王兆芬，李 斌，蔣明霞，馬永成，汪海靜，申秀麗，姚雪瓊，李婷婷，陳 英，王新華

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青海省251株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping基因型與4種一線藥物耐藥表型的研究

王兆芬1，李 斌1，蔣明霞2，馬永成2，汪海靜1，申秀麗1，姚雪瓊1，李婷婷1，陳 英1，王新華1

目的 研究青海結(jié)核分枝桿菌對4種一線抗結(jié)核藥物耐藥狀況及與Spoligotyping基因型的關(guān)系，為結(jié)核病有效預(yù)防提供依據(jù)。方法 采用常規(guī)比例法對分離的251株結(jié)核分枝桿菌進行異煙肼(INH)、利福平(RFP)、鏈霉素(SM)和乙胺丁醇(EMB)等4種一線抗結(jié)核藥物的藥敏試驗，并對菌株進行Spoligotyping分型，對藥敏試驗和基因分型結(jié)果進行綜合分析。結(jié)果 251株結(jié)核分枝桿菌中，總耐藥率為56.2%；對INH、RFP、SM和EMB的耐藥率分別為43.0%(108/251)、37.1%(93/251)、39.0%(98/251)和27.9%(70/251)；耐多藥率為31.5%(79/251)。所有菌株經(jīng)Spoligotyping分型，分為北京基因型185株(73.7%)與非北京型菌株66株 (26.3%)。未發(fā)現(xiàn)北京型與非北京型結(jié)核菌株與耐藥存在統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)。結(jié)論 青海流行的結(jié)核分枝桿菌耐藥率及多耐藥率較高，Spoligotyping分型顯示北京基因型為主要流行型。

結(jié)核分枝桿菌；耐藥；寡核苷酸序列分型

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是目前全球最重要的公共衛(wèi)生問題之一，耐多藥結(jié)核(Multidrug-resistant TB, MDR TB)的流行更是加劇了結(jié)核病對人群的威脅。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)2015年度報告，2014年世界上有960萬結(jié)核病新發(fā)病例，共有150萬人因結(jié)核死亡，19萬人死于耐多藥結(jié)核??；估計全球耐多藥患者48萬[1]。中國是結(jié)核病高負擔(dān)國家，2014年結(jié)核發(fā)病人數(shù)93萬，位居第3，耐多藥患者約5.2萬[1]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因分型方法在結(jié)核分枝桿菌分型工作中的應(yīng)用逐漸得到完善。DR區(qū)的寡核苷酸序列分型方法(Spacer Oligonucletide Typing, Spoligotyping)是以PCR為基礎(chǔ)的一種快速分型方法。本研究對青海省分離的251株結(jié)核菌進行了Spoligotyping分型及耐藥檢測，并進行了基因型與耐藥情況的分析。

1 材料與方法

1.1 菌株來源與鑒定 251株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株由青海省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病實驗室提供，對照標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病實驗室提供。結(jié)核分枝桿菌的分離及鑒定根據(jù)《結(jié)核病診斷細菌學(xué)檢驗規(guī)程》進行，病原分離采用改良羅氏培養(yǎng)基，菌型鑒定使用鑒別培養(yǎng)基培養(yǎng)法，本實驗研究中251株菌均為結(jié)核分枝桿菌。

1.2 藥敏試驗 采用WHO/國際防癆和肺病聯(lián)合會(WHO/IUATLD)推薦的比例法[2]，分別對異煙肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampin, RFP)、鏈霉素(streptomycin, SM)和乙胺丁醇(ethambutol, EMB)等4種一線抗結(jié)核藥物進行藥敏試驗。

1.3 Spoligotyping分型 對本研究的251株結(jié)核分枝桿菌進行Spoligotyping分析，H37Rv為實驗陽性對照。參照的方法為國際標(biāo)準(zhǔn)的43個寡核苷酸位點的寡核苷酸雜交實驗技術(shù)[3]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 將Spoligotyping實驗結(jié)果進行數(shù)字轉(zhuǎn)化，并與SpolDB 4.0數(shù)據(jù)庫[4]進行比對分析確定菌株的類型。通過藥敏試驗鑒定菌株耐藥情況，運用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗 251株結(jié)核分枝桿菌分離株中，對1種或1種以上藥物耐藥者有141株，總耐藥率為56.2%，其中耐INH藥物的結(jié)核菌株有108株(43.0%)、耐RFP藥物的有93株(37.1%)、耐SM藥物的有98株(39.0%)、耐乙胺丁醇藥物的有70株(27.9%)，耐多藥菌株79株(31.5%)。

