邵光明，譚紅月，王玉鳳

（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079）

飼料中添加維生素A、C和E對克氏原螯蝦生長和免疫力的影響

邵光明，譚紅月，王玉鳳

（華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遺傳調(diào)控與整合生物學(xué)湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430079）

維生素在甲殼動物的存活、生長、繁殖過程中起重要作用。本研究采用正交設(shè)計實驗，研究了維生素A、維生素C和維生素E的添加量對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）幼蝦生存、生長和免疫的影響。研究設(shè)立三個因子A、B、C，分別為維生素A、維生素C、維生素E的添加量。每個因子設(shè)3個水平，維生素A添加量的3個水平為：0.0048、0.0054、0.006%；維生素C添加量的3個水平為：0.02、0.05、0.08%；維生素E添加量的3個水平為：0.02、0.04、0.06%。極差分析結(jié)果表明，克氏原螯蝦幼蝦成活率最高時的因子水平組合為：A3B1/B3C2；增重率最大時的因子水平組合為：A3B2C2；丙二醛（MDA）含量、超氧化物氣化酶（SOD）活性和SOD基因表達(dá)水平最低時的因子組合水平都為：A2B1C1；酚氧化酶（PO）活性最高時的因子水平組合為：A3B2C1；谷胱甘肽過氧化物酶基因GPx表達(dá)水平最低時的因子水平組合為：A3B1C1。將克氏原螯蝦幼蝦的成活率和增重率作為主要考慮因素，綜合考慮免疫指標(biāo)及成本因素，我們建議在本次實驗設(shè)計的條件中，選擇A3B1C2作為最佳組合方案，即維生素A添加量為0.006%、維生素C添加量為0.02%、維生素E添加量為0.04%時，最有利于克氏原螯蝦幼蝦的存活、生長，提高其免疫力。

克氏原螯蝦；維生素；存活；生長；免疫

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱淡水小龍蝦，隸屬于甲殼綱、十足目、蝲蛄科、原螯蝦屬，是我國一種重要的淡水經(jīng)濟(jì)蝦類。由于克氏原螯蝦肉味鮮美，營養(yǎng)豐富[1]，越來越受到消費者的喜愛，市場價值不斷攀升，僅湖北省每年產(chǎn)值就超50億元。研究組前期對克氏原螯蝦的開口餌料進(jìn)行過研究[2]，然而有關(guān)飼料中添加多種維生素對幼蝦影響的研究還未見報道，該研究的目的是通過研究維生素A、C、E添加量對克氏原螯蝦幼蝦存活、生長、免疫力的影響，為克氏原螯蝦幼蝦的配合飼料研制提供理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 實驗蝦

實驗用克氏原螯蝦幼蝦為在華中師范大學(xué)克氏原螯蝦研究基地飼養(yǎng)孵化出來的蝦。隨機(jī)選取2月齡大的克氏原螯蝦，平均體質(zhì)量（0.518±0.009）g，體形相近，肢體健全，健康活潑。

1.2 實驗方法

1.2.1 飼料配制和幼蝦喂養(yǎng)將三個因子（維生素A、C、E添加量）各設(shè)3個水平，維生素A（VA，因子A）的3個水平分別為：0.0048%、0.0054%和0.0060%；維生素C（VC，因子B）的3個水平分別為：0.02%、0.05%和0.08%；維生素E（VE，因子C）的3個水平分別為：0.02%、0.04%和0.06%。根據(jù)正交設(shè)計L18（37）表設(shè)計了18種組合（表1），空列用于估算實驗誤差。實驗結(jié)果進(jìn)行極差（直觀）分析，極差值為正交設(shè)計中每個因子3個水平中的最大平均值和最小平均值之差（kmax-kmin）[3-4]。

表1 正交設(shè)計L18（37）的因子水平表

將各因子按照各水平分別添加到基礎(chǔ)飼料中，安排了18種飼料配方，具體配方見表2，糊精用來補平差額部分。飼料混合均勻后，用壓面機(jī)壓制成長條，再切成2 mm左右長的顆粒，于烘箱內(nèi)60℃烘干8 h，然后密封貯存在4℃冰箱內(nèi)備用。飼料在實驗用水中3 h內(nèi)不散。將實驗蝦分為18組，每組25只。實驗時每日喂食兩次，分別為8：00—9：00，17：00—18：00，喂食量以第二次喂食時略有剩余為準(zhǔn)。每日吸去水族箱內(nèi)殘餌與排泄物，并換水。充氧泵持續(xù)充氧，水溫19℃左右。50 d后測定生長指標(biāo)（成活率、增重率）、免疫相關(guān)指標(biāo)及免疫相關(guān)基因的表達(dá)量。

