摘要： 該研究從甘蔗細莖野生種（割手密Saccharum spontaneum）中克隆抗旱相關的基因ScALDH，并分析其在干旱處理條件下的表達情況和序列特征。利用RTPCR 技術克隆甘蔗的ALDH基因片段， 并對其核苷酸和氨基酸序列進行分析。使用NCBI Blastx、ORF finder、Mega、NCBI Conserved Domain Search 等程序對其分別進行不同物種氨基酸比較、開放閱讀框（ORF）尋找、進化樹及保守序列分析，并用 Real TimePCR分析所克隆基因在干旱脅迫前后的表達差異。結果表明：克隆出甘蔗的ALDH基因片段， 總長度為 1 996 bp，其中蛋白質編碼區(qū)（CDS）全長1 524 bp，編碼508個氨基酸；與其它物種ALDH類蛋白氨基酸序列有很高的同源性，有ALDH家族的保守序列，并含有完整的開放閱讀框，系統(tǒng)進化樹分析顯示與玉米的蛋白質親緣關系最近；Real timePCR數(shù)據(jù)表明，在干旱脅迫下，隨著干旱時間的延長，該基因的表達量呈持續(xù)積累的表達模式?？傮w上來說，該基因對干旱脅迫顯著表達。利用RTPCR 技術克隆的甘蔗ALDH基因，屬于ALDH蛋白家族的一員，具有其典型的功能域，該基因在干旱脅迫過程中參與抗旱作用。該研究結果為野生種資源開發(fā)、優(yōu)良抗旱親本選擇和培育抗旱性強甘蔗品種提供了參考依據(jù)。

關鍵詞： 割手密， 基因克隆， 序列分析， 干旱脅迫， real timePCR

中圖分類號： Q943

文獻標識碼： A

文章編號： 10003142（2017）03038008

Abstract： We cloned a drought resistant ALDH gene with RTPCR gene from Saccharum spontaneum， detected the gene expression level under different drought conditions， and analyzed the nucleotide and amino acid sequences with Blastx， Conserved Domain Search， ORF finder and MEGA. We compared the amino acids among different species， and tried to find reading frames in the sequence， to search conserved Domain and to make evolutionary tree. We analyzed the gene expression level of the cloned gene in drought stress with real timePCR. The total length of the ALDH gene fragment cloned was 1 996 bp， including 1 524 bp coding sequence， which was encoded 508 amino acids. The cloned sequence had a very high homology with other species’ amino acid sequences and had the conserved sequences of ALDH family， a complete open reading frame as well. Phylogenetic tree analysis showed that protein had the closest relationship with corn. The real timePCR data showed that the expression of the gene was expressed in a continuous accumulation mode. On the whole， the gene responds to drought stress. The cloned gene belong to the ALDH protein family， which has its typical function domain. The expression pattern analysis showed that the gene was involved in the process of drought stress. The results of this study aimed at developing the excellent resources of wild species， as well as to explore the drought resistance of these resources. The study provides the basis for the selection of the parents of the fine and drought resistance in the future.

Key words： Saccharum spontaneum， gene cloning， sequence analysis， drought stress， real TimePCR

甘蔗 （Saccharum officinarum）是甘蔗屬、多年生高大實心草本植物，是熱帶和亞熱帶農(nóng)作物，是制造蔗糖的原料，也是國計民生必需品（張華和陳如凱，2003）。除制糖外，其副產(chǎn)品的利用范圍非常廣泛，如生產(chǎn)纖維板和飼料（黃東杰和孫繼華，2012）。此外，一些國家還把甘蔗作為一種高產(chǎn)的生物能源作物，用全莖制造酒精代替部分化石燃料（趙麗萍等，2010）。發(fā)展甘蔗生產(chǎn)，對提高人民生活、促進農(nóng)業(yè)及相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展都具有重要作用。

目前，干旱對作物生產(chǎn)有普遍影響，其所造成的產(chǎn)量損失超過其它各種脅迫因素造成的總和（閆志利和牛俊義，2009）。輕度水分脅迫時甘蔗葉片光合速率有所下降，到中度干旱、嚴重干旱時葉片光合速率呈顯著性下降，葉肉細胞光合能力降低，甘蔗的生理性狀受到較嚴重影響（羅明珠和梁計南，2005）。此外，甘蔗在伸長期的中后期受到干旱脅迫時，蔗莖的生長速度明顯降低，植株變矮，單莖重明顯降低（陸國盈和韓世健，2002）。我國蔗區(qū)85%以上分布在無灌溉條件的旱坡地，甘蔗品種的抗旱性很大程度上決定著甘蔗生產(chǎn)的效益（李奇?zhèn)ズ袜嚭ＨA，2011）。甘蔗傳統(tǒng)育種方法主要是利用栽培種/品種與野生種（如割手密）雜交，野生種的抗逆性（抗旱、耐寒）較強，是提高甘蔗品種抗逆性的重要基因源。