2.2 Spoligotyping分型 通過與SpolDB4.0數(shù)據(jù)庫進行比對分析，北京基因型有185株(73.7%)，MANU2型基因型有8株(3.2%)，U型基因型有9株(3.6%)，T1型基因型有3株(1.2%)，H4型基因型有1株(0.4%)，其他類型基因型45株(17.9%)。表1為251株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型結(jié)果。

表1 251株結(jié)核分枝桿菌Spoligotyping分型結(jié)果

Tab.1 Results of genotyping of 251M.tuberculosisisolates with spoligotyping

SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□■■■■□□■■□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□■□□□□□□□□□■□■■□□□□■■□□■■■■■□□■■■■■■■■■????NEW1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■□□■■■■■■■■■??NEW2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■■1Beijing156(62．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■■□??like?Beijing16(6．4)表1(續(xù))SpoligotypingSITGenusN(%)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■□■■■190like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■■□□??like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□■■■■□??like?Beijing3(1．2)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■■■□■□??like?Beijing2(0．8)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□■□■■□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■□□□■■□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■■□■■□□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□■■□□??like?Beijing1(0．4)□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□■■■□□□□□□??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■54MANU27(2．8)■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■583MANU21(0．4)■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■523U9(3．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□■■■■■■■■■■??NEW4(1．6)■■■■■■□□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□■■■■■■■53T13(1．2)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□■■■■■□■■■??NEW1(0．4)■□■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■□□□□■■■■■■■127H41(0．4)■■■■■□■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■□□□□■■■■■■■???NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■□??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■□□■■■■■□■■■??NEW1(0．4)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□□□□■■■■■■■■■■■□■■■??NEW4(1．6)■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■■□□□■■■■■■■■■■■■■■□■■■??NEW2(0．8)■□■■■■□■■■■□■■□□□■■□□□□■■■■■■■■■□□■■■■■■■■■??NEW1(0．4)

2.3 不同基因型與耐藥相關(guān)分型 本研究未發(fā)現(xiàn)北京基因型及非北京型結(jié)核分枝桿菌與耐藥性之間存在關(guān)聯(lián)，見表2。

表2 不同基因型與耐藥相關(guān)分析

Tab.2 Correlation between genotypes and drug resistance

ResistancephenotypesNo．ofisolates251(%)GenotypesBeijing185(%)non?Beijing66(%)χ2POnlyresistanttoINH5(2．0)4(2．2)1(1．5)0．0001．000OnlyresistanttoRFP11(4．4)5(2．7)6(9．1)3．3360．068OnlyresistanttoSM13(9．6)9(4．9)4(6．1)0．0030．958OnlyresistanttoEMB4(1．6)4(2．2)0(0．0)1．4500．229MDR79(31．5)55(29．7)24(36．4)0．9930．319TotalResistance141(56．2)101(54．6)40(62．5)1．2100．271

Note：MDR is resistant to both isoniazid and rifampin.

3 討 論

北京基因型結(jié)核分枝桿菌是引起全球結(jié)核病流行的優(yōu)勢菌株，占全球分離的結(jié)核分枝桿菌菌株的13%，在東亞地區(qū)更是達到50%以上[5]。此前有研究表明，我國北方地區(qū)北京基因型菌株所占比例高于南方地區(qū)[5]，這可能與北方地區(qū)的地理環(huán)境、氣候條件、人口構(gòu)成等因素有關(guān)，同時也表明北京基因型菌株可能存在特殊的地域性。本研究251株結(jié)核分枝桿菌中，通過Spoligotyping方法進行基因分型，結(jié)果顯示，在青海省主要流行的結(jié)核菌株為北京型(73.7%)，這個結(jié)果與之前其他人所做結(jié)果一致[6-7]。

結(jié)核分枝桿菌耐藥性的產(chǎn)生機制復(fù)雜，可能與基因突變及菌體蛋白表達差異等有關(guān)[8-9]。耐藥結(jié)核病的流行，使結(jié)核病的防治面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，亞洲和非洲尤甚[1]。全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報告顯示：我國肺結(jié)核病患者中耐藥率為37.8%，耐多藥率為8.3%[10]。2015年世界衛(wèi)生組織的全球結(jié)核病報告顯示，我國新發(fā)耐多藥結(jié)核病率為19%，復(fù)發(fā)耐多藥結(jié)核病率為54%[1]。