其中，各組相同的飼料成分為：小麥粉，15%；玉米粉，15%；魚粉，20%；黃豆粉，40%；魚油，2%；礦物質(zhì)，1.5%。礦物質(zhì)的組成（質(zhì)量百分比）如下：KCl，2.8%；NaH2PO4，10%；KH2PO4，21.5%；Ca（H2PO4）2· 2H2O，26.5%；CaCO3，10.5%；Ca-lac，16.5%；MgSO4· 7H2O，10%；CoCl2·6H2O，0.176%；CuCl2，0.051%；KI，0.058%；MnSO4·4H2O，0.143%；檸檬酸鐵，0.061%；ZnSO4·7H2O，0.511%；AlCl·6H2O，1.2%。

表2 飼料配方%干重

1.2.2 生長指標(biāo)的測定實驗結(jié)束時，用電子天平測量克氏原螯蝦幼蝦的體質(zhì)量（精確到0.001 g）?？耸显r幼蝦的成活率、增重率按公式計算：

存活率（%）=100×（實驗結(jié)束時幼蝦的數(shù)量/實驗開始前幼蝦的數(shù)量）；

增重率（%）=100×（實驗結(jié)束時幼蝦體質(zhì)量－實驗開始前幼蝦體質(zhì)量）/實驗開始前幼蝦體質(zhì)量。

產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)抑制植物病原菌生長是植物內(nèi)生菌作為生防菌的重要作用機(jī)理之一[11,12]。內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)種類繁多[13]，有抗菌肽、脂肽、生物堿、酚類、醌類、萜類、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和揮發(fā)性物質(zhì)等[14～16]。其中，脂肽、幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等主要由內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)生；生物堿類、肽類、甾體類、萜類、酚類、醌類、脂肪族類、異香豆素類的抗菌物質(zhì)主要由內(nèi)生真菌產(chǎn)生；內(nèi)生放線菌則主要產(chǎn)生抗生素類。

1.2.3 免疫相關(guān)指標(biāo)的測定實驗結(jié)束后，取蝦肝胰腺和鰓放入400 μL的雙蒸水中，冰上勻漿，4℃8，000 g離心15 min，取上清，放入-80℃冰箱中備用。

蛋白濃度的測定參照南京建成試劑盒說明書，先測定各樣品的蛋白濃度、然后根據(jù)其濃度加水稀釋，使不同樣品的濃度大致一致，且濃度在試劑盒說明書中規(guī)定的范圍，最后再測各樣品的蛋白濃度。丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定參照南京建成試劑盒說明書。酚氧化酶（PO）活性測定方法見參考文獻(xiàn)[5]。

1.2.4 免疫相關(guān)基因表達(dá)量的測定RNA提取和基因表達(dá)分析參考本研究組前期的方法[6]。簡而言之，用Trizol RNA提取試劑盒（invitrogen公司）提取果蠅肝胰腺的總RNA。在測定RNA濃度后，取約5 μg RNA，用Oligo（dT）引物（TaKaRa）及逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（Invitrogen公司）合成cDNA第一鏈。用BIO-RAD熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)體系包括：SYBR Green II Dye（2×）（TaKaRa）10 μL，cDNA模板2 μL，1 μM上下游引物（引物序列見表3），加dd H2O補至20 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)熱2 min，再經(jīng)過40個循環(huán)，每個循環(huán)過程為95℃5 s，58℃20 s，72℃10 s。反應(yīng)結(jié)束后，讀取Ct值。利用熒光曲線值和Ct值就可以計算目的基因SOD和GPx基因的相對表達(dá)量，以actin基因為內(nèi)參?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量用2-△Ct表示，其中△Ct=（Ct目的基因Ct內(nèi)參）。每種樣品做3個生物學(xué)重復(fù)。