醛脫氫酶基因（Aldehyde dehydrogenase， ALDH）是一類編碼將醛脫氫氧化為相應羧酸的基因，可有效減少醛類物質在細胞內(nèi)的積累，增加細胞的抗逆性，減少干旱脅迫對植物的產(chǎn)生的影響。目前在植物中發(fā)現(xiàn)的ALDH蛋白是一個大家族，包括14個家族：ALDH2、ALDH3、ALDH5、ALDH6、ALDH7、ALDH10、ALDH11、ALDH12、ALDH18、ALDH19、ALDH21、ALDH22、ALDH23、ALDH24，其中ALDH11、ALDH19、ALDH22、ALDH23和ALDH24為植物所特有（Zhang et al，2012； Wood Duff.， 2009）。相對于人類、動物，植物的乙醛脫氫酶研究來說較少，從植物中克隆到的乙醛脫氫酶家族的基因不是很多。李新玲等（2007）從羊草中克隆出一個乙醛脫氫酶基因，與從水稻中克隆的ALDH1a家族基因的同源性最高，該基因對鹽、冷凍、干旱均有響應。 楊紅蘭等（2010）成功從齒肋赤蘚克隆了ALDH21家族的基因，其研究得出，該基因在干旱脅迫狀態(tài)時的表達量顯著高于水合狀態(tài)，可能參與干旱脅迫應答。沈一等（2013）從花生中挖掘出一個ALDH7基因，發(fā)現(xiàn)該基因在鹽脅迫下，根、葉中的表達量明顯上升。到目前為止，尚未見在甘蔗野生種印度割手密中克隆出ALDH家族基因的報道。本研究以甘蔗野生種——印度割手密（2n=64）為材料，克隆到一個ALDH家族基因，通過生物信息學分析和定量 PCR技術檢測在干旱脅迫前后基因的誘導情況，旨在開發(fā)野生種的優(yōu)良資源，以及探索這些資源的抗旱性，為今后利用優(yōu)良抗旱親本的選擇和培育抗旱性強的甘蔗品種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 植物材料及干旱處理

植物材料：印度割手密（2n=64），取材自云南省農(nóng)科院甘蔗所（開遠）的國家甘蔗資源圃。

干旱處理：供試植物材料種植于云南農(nóng)業(yè)大學溫室大棚中，花盆大小在直徑 50 cm，高 30 cm的花盆中，分為四組，對照組，正常澆水，保持濕潤；實驗組，待苗長到15～20 cm高時，分別干旱處理2、4、6 d后取葉片提取總RNA。

1.2 試劑

TRNzol A+總RNA提取試劑、FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA純化回收試劑盒、pLB Vector、T4 DNA Ligase、DNA高保真酶、dNTP、TOP10感受態(tài)細胞、熒光定量試劑盒SuperReal PreMix Pius ，均購自天根生化試劑有限公司。引物合成由Introvigen 公司合成，測序由擎科生物公司完成。

1.3 總 RNA 提取 與cDNA合成

等到甘蔗在溫室生長至15～20 cm，剪取葉片，迅速放在液氮中，備用。利用Tigen Trizol試劑盒，提取葉片總RNA（-80 ℃保存）。 用紫外分光光度計檢測 RNA 濃度，用瓊脂糖電泳檢測 RNA 完整性。后采用Fast Quant RT Super Mix （Tiangen，KR108）試劑盒反轉錄獲得 cDNA 第一鏈。

1.4 ScALDH全長的克隆

使用天根公司FastQuant RT Super Mix （Tiangen， KR108）快速反轉錄形成cDNA ，放入-80 ℃超低溫冰箱備用。利用高保真酶進行PCR擴增。以甘蔗割手密材料cDNA 產(chǎn)物為模板，克隆ScALDH基因。參考本實驗室的轉錄組信息，設計基因特異引物引物序列（表1）。

使用Tigen公司的高保真pfu酶進行擴增ScALDH目的基因。 PCR 儀使用 ABI 公司 Veriti 96 孔梯度。PCR反應體系：Template 1 μL；Primer F 1 μL；Primer R 1 μL；Buffer 2 μL；dNTP 2 μL；Pfu酶 0.5 μL；ddH2O 13.5 μL，補足到20 μL；總體積為20 μL。PCR 儀反應程序：96 ℃預變性2 min；96 ℃變性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 4 min；72 ℃， 10 min，后4 ℃保存。

