王 道，施曉波，陳建林

中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，中國 長沙 410011)

IGF1/2在金魚的不同胚胎發(fā)育時期與不同組織中的分化表達

王 道，施曉波，陳建林

中南大學湘雅二醫(yī)院婦產(chǎn)科，中國 長沙 410011)

胰島素樣生長因子(insuline-like growth factors，IGFs)是一類具有胰島素樣代謝和促進有絲分裂功能的多肽，包括IGF1和IGF2，對調(diào)節(jié)垂體生長激素合成和分泌起著重要的作用，同時還參與了細胞的增殖、生長、分化等過程.利用RT-PCR在mRNA水平上檢測了IGF1/2基因在金魚不同組織和不同胚胎發(fā)育時期的表達.結(jié)果表明，IGF1基因在肝臟中的表達量最高，在大腦、肌肉及精巢的表達量相對較低；IGF2基因在脾臟中的表達量最高，在腎臟、卵巢及精巢的表達量相對較低.IGF1/2基因在不同發(fā)育時期基本上呈現(xiàn)由低到高的趨勢.研究表明，IGF1/2基因在金魚的不同組織和胚胎發(fā)育過程中可能具有重要的作用，但其具體機制還有待于進一步研究.

IGF1/2；金魚；組織器官；胚胎發(fā)育

胰島素樣生長因子(insuline-like growth factors，IGFs)在調(diào)節(jié)魚類的垂體生長激素合成和分泌中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[1-2].IGFs是一類具有胰島素樣代謝和促進有絲分裂功能的多肽，依照IGF的性能可以分為IGF1和IGF2.胰島素樣生長因子是由大多數(shù)器官和身體組織產(chǎn)生的生長因子，它們對機體代謝和細胞增殖、生長、分化、自分泌、旁分泌等起作用，而且大多數(shù)已知的IGF信號都是通過胰島素樣生長因子1型受體(IGF1R)來介導的.胰島素樣生長因子-1主要參與介導生長激素(GH)產(chǎn)生內(nèi)分泌的效應，IGF1信號轉(zhuǎn)導經(jīng)由與存在于細胞膜表面的IGF1受體(IGF1R)結(jié)合，其胞質(zhì)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域連接到RAS-RAF-MAPK和PI3K-PKB/AKT信號或胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)/有絲分裂原活化蛋白激酶(MAP)啟動MAPK信號通路，以激活細胞生長和增殖，并抑制程序性細胞死亡[3-4].IGF2是一種廣泛表達的多肽激素，主要在肝臟和子宮內(nèi)通過胎盤分泌，是胚胎生長和發(fā)育過程中的重要調(diào)節(jié)因子.Kadakia[5]等發(fā)現(xiàn)IGF2基因的過表達與胎兒的過度生長相關(guān)聯(lián)，并且在脂肪組織的生成中發(fā)揮重要作用.隨著進一步的研究，IGF2可能成為未來嬰幼兒肥胖的標記物[6].

迄今為止，研究人員在高等哺乳動物中對IGFs系統(tǒng)的研究已經(jīng)成熟，但是對于低等魚類系統(tǒng)的研究還非常少，主要集中在日本鰻鱺、虹鱒、金頭鯛和斑馬魚等少數(shù)魚類[7-10].為了研究IGF1/2基因在低等脊椎動物胚胎及組織中的表達與功能，作者以金魚為實驗材料，初步分析IGF1/2基因在金魚不同的胚胎發(fā)育時期及不同組織的分化表達模式，以期為后續(xù)探討IGF1/2基因的功能提供一定的基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需的金魚源自湖南長沙花鳥蟲魚大市場， 靜水養(yǎng)殖在玻璃缸中.用小手術(shù)剪刀沿泄殖孔剪開腹部，小心取出8種主要的組織器官：大腦、肌肉、心臟、腎臟、脾臟、肝臟、卵巢和精巢，然后用鑷子放入標記好的1.5 mL EP管中，用液氮快速封存，置于-80 ℃冰箱備用.金魚12個時期的胚胎是在高倍體視鏡的觀察下，通過精卵結(jié)合受精來獲得的.12個不同胚胎發(fā)育時期分別是：兩細胞、多細胞、囊胚期、原腸期、神經(jīng)胚期、視原期、腦泡期、肌肉效應期、心跳期、眼色素期、體色素期和出膜期.每個1.5 mL EP管置入不同時期的胚胎數(shù)目50個左右并標記，同樣快速用液氮封存，置于-80 ℃冰箱備用.