表3 實驗所用引物

2 結(jié)果

2.1 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦成活率和增重率的影響

不同維生素添加量組合下，克氏原螯蝦幼蝦的成活率不同。根據(jù)表4的極差分析可以發(fā)現(xiàn)，在實驗所設(shè)計的三個因子中，C因子（維生素E的添加量）的極差值（12.7）最大，說明其對克氏原螯蝦幼蝦的成活率的影響最大，其次是B因子（維生素C添加量），而A因子（維生素A添加量）的極差值（4）最小，且小于空列的極差值（5.4），說明其對克氏原螯蝦幼蝦的成活率沒有實質(zhì)性的影響。由表4分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A3B1/B3C2時成活率最高，但由于A因子對克氏原螯蝦幼蝦的成活率沒有實質(zhì)性影響，B因子在水平1和3條件下的成活率相同，考慮到成本因素，A因子和B因子都可選水平1，即：要想獲得最高成活率，可選A1B1C2作為最優(yōu)組合方案，即A因子的水平1、B因子的水平1、C因子的水平2，也就是維生素A添加量為0.0048%、維生素C添加量為0.02%、維生素E添加量為0.04%。

克氏原螯蝦幼蝦增重率的極差分析結(jié)果見表4。由表4可知，C因子（維生素E的添加量）的極差最大，說明其對克氏原螯蝦幼蝦的增重率的影響最大，其次是A因子，而B因子的極差值（5.6）小于空列的極差值（11.8），說明其對克氏原螯蝦幼蝦增重率的影響沒有重要影響。由表4分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A3B2C2時增重率最高。但由于B因子對克氏原螯蝦增重率的影響沒有達(dá)到顯著水平，考慮到成本因素，B因子可選水平1，即可選擇A3B1C2作為最優(yōu)組合方案，即A因子的水平3，B因子的水平1，C因子的水平2，也就是維生素A添加量為0.0060%，維生素C添加量為0.02%，維生素E添加量為0.04%。

表4 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦成活率及增重率影響的極差分析

2.2 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦MDA含量、SOD活性和PO活性的影響

丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最主要的產(chǎn)物之一，其在體內(nèi)過多積累會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害，因此其在體內(nèi)含量越低，說明機(jī)體免疫力越高，清除這些毒害物質(zhì)的能力越強。由表5可知，三個因子都對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中MDA含量有實質(zhì)性影響，其中B因子影響最大，A因子影響最小。由表5分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A2B1C1時（維生素A添加量為0.0054%，維生素C添加量為0.02%，維生素E添加量為0.02%），克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中MDA含量最低。

表5 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦MDA含量、SOD活性、PO活性影響的極差分析

超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能夠清除體內(nèi)自由基，對抗與阻斷氧自由基對細(xì)胞造成的損害?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，在蝦、蟹等甲殼動物中，飼料中添加適當(dāng)?shù)木S生素提高了機(jī)體的抗氧化能力，使得機(jī)體內(nèi)過氧化產(chǎn)物較少，而較低水平的過氧化產(chǎn)物（如MDA）不能刺激SOD活性，所以免疫力增高時會出現(xiàn)MDA含量和SOD活性都比較低的現(xiàn)象[7-8]。試驗中不同維生素添加量組合下，克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性也不同。克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性的極差分析結(jié)果見表5。由表5可知，三個因子對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性影響大小的順序為：B＞A＞C，其中只有B因子對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性有實質(zhì)性影響，而A因子和C因子對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性的影響都不重要。由表5分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A2B1C1時，克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性最低。但由于A因子對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD活性的影響不顯著，考慮到成本因素，可以選A1B1C1作為最優(yōu)組合方案，即維生素A添加量為0.0048%，維生素C添加量為0.02%，維生素E添加量為0.02%。

酚氧化酶（PO）是在氧分子存在下，能把酚類氧化成醌的酶，進(jìn)而形成黑色素，在機(jī)體免疫過程中起重要作用。已有研究表明，克氏原螯蝦肝胰腺中PO活性較低，而鰓組織中PO活性較強[9]，所以本實驗測定了不同維生素添加量對克氏原螯蝦幼蝦鰓中PO活性的影響。由表5可知，三個因子對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中PO活性影響大小的順序為：C＞A＞B，其中只有C因子對克氏原螯蝦幼蝦鰓中PO活性有重要的影響，而A、B因子都沒有實質(zhì)性的影響。由表5分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A3B2C1時，克氏原螯蝦幼蝦鰓中PO活性最高。但由于A、B因子的影響都未達(dá)到顯著水平，考慮成本因素，可以選擇A1B1C1作為最優(yōu)組合方案，即維生素A添加量為0.0048%，維生素C添加量為0.02%，維生素E添加量為0.02%。

