(dòng)態(tài)處理分析，獲得精子的常規(guī)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，包括直線速率VSL（μm/s）、曲線速率VCL（μm/s）、路徑速率VAP（μm/s）、直線性LIN（%）、前向性（%）、擺動(dòng)性（%）、側(cè)擺幅度（μm/s）、直線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)、曲線運(yùn)動(dòng)精子數(shù)等。通過對精子動(dòng)力學(xué)參數(shù)的評估，計(jì)算出前進(jìn)運(yùn)動(dòng)、非前向運(yùn)動(dòng)、不動(dòng)精子分別占全部檢測精子中的百分比，其中前進(jìn)運(yùn)動(dòng)精子百分比即為精子活力。

CASA已經(jīng)成功應(yīng)用于犬多種精液的分析，鮮精、冷藏精液、冷凍精液以及獲活精子的分析。然而，不同精液質(zhì)量分析系統(tǒng)的參數(shù)設(shè)置不同，對于精子活力的測定結(jié)果有顯著的差別，使得不同實(shí)驗(yàn)室的精子活力數(shù)據(jù)很難具備可比性，對于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析具有較大的影響。牛和人的研究表明，一些精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)與精子的授精能力密切相關(guān)，但是犬精液中這些參數(shù)與其繁殖性能的關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

（三）精子死活染色法

一般利用伊紅-苯胺黑染色判定精子死活，活精子所占精子比例即為精子活力。具體操作：使用伊紅-苯胺黑染色時(shí)，先取1滴新鮮精液，滴加1滴10g/L的伊紅，混勻，染色30秒后再滴加1滴100g/L的苯胺黑，混勻，染色30秒后推片，晾干。待玻片晾干后，對精子形態(tài)進(jìn)行鏡檢。死精子頭部染上紅色，活精子不著色。伊紅-苯胺黑也是一種廣泛使用的死活染色劑，因其操作簡單，能快速出檢測結(jié)果而得到廣泛的應(yīng)用。然而，由于染料本身有一定滲透壓，染色過程中沒有固定這一步，可能會因?yàn)闈B透壓的差異，人為地增加了異常精子百分比。

五、精子形態(tài)學(xué)檢查

精子形態(tài)學(xué)檢測主要從精子畸形率和頂體完整率這兩個(gè)方面進(jìn)行檢測。通過制作精子抹片，在100倍的油鏡下，數(shù)100～200個(gè)精子，計(jì)算其中正常和形態(tài)異常精子數(shù)量。

精子畸形率及頂體完整率常用姬姆薩進(jìn)行染色。使用姬姆薩染液進(jìn)行染色時(shí)，取一滴精液滴于載玻片的一端，用邊緣光滑的載玻片與有樣品的載玻片呈35°夾角，將樣品均勻地拖布于載玻片上，自然風(fēng)干。晾干后用甲醛溶液固定15分鐘后用清水緩緩沖去固定液，吹干或自然風(fēng)干，隨后將固定好的抹片置于姬姆薩染液中染色1.5h后用清水緩緩洗去染液，晾干鏡檢。

正常優(yōu)良種犬至少有80%以上的形態(tài)正常的活精子。當(dāng)形態(tài)正常的精子比例低于60%時(shí)，公犬的繁殖力將會受到顯著影響。熱應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、中暑以及生殖道感染、促黃體素的減少、睪酮的分泌都會引起精子形態(tài)學(xué)的異常。健康的犬換到一個(gè)新環(huán)境也會短時(shí)間出現(xiàn)精子畸形率升高，可能是內(nèi)源性腎上腺皮質(zhì)素的分泌引起的。要注意的是，凍精的染色需提前去除精液稀釋液，因凍精稀釋液中的甘油、卵黃會與大部分固定液發(fā)生作用，從而影響精子的染色效果。

六、其他檢測技術(shù)

精子在獲得受精能力前會發(fā)生一系列的生理生化、分子和代謝的變化，除了以上幾項(xiàng)檢測技術(shù)，還可以利用生物化學(xué)手段、分子生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)行檢測，包括精液pH測定、精子耗氧量測定、精液的細(xì)菌學(xué)檢查以及利用熒光染色對精子線粒體功能、頂體完整性、精子獲能狀態(tài)、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、精子核染色質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析。這些檢測技術(shù)有助于對精子生物學(xué)以及精子低溫?fù)p傷進(jìn)行更深入地了解，在其他動(dòng)物的精子結(jié)構(gòu)和功能上的研究較多，對犬精子授精能力的重要性還需要進(jìn)一步研究確定。

七、小結(jié)

鮮精或凍精的評價(jià)要點(diǎn)有所不同。鮮精更多地反映了公犬睪丸及副性腺的功能，凍精精液品質(zhì)則更多地體現(xiàn)了在低溫處理過程中引起的細(xì)胞損傷。精液在低溫保存過程中會誘導(dǎo)產(chǎn)生精液滲透壓、化學(xué)和機(jī)械壓力的變化，導(dǎo)致一些精子的嚴(yán)重?fù)p傷甚至死亡，使得解凍后精液的存活時(shí)間和授精能力大大受限。通過對解凍后精液品質(zhì)進(jìn)行評估能夠?qū)ο♂屢?、降溫過程等實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行客觀準(zhǔn)確的評價(jià)，有利于犬精液低溫保存技術(shù)的成熟。我國犬的遺傳育種起步較晚，發(fā)展相對滯后，建立一套可操作性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)化精液質(zhì)量檢測技術(shù)將極大地促進(jìn)我國養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展。

（作者單位：公安部南昌警犬基地，330100）

（編輯：李 冰）

項(xiàng)目來源：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“犬貓生殖調(diào)控技術(shù)研究及產(chǎn)品研發(fā)”，項(xiàng)目編號2016YFD0501008