1.2 主要試劑及儀器

上海生物工程有限公司合成的IGF1/2 基因特異性引物一對；2xTaq PCR Mastermix(KT201)(北京天根生化科技有限公司)；總RNA提取試劑盒(MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)(日本Takara公司)；快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis kit)(美國Fermentas公司)；Biophotometer 核酸蛋白測定儀(美國Beckmancoulter公司)； S1000 Thermal Cycler PCR儀(美國BioRad公司)；E-Gel imager凝膠成像系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司).

1.3 RNA的提取

提取金魚8種不同組織和12個胚胎時期的Total RNA，采用Takara公司的總RNA提取試劑盒進行實驗.瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA是否提取成功.如果在凝膠電泳圖上出現(xiàn)28S和18S兩條帶，且無拖帶現(xiàn)象，28S的亮度是18S的二倍，則證明提取RNA成功.

1.4 反轉(zhuǎn)錄PCR

在PCR儀上通過Fermentas反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取8個組織器官和12個胚胎發(fā)育時期 cDNA模板，用引物軟件設計IGF1特異引物(正向5′-AAGTGTACCATGCGCTGTC-3′；反向5′-GAGTATCTGTATGCCGTTGC-3′)；IGF2特異引物(正向5′-GAAGTCGGAGCGAGATGTT-3′；反向5′-TGTCTTTCGGGAAGGGTCA-3′)以及內(nèi)參β-actin正反向引物進行PCR 反應(見表1).PCR反應過程是預先加入設計合成的IGF1/2特異性引物，預變性94 ℃ 5 min，而后 10個循環(huán)，94 ℃ 30 s，接著65 ℃ 30 s，72 ℃ 延伸60 s，然后加入內(nèi)參β-actin 正反引物進行25個循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸10 min.得到的PCR 最終產(chǎn)物在電泳槽內(nèi)1.5%瓊脂糖凝膠跑膠15 min，在凝膠成像系統(tǒng)紫外光照射下檢測并拍照.

表1 PCR所用引物

2 結(jié)果

2.1IGF1基因在金魚不同組織器官和不同發(fā)育時期的mRNA結(jié)果

經(jīng)檢測IGF1基因在金魚8個組織中都存在表達.在肝臟中的表達量最高，心臟、脾臟、腎臟次之，在大腦、肌肉及精巢的表達量相對較低(圖1).

IGF1基因在金魚12個胚胎發(fā)育時期都存在表達.在體色素和出膜期中的表達量最高，神經(jīng)胚、視原基、腦泡期、肌肉效應期、心跳期、眼色素期次之，在兩細胞期、多細胞期、囊胚期、原腸胚期的表達量相對較低.從兩細胞期到肌肉效應期呈現(xiàn)“由低到高”趨勢，在心跳期、眼色素期稍有下降，在體色素和出膜期又逐漸升高直至維持高水平(圖2).

1.大腦；2.心臟；3.肌肉；4.脾臟；5.腎臟；6.肝臟；7.精巢；8.卵巢圖1 IGF1基因在金魚8種不同組織中mRNA水平的表達Fig.1 The mRNA expression of IGF1 gene in goldfish different tissues

1.兩細胞期；2.多細胞期；3.囊胚期；4.原腸胚期；5.神經(jīng)胚；6.視原基；7.腦泡期；8.肌肉效應期；9.心跳期；10.眼色素期；11.體色素期；12.出膜期圖2 IGF1基因在金魚12個不同發(fā)育時期胚胎mRNA水平的表達Fig.2 The mRNA expression of IGF1 gene in goldfish different embryo