2.3 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦SOD和GPx基因表達(dá)的影響

SOD基因編碼超氧化物歧化酶，如前所述這是清除自由基的主要酶，負(fù)責(zé)抵抗氧化脅迫。由表6可知，三個因子都對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD基因相對表達(dá)量有實質(zhì)性影響，其中B因子影響最大，A因子影響最小。如上所述，甲殼動物的免疫力提高時，會出現(xiàn)MDA含量和SOD活性都很低的現(xiàn)象[7，18]。因此，我們選擇最低的SOD基因表達(dá)水平作為最佳條件。由表6分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A2B1C1時，即維生素A添加量為0.0054%、維生素C添加量為0.02%、維生素E添加量為0.02%時，克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中SOD基因的表達(dá)水平最低。

GPx基因編碼谷胱甘肽過氧化物酶（GPx），這是包括甲殼動物在內(nèi)的許多生物抗氧化系統(tǒng)中的一個關(guān)鍵酶。本課題組前期的工作表明，GPx在克氏原螯蝦的免疫過程中起重要作用[6]。因此，為探討維生素添加量對克氏原螯蝦幼蝦的免疫力的影響，我們測定了各實驗組克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中GPx基因的表達(dá)水平。由表6可知，三個因子都對克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中GPx基因相對表達(dá)量有實質(zhì)性影響，其中C因子影響最大，B因子影響最小。由于GPx也參與抗氧化過程，而在甲殼動物中，當(dāng)免疫力提高時，低水平的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物（如MDA）不能刺激抗氧化劑的生產(chǎn)，因此我們認(rèn)為幼蝦的免疫力強時，GPx表達(dá)水平低。由表6分析可以發(fā)現(xiàn)，因子水平組合為A3B1C1時，即維生素A添加量為0.006%、維生素C添加量為0.02%、維生素E添加量為0.02%時，克氏原螯蝦幼蝦肝胰腺中GPx基因的表達(dá)水平最低。

表6 維生素A、C、E的添加量對克氏原螯蝦幼蝦SOD和GPx基因表達(dá)水平影響的極差分析

3 討論

研究中發(fā)現(xiàn)，在所設(shè)計的三個因子中，維生素E添加量對克氏原螯蝦幼蝦的成活、生長和免疫的影響最大。在成活率和增重率這兩個指標(biāo)中，維生素E是最重要的影響因子。維生素E對MDA含量、PO活性以及SOD和GPx基因表達(dá)水平也有實質(zhì)性的影響。這與其他水生經(jīng)濟(jì)動物的研究結(jié)果一致[10-11]。然而，我們的研究也顯示，在飼料中添加過多的維生素E可能會對生長和免疫產(chǎn)生負(fù)面影響，維生素E添加水平較低（0.02%～0.04%）時，克氏原螯蝦幼蝦的成活率、增重率和免疫力較高。對其他水生動物的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。羅文等[12]的研究表明，過量的維生素E對紅鰲螯蝦Cherax quadricarinatus的繁殖會產(chǎn)生不利影響，合適的維生素E添加量為192 mg/kg，投喂這種飼料能夠得到最大的產(chǎn)卵率、增重率、平均產(chǎn)卵數(shù)和孵化率[[13]。表明飼料中添加過多的維生素E對甲殼動物的免疫也有負(fù)面影響。

我們的研究還表明，維生素C在克氏原螯蝦幼蝦的成活和免疫中發(fā)揮了重要作用。特別說明的是，在該研究中使用的所有免疫相關(guān)指標(biāo)中，除PO活性外，都與維生素C的添加量有實質(zhì)性的關(guān)聯(lián)，這進(jìn)一步說明，維生素C在動物免疫過程中起重要作用。對羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）來說，與未添加維生素C的飼料組相比，投喂添加了維生素C的飼料組的蝦增重率顯著升高[14]。研究組前期對克氏原螯蝦成體雌蝦的研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加適量的維生素C使得蝦體內(nèi)的MDA含量大大減少，尤其在卵巢中更加明顯[7]，這可能是維生素C能夠促進(jìn)繁殖的原因。然而本研究也顯示，添加過量的維生素C對克氏原螯蝦幼蝦的存活、生長和免疫都產(chǎn)生了不利的影響，類似的結(jié)果在其他甲殼動物中也有報道[15-16]。研究表明，在維生素C添加量的3個水平中，水平1（0.02%）是克氏原螯蝦幼蝦成活和免疫的最佳條件。同時這一結(jié)果也表明，在免疫力最佳的條件下，成活率也最高。