1.5 PCR產(chǎn)物的克隆純化與篩選

對PCR 產(chǎn)物的目的大小片段使用Tigen的回收試劑盒，切膠、回收、純化。采用平末端連接方法，配制反應體系。連接到pLB vector克隆載體上，后導入大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細胞，進行 Amp抗性篩選，培養(yǎng)16 h后，對菌落進行檢測，采用快速檢測方法，做菌落 PCR，擴增程序：95 ℃預變性 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 4 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。測序服務有北京擎科生物公司提供，2次重復。

1.6 ScALDH基因的 Real timePCR 分析

根據(jù)ALDH基因序列，用實時熒光定量PCR軟件Beacon Designer 7.0，設計實時熒光定量引物QF、QR，內(nèi)參基因選擇βactin（肌動蛋白），引物為ACTINF、ACTINR；特異性引物序列見表2。

使用儀器 ABI 公司 7500 熒光量 PCR 儀，對干旱處理前后的基因表達情況進行分析。采用SYBR Green I 嵌合熒光法進行、Real Time PCR 的專用試劑。反應體系（20 μL體系）：2×SuperReal PreMix Pius 10 μL；正向引物（10 μmol·L1） 0.6 μL；反向引物（10 μmol·L1） 0.6 μL；cDNA模板1 μL；50×ROX Reference Dye 0.4 μL；加RNasefree ddH2O 7.4 μL，補足到20 μL。采用三步法PCR擴增反應，反應程序如下。預變性：95 ℃，15 min。PCR反應：95 ℃變性 ，10 sec；50 ℃退火，20 sec；72 ℃延伸，32 sec；40個循環(huán)。同時在 60～95 ℃進行融解曲線分析。利用2ΔΔCT法計算基因的相對表達量。每個樣品進行4次重復，取其平均值。

1.7 ALDH序列分析

對ALDH核苷酸和氨基酸序列進行分析，使用NCBI Blastx、ORF finder、Mega、NCBI Conserved Dom ain Search 等程序對其進行氨基酸序列相似性分析、開放閱讀框（ORF）、進化樹、及結構域分析與功能結構域查找。采用ProtParam計算蛋白質的相對分子量和理論等電點。用Clustal X進行氨基酸序列比對與相似序列分析。

2結果與分析

2.1 RNA的檢測結果

利用trizol 抽提試劑盒提取的甘蔗總RNA如圖1。并利用紫外分光光度計檢測，RNA 樣品的OD260/280均在1.9～2.1之間，純度較高可以用于后續(xù)的實驗。

2.3 ALDH的序列分析

將獲得的測序結果在NCBI上進行ORF的尋找和Blastx分析。尋找結果共獲得14個大小不一的ORF，其中最長的一個ORF和其他物種的ALDH基因核苷酸序列長度相似，可判斷該位點就是ALDH基因的ORF。該ORF有一個起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，編碼508個氨基酸，5′端非編碼區(qū)長171 bp，3′端非編碼區(qū)長298 bp，CDS全長1 524 bp（圖3）。

利用ProtParam 軟件分析表明，該基因編碼蛋白質的分子式為（Formula）C2414H3847N657O710S25 ，分子量為54 235.5 kD，理論等電點 pI為6.22。負電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為 45，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為42，親水性平均系數(shù)（instability index II）為 34.22，是一類穩(wěn)定的蛋白。 通過Blastx分析，分析結果發(fā)現(xiàn)與其它物種的ALDH基因所編碼的氨基酸序列，具有較高的同源性。推導該基因編碼的氨基酸序列（g：甘蔗），與玉米（y：玉米，gi|226531366|）、小麥（x：小麥，gi|814937256|）、擬山羊草（n：擬山羊草，gi|814937260|）、多年生黑麥草（h：黑麥草，gi|769748345|）、可可（k：可可，gi|769748345|）、野生大豆（d：野生大豆，gi|226531366|）、蘋果（p：蘋果，gi|658309736|）ALDH一致性分別為98%、92%、91%、91%、82%、82%、80%。序列對比如圖4。用MEGA5.0做系統(tǒng)進化樹（圖5）結果顯示，8個物種的ALDH基因被聚為兩大類群：I類有小麥、擬山羊草、黑麥草。II類有可可、野生大豆、蘋果。從圖中發(fā)現(xiàn)ScALDH與玉米的ALDH7A1編碼的蛋白質親緣關系最近，而且9個物種的蛋白氨基酸同源性均很高，因此該蛋白應屬于醛脫氫酶ALDH家族蛋白，而且ALDH是一類非常保守的基因家族。使用NCBI在線軟件對ScALDH蛋白的保守區(qū)進行預測，預測結果表明，在保守結構域上，目標序列和其他物種都存在 NAD+結合位點，TAFN、KGAP、FTGSTRAGLM和LEL。以及特有的4個特有的催化殘基N、E、G、C分別位于165、266 、297、299位點上。將暫該序列命名為ScALDH，提交 GenBank，GeneBank登錄號ku517650。