2.2IGF2基因在金魚不同組織器官和不同發(fā)育時期的mRNA結(jié)果

經(jīng)檢測IGF2基因在金魚8個組織中都存在表達.在脾臟中的表達量最高，心臟、肌肉、肝臟次之，在腎臟、卵巢及精巢的表達量相對較低(圖3).IGF2基因在金魚12個胚胎發(fā)育時期都存在表達.在體色素和出膜期中的表達量最高，神經(jīng)胚、視原基、腦泡期、肌肉效應期、心跳期、眼色素期次之，在兩細胞期、多細胞期、囊胚期、原腸胚期的表達量相對較低.從兩細胞期、多細胞一直到體色素和出膜期呈現(xiàn)典型“由低到高”的逐漸升高趨勢(圖4).

1.大腦；2.心臟；3.肌肉；4.脾臟；5.腎臟；6.肝臟；7.精巢；8.卵巢圖3 IGF2基因在金魚8種不同組織中mRNA水平的表達Fig.3 The mRNA expression of IGF2 gene in goldfish different tissues

1.兩細胞期；2.多細胞期；3.囊胚期；4.原腸胚期；5.神經(jīng)胚；6.視原基；7.腦泡期；8.肌肉效應期；9.心跳期；10.眼色素期；11.體色素期；12.出膜期圖4 IGF2基因在金魚12個不同發(fā)育時期胚胎mRNA水平的表達Fig.4 The mRNA expression of IGF2 gene in goldfish different embryo

3 討論

有絲分裂肽家族的胰島素樣生長因子(IGFs)在生物體內(nèi)具有不同的功能，主要體現(xiàn)在參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化有絲分裂原和細胞凋亡等過程[11-12].胰島素樣生長因子系統(tǒng)包括：單鏈多肽的IGF1和IGF2以及6個結(jié)合蛋白(IGFBP1～IGFBP6).IGF1和IGF2分別含有70和67個氨基酸，并且明顯類似胰島素原.胰島素樣生長因子介導多個個體發(fā)育階段如胚胎期、嬰兒期、青春期、成年期，并存在于幾乎每一個級別的生命系統(tǒng)中，如細胞、組織、器官、生物體及基本生物過程.本研究發(fā)現(xiàn)在金魚中IGF1/2基因在不同組織及胚胎發(fā)育階段廣泛表達，這一結(jié)果也與上述結(jié)論一致.

許多研究人員已證實胰島素樣生長因子家族與幾種代謝疾病相關(guān)聯(lián)，其中包括1型糖尿病，近年來甚至還有報道其與癌癥有關(guān)，特別是乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌，如Werner[13]等人通過流行病和臨床試驗表明，胰島素樣生長因子(IGFs)是一個使表型正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤細胞事件發(fā)生的生化鏈的重要介質(zhì).Bruchim的臨床研究數(shù)據(jù)也通過回顧一些具體的惡性腫瘤事件證實了IGFs系統(tǒng)的表達和作用的失調(diào)與不同的病癥有關(guān)，從而導致了癌癥的發(fā)展[14].Han[15]等研究調(diào)查了在糖尿病患者中胰島素樣生長因子相關(guān)蛋白和大腸癌的發(fā)生幾率之間的關(guān)系，結(jié)果提示結(jié)直腸癌的糖尿病患者的發(fā)生可能與升高的IGFs相關(guān)蛋白表達水平相關(guān)聯(lián).Solarek[16]等發(fā)現(xiàn)IGF1和IGF2發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖和分化的作用，試圖了解胰島素樣生長因子的過度活化在癌癥發(fā)生過程中的主要機制，以此開辟新的抗癌療法來預防和治療常見的人類惡性腫瘤.