本研究實驗結(jié)果顯示：青海地區(qū)流行的結(jié)核菌株對一線4種抗結(jié)核藥物1種或1種以上藥物耐藥者有141株，總耐藥率為56.2%，遠高于抽樣調(diào)查的全國平均水平36.8%[11]。有研究認為北部省份耐藥率偏高，主要原因可能是北部省份經(jīng)濟發(fā)展水平較南方差，氣候較為寒冷，居民室內(nèi)活動時間較長，易于傳染等[12]。本研究發(fā)現(xiàn)青海地區(qū)251株結(jié)核分枝桿菌，耐INH藥物的結(jié)核菌株有108株(43.0%)、耐RFP藥物的有93株(37.1%)、耐SM 藥物的有98株(39.0%)、耐EMB藥物的有70株(27.9%)，這與米熱班·熱夏提等的研究結(jié)果一致[13]，但與車洋等人[14]的研究結(jié)果有差異，提示各地區(qū)結(jié)核耐藥情況有所區(qū)別。青海地區(qū)一線藥物耐多藥率高達31.5%(79/251)，遠高于一線抗結(jié)核藥物全國耐多藥率6.8%[11]。不同地區(qū)結(jié)核分枝桿菌的耐藥率有所不同，在治療結(jié)核病時，需要根據(jù)當(dāng)?shù)啬退幪卣鬟x擇適當(dāng)?shù)拿舾兴幬?。青海高耐藥率與高耐多藥率的原因需要進一步研究。

由于北京型菌株在全球流行廣泛，有研究者報道北京型結(jié)核分枝桿菌與耐藥無關(guān)[15-17]，但也有研究發(fā)現(xiàn)此基因型菌株與耐藥性存在相關(guān)[18]。本研究結(jié)果顯示，青海地區(qū)北京型結(jié)核分枝桿菌與非北京型結(jié)核分枝桿菌的耐藥率差異不明顯，菌株分型與耐藥率之間無統(tǒng)計學(xué)關(guān)聯(lián)(P>0.05)。以后的研究中尚需要進一步觀察。

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Investigation on spoligotyping and phenotypes of drug resistance to four first-line drugs in 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai, China

WANG Zhao-fen1, LI Bin1, JIANG Ming-xia2, MA Yong-cheng2, WANG Hai-jing1, SHEN Xiu-li1, YAO Xue-qiong1, LI Ting-ting1, CHEN Ying1, WANG Xin-hua1

(1.PublicHealthDepartmentofMedicalSchool,QinghaiUniversity,Xining810001,China; 2.InstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,QinghaiCenterforDiseaseControlandPrevention,Xining810007,China)

This study aims to learn drug resistance situation of four first-line anti-TB drugs among 251Mycobacteriumtuberculosisisolates from Qinghai and to explore their relationships with genotypes by Spoligotyping, so as to provide basis for effective prevention of tuberculosis. Isolates of 251M.tuberculosiswere tested susceptibilities of four first-line drugs including isoniazid (INH), rifampicin (RFP), streptomycin(SM) and ethambutol (EMB) by using conventional proportion method and genotyped by Spoligotyping. Relationship between drug resistance and genotypes was analyzed statistically. Results showed the total drug resistance rate was 56.2% (141/251) among 251M.tuberculosisisolates. Resistance rates of four first-line drugs were 43.0% (108/251) for INH, 37.1% (93/251) for RFP, 39.0% (98/251) for SM, 27.9% (70/251) for EMB respectively. Rate of multidrug-resistant TB (MDR TB) was 31.5% (79/251). All 251 isolates ofM.tuberculosiswere typed by spoligotyping. The 185 (73.7%) were Beijing genotypes and 66 (26.3%) were non-Beijing genotypes, and no statistical association was found with drug resistance. This paper concludes that isolates ofM.tuberculosisprevail in Qinghai have both high rates of drug resistance and MDR and dominant isolates are Beijing genotypes by spoligotyping.

Mycobacteriumtuberculosis; drug resistance; spoligotyping

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.008

國家自然科學(xué)基金(No.81660556)；青海省科技廳項目(No.2014-ZJ-910)聯(lián)合資助

1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生系，西寧 810001； 2.青海省疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所，西寧 810007

Supported by the National Natural Science Foundation (No.81660556) and Qinghai Science and Technology Commission (No.2014-ZJ-910)

R378.9

A

1002-2694(2017)04-0332-05

2016-06-06 編輯：張智芳