在實驗設(shè)計的三個因子中，維生素A添加量對克氏原螯蝦幼蝦的存活、生長和免疫的影響相對較小，但對增重率、MDA含量、以及SOD和GPx基因的表達(dá)水平有實質(zhì)性的影響。當(dāng)飼料中維生素A添加量為水平3（0.006%）時，增重率最大，GPx基因的表達(dá)水平最低，而飼料中維生素A添加量為水平2（0.0054%）時，MDA含量和SOD基因表達(dá)水平最低。這些結(jié)果表明，飼料中添加一定量的維生素A可以促進(jìn)生長，降低MDA含量和SOD、GPx基因的表達(dá)水平，增強免疫力。需要注意的是，不同發(fā)育階段的生物對維生素A的需求量不同，幼體階段可能比成體階段需要更多的維生素A，因此研究和配制飼料時需根據(jù)動物的發(fā)育階段分別進(jìn)行。

研究表明，飼料中添加適量的維生素（包括維生素A、維生素C、維生素E）能夠促進(jìn)克氏原螯蝦幼蝦的存活和生長，提高其免疫力。將克氏原螯蝦幼蝦的存活率和增重率作為主要考慮因素，綜合考慮免疫指標(biāo)及成本因素，我們建議在本次實驗設(shè)計的條件中，選擇A3B1C2作為三種維生素添加量的最佳組合，即維生素A添加量為0.006%，維生素C添加量為0.02%，維生素E添加量為0.04%。

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Effect of combined vitamin A，C and E supplementations in diet on survival，growth and immunity of juvenile Procambarus clarkii（Crustacea:Decapoda）cultured under laboratory conditions

Shao Guangming，Tan Hongyue，Wang Yufeng
（School of Life Sciences，Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology，Central China Normal University，Wuhan 430079，China）

Procambarus clarkii；vitamins；survival；growth；immunity

S963.73

A

1004-2091（2017）04-0046-07

10.3969/j.issn.1004-2091.2017.04.010

2016-07-21）

武漢市學(xué)科帶頭人計劃項目（201051730554）

邵光明（1988-），男，碩士研究生，研究方向為動物發(fā)育生物學(xué).E-mail:931610671@qq.com

王玉鳳，教授.E-mail:yfengw@mail.ccnu.edu.cn

Abstract:Vitamins are known to play essential roles in growth，immunity and reproduction of crustacean. The aim of this study was to determine the optimum dietary combinations of the supplementations of vitamin A（VA），vitamin C（VC）and vitamin E（VE）for survival，growth and immunity of juvenile crayfish Procambarus clarkii.In our orthogonal experiment，the three factors were varied at three levels（VAsupplementation: 0.0048，0.0054 and 0.006%;VCsupplementation:0.02，0.05 and 0.08%;VEsupplementation:0.02，0.04 and 0.06%）.Range analysis showed that the maximum survival rate of the juvenile crayfish occurred at VAsupplementation of 0.006%，VCsupplementation of 0.02 or 0.08%，VEsupplementation of 0.04%;maximum weight gain at VAsupplementation of 0.006%，VCsupplementation of 0.05%，VEsupplementation of 0.04%.The lowest malondialdehyde（MDA）content，specific activity of superoxide dismutase（SOD）and SOD gene expressionlevelwereobtainedatVAsupplementation0.0054%，VCsupplementationof0.02%，VE supplementation of 0.02%.The maximum phenol oxidase（PO）activity was obtained at VAsupplementation 0.006%，VCsupplementation of 0.05%，VEsupplementation of 0.02%.The lowest gene expression levels of GPx were obtained at VAsupplementation 0.006%，VCsupplementation of 0.02%，VEsupplementation of 0.02%. Taking survival and growth into key considerations，combining with immunity and cost as the secondary consideration，we suggest that a ratio of 0.006%of VA，0.02%of VCand 0.04%of VEsupplemented in the diet might be optimal for rearing the juvenile P.clarkii under the experimentally designed conditions studied.