Zhou[17]等研究斑馬魚發(fā)現(xiàn)，在卵泡發(fā)育的不同階段，胰島素樣因子扮演不同的角色，在不同的生理水平上調(diào)節(jié)IGF信號傳導的程度.Silva[18]等研究顯示IGF1對原始卵泡發(fā)育沒有作用效果，但IGF1和IGF2協(xié)同能夠刺激次級卵泡的生長，在竇狀卵泡中，這些胰島素樣生長因子刺激顆粒細胞增殖.IGF1/2基因在金魚胚胎發(fā)育早期的兩細胞、多細胞期到體色素和出膜期基本呈現(xiàn)由低到高的逐漸升高趨勢，該結(jié)果也表明其與魚類的生長發(fā)育成熟密切相關(guān).

在哺乳動物和魚類中，內(nèi)分泌的IGF1主要產(chǎn)生于肝臟，能夠刺激免疫細胞的生長和分化，并抑制細胞凋亡，是一種有效的生長因子.Franz[19]等研究硬骨魚證實這種刺激作用經(jīng)常與升高的內(nèi)分泌(肝臟來源)的IGF1相關(guān).但是魚類中IGF2的作用仍然不清楚.本研究中IGF1基因在金魚的肝臟組織中表現(xiàn)出高度表達的特征，同時IGF2也在肝臟中有較高表達.

特別讓科學家感興趣的是IGF1和IGF2在免疫中所發(fā)揮的重要作用.Ge[20]等為了研究IGF在腸道炎癥過程中的免疫機制，對腸道上皮細胞產(chǎn)生的IGF1通過實時定量RT-PCR和Western印跡進行評估，結(jié)果顯示IGF1能夠在腸道中抑制免疫炎癥反應.Geng[21]則發(fā)現(xiàn)IGF1受體(IGF1R)和IGF2受體(IGF2R)在特異性B細胞表達，通過酶聯(lián)免疫試驗證實其增強了白細胞介素(IL)-10的釋放.一些研究還指出，自分泌/旁分泌的IGF1與成人免疫器官發(fā)育相關(guān)聯(lián).脾臟是體內(nèi)最大的淋巴免疫器官，在本研究中IGF1/2基因在金魚的脾臟中也存在高表達，但是關(guān)于IGF1在魚類組織中免疫細胞的不同定位的研究尚不夠多.IGF1僅被定位在不同哺乳動物的免疫細胞類型，在T淋巴細胞特別是巨噬細胞和粒細胞中.在其它魚類研究中，IGF1在虹鱒魚頭腎分離的吞噬細胞和鯰魚細胞系的T細胞中被檢測到.總之，IGF1/2基因在魚類發(fā)育不同階段和不同的組織中廣泛表達，增加了區(qū)分研究它們的生物學功能的難度.后續(xù)基礎研究可以利用RNAi沉默或者突變基因的方法，揭示在魚類早期胚胎發(fā)育過程中IGF1/2的主要生理學作用和機制.

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(編輯 WJ)

The Temporal and Tissue Expression Patterns ofIGF1/2 Gene in Goldfish(CarassiusAuratus)

WANGDao,SHIXiao-bo,CHENJian-lin*

(Department of Obstetrics and Gynecology, the Second Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410011, China)

Insulin-like growth factors (IGFs), including IGF1 and IGF2, are a class of polypeptides with insulin-like metabolic and mitogenic functions. It not only plays an important role in regulating pituitary hormone synthesis and secretion, but also involved in cell proliferation and growth and differentiation processes. In this work, RT-PCR was used to examine the expression ofIGF1/2 gene in different tissues and periods of embryonic development at the mRNA level in goldfish. Our results reveal that theIGF1 gene was expressed the highest level in the liver and to a much less degree in the brain, muscle and testis of goldfish, whereasIGF2 was expressed the highest in the spleen but relatively low in the kidney, ovary and testis. TheIGF1/2 genes were expressed differently at different developmental stages, with the pattern of “l(fā)ow to high” trend. These studies suggest thatIGF1/2 genes should play important roles in embryonic development and in different tissues of goldfish. The exact mechanism remains to be further investigated.

IGF1/2; goldfish; tissue organ; embryonic development

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.007

2016-11-23

湖南省科技廳基金資助項目(2015JJ4071)

Q786

A

1000-2537(2017)02-0044-05

*通訊作者,E-mail：jianlinchen2009@126.com