2.4 干旱脅迫下ALDH基因的表達分析

為揭示ALDH基因在干旱脅迫過程中其表達量的變化，以不同時間處理的cDNA材料為模板，進行分析，用甘蔗的看家基因ACTIN為內(nèi)參。取如下處理材料：WET組正常澆水、DRY2組干旱處理2 d、DRY4組干旱處理4 d、DRY6組干旱處理6 d，反轉錄成cDNA用于實時熒光定量PCR實驗。結果如圖6，從圖中可以看出，ALDH在葉片中的表達量存在明顯差異。干旱處理兩天的材料（DRY2），其ALDH基因的相對表達量明顯高于對照組（WET），是對照組的17.67倍。干旱處理4 d的材料（DRY4），又高于DRY2處理的， 是DRY2的2.08倍。而DRY6的表達量又是DRY4的1.4倍。由此可見，隨著干旱脅迫時間的延長，ALDH基因的表達量在逐漸升高，處理6 d后的材料的表達量，竟然是對照組的51.79倍。該基因在干旱脅迫下，呈明顯上調趨勢。

3討論與結論

隨著測序技術的不斷發(fā)展，RNASeq高通量測序技術應用在了轉錄組領域中，高通量測序技術能夠全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉錄本，反映出它們的表達水平。特別是用于挖掘和篩選抗病、抗逆、農(nóng)藝性狀、代謝途徑相關的基因研究，它可以初步識別未知基因。但是該方法的不足之處就是，挖掘和篩選的相關基因仍需要在實驗中驗證。本研究通過轉錄組測序結果，所獲得的甘蔗野生種割手密ALDH基因片段，屬于醛脫氫酶基因家族，具有乙醛脫氫酶特異的保守序列。經(jīng)NCBI Blastx比對和做進化樹分析之后，其與玉米的ALDH7A1編碼的蛋白質親緣關系最近，相似度達到了98%，與小麥、擬山羊草、多年生黑麥草、可可、木本棉、野生大豆、蘋果ALDH一致性分別為92%、91%、91%、82%、82%、82%、80%。ScALDH其與已知的ALDH家族有極高的同源性，含有NAD+的結合位點，又有ALDH家族保守序列，可確認為其ALDH家族，暫命名為ScALDH。ALDH是一類非常保守的基因家族。

實時熒光定量PCR結果發(fā)現(xiàn)，該基因在割手密中表現(xiàn)出持續(xù)積累的表達模式，即隨著干旱脅迫時間的延長，其表達量增加。表明ScALDH基因的表達在割手密抗逆境過程中可能起著重要的作用。擬南芥、煙草、中過量表達的大豆ALDH7能提高轉基因植株的抗氧化脅迫能力（Rodrigues et al ，2006）。ALDH基因導入并整合到番茄的基因組中，在干旱、高鹽和低溫脅迫條件下，轉ALDH基因番茄對環(huán)境脅迫造成的傷害表現(xiàn)出較強的抗性，即ALDH基因具有提高植物抗氧化脅迫的功能（張海玲等，2010）。An et al（2014）發(fā)現(xiàn)玉米的根部的ALDH7在多重環(huán)境脅迫下，起著排除醛類物質的作用。另外，ALDH7的主要功能可能是參與調控脅迫反應和組織膨脹壓力，或參與清除引起脂質過氧化反應的醛類物質（Kirch et al ，2004）。植物ALDH7 家族基因的表達受到干旱和高鹽等非生物逆境脅迫誘導（Kotchoni et al ，2006）。ALDH7a1還可通過產(chǎn)生滲透調節(jié)物質如甜菜堿和氧化脂質過氧化產(chǎn)物保護細胞免于損傷（Brocker et al，2011）。但可以確認的是ALDH家族與抗性有非常密切的關系。

從本研究結果可以得出，割手密ScALDH蛋白基因其表達量與干旱脅迫的時間呈正相關。這與陳加敏和朱承慧（2013）、Kirch et al（2001）、Sunkar et al（2003）得出了相似的結論。植物在受到干旱等逆境脅迫時，體內(nèi)的ALDH7基因持續(xù)積累地表達，表明ALDH7蛋白家族基因參與干旱脅迫應答，在抗逆中擔任著重要角色。ALDH蛋白家族基因能夠提高植物的抗逆性，是較理想的抗逆基因工程候選基因。

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