高向陽， 穆洪濤, 方 穎

(1.華南農業(yè)大學 食品學院，廣州 510642； 2.廣東第二師范學院 生物與食品工程學院，廣州 510303； 3.華南農業(yè)大學 公共基礎課實驗教學中心,廣州 510510)

雙水相萃取系統相圖制作新方法

高向陽1， 穆洪濤2, 方 穎3

(1.華南農業(yè)大學 食品學院，廣州 510642； 2.廣東第二師范學院 生物與食品工程學院，廣州 510303； 3.華南農業(yè)大學 公共基礎課實驗教學中心,廣州 510510)

相圖是研究雙水相萃取分離過程的重要前提步驟，提出了清-濁點輔助相圖制作方法，采用移液器微量滴定的方法繪制了PEGs/(NH4)2SO4的雙水相相圖，經準確度驗證，此方法準確可靠。清-濁點輔助相圖制作法具有操作簡便、快速、準確和適用范圍廣等特點，為雙水相系統相圖制作提供了新的方法，可以用于雙水相萃取的實驗教學、科研及生產等領域。關鍵詞：清-濁點輔助相圖制作方法； 雙節(jié)線； 微量滴定； PEG/(NH4)2SO4雙水相系統

0 引 言

雙水相萃取系統(Aqueous Two-phase Extraction，ATPS)是由兩種化學結構不同的親水性聚合物，或者一種親水性聚合物和無機鹽在水中以適當的濃度而形成互不相溶的兩水相系統。由于其條件溫和、容易放大、可連續(xù)操作，目前已廣泛地應用于生物大分子的分離和純化[1]。

目前，常用于雙水相系統相圖制作的方法大致有濁點法[2]和系線法[3]。濁點法制作相圖操作簡便，但由于在臨界點判斷上往往存在誤差，故不同研究者制作的相圖差異較大，降低了參考性[4-6]。系線法需要分析上、下相的組分的質量分數，操作繁瑣，而且精確地做出相圖要許多組數據,工作量大，增加了相圖制作的困難?；诖?，本文提出了清-濁點輔助相圖制作法，此方法不僅對所有的雙水相體系相圖制作具有普遍適用性，而且其操作過程更加簡易快捷，相圖的精確度方面也較傳統濁點法有較大程度的提高。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：PEG400(聚乙二醇400)，PEG1000，PEG2000，PEG6000購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；硫酸銨購自國藥集團化學試劑有限公司，去離子水產自Milli-Q Academic A10。

儀器：1/1000天平(METTLER TOLEDO PB203-N)，20～200 μL、100～1 000 μL移液器(Eppendorf Research plus)，漩渦振蕩器(Essenscien v7)，玻璃刻度離心管10 mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液配制

將成相物質PEG配制成50%(質量分數)的濃溶液，(NH4)2SO4配制成40%(質量分數)的濃溶液，備用。

1.2.2 清-濁點的測定

濃溶液質量的標定：用微量移液器量取一定體積(1 mL 或100 μL)的50%PEG濃溶液或40%的(NH4)2SO4濃溶液，于電子天平上稱量液體質量，每種濃溶液反復稱量10次。

在刻度離心管中加入1 mL 50%PEG濃溶液，然后用移液器每次加入100 μL (NH4)2SO4濃溶液，振蕩，至體系剛剛渾濁(濁點)，記錄加入(NH4)2SO4濃溶液的體積；再每次加入100 μL水，至體系剛剛澄清(清點)，記錄加入水的體積；同理依次交替加入(NH4)2SO4濃溶和水，記錄加入體積并計算每個測試點含(NH4)2SO4和PEG的質量分數。

1.2.3 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的建立

以硫酸銨的質量分數為橫坐標，PEG的質量分數為縱坐標，繪制清點散點圖和濁點散點圖。由于理論上相圖的雙節(jié)線位于濁點散點圖和清點散點圖之間，故取相鄰濁點坐標和清點坐標的中點所組成的系列散點制作雙節(jié)線圖，并對中點散點圖進行曲線擬合。

1.2.4 相圖精準度驗證

根據對雙節(jié)線的擬合結果，在雙節(jié)線附近均勻選取驗證點，根據所選的驗證點坐標配制相應濃度的溶液體系，驗證分相結果。

2 結果與分析

2.1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系清-濁點的測定

PEG是雙水相萃取分離中最常用的一種有機試劑，本研究著重以PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖的制作為例，介紹清-濁點相圖制作方法。由于備用硫酸銨濃溶液比重較大，需要對一定體積的濃溶液的質量(密度)進行標定,以便計算每個清-濁點的PEG和硫酸銨的質量分數。濃溶液質量標定參照移液器標定方法[7]。由表1可知，一定體積濃溶液質量標定結果的標準差及變異系數(CV<5%)為可接受范圍。即可以用微量移液器來量取溶液進行清-濁點的制作。

向1 mL 50%的PEG1000溶液中以100 μL為單位滴加(NH4)2SO4或去離子水，記錄達到每個濁點或清點所用的(NH4)2SO4和去離子水的份數(25 ℃)。在PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系中共測定54個測試點，其中清點和濁點的個數均為27個。在54個測試點中，絕大數測試點(90.7%)只需滴加1份(100 μL)；只有少數(7.4%)需滴加2份，僅有一個點需滴加4份。由此可見，此方法大大簡化了傳統相圖的制作步驟。

計算每個濁點和清點處PEG1000和(NH4)2SO4的質量分數，并以(NH4)2SO4的質量分數為橫坐標，PEG1000的質量分數為縱坐標繪制散點圖(見圖1)。圖1中濁點散點和清點散點圖大致平行，且距離緊密。

圖1 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系測試點分布圖

2.2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖制作及驗證

由于每次加入(NH4)2SO4和H2O的體積大體相當，且每次加入的溶液相對整個體系來說較小，故選取相鄰清點和濁點坐標的中點散點作為雙節(jié)線的制作依據，所作的相圖更加精確。依據中點散點圖描出的平滑曲線即為PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系的相圖(見圖2)。經回歸分析獲得中點散點圖的擬合曲線公式:

y=9.971 2x2-4.708 1x+0.594 3

回歸系數R2=0.996 5。

圖2 PEG1000/(NH4)2SO4雙水相體系相圖

根據擬合的方程，在雙節(jié)線上下均勻選取驗證點各7個，并配制相應濃度的溶液體系，震蕩后靜止觀察是否出現兩相。各驗證點的結果(見圖3)顯示，雖然雙節(jié)線上下的驗證點距離較近，但是上方的7個點均出現兩相分層，下方的7個點均未出現兩相分層(均相)。此結果表明,清-濁點輔助相圖制作方法制作的相圖精確。

2.3 其他型號PEG/(NH4)2SO4的相圖制作

按照同樣方法作出PEG400、PEG2000、PEG6000與(NH4)2SO4的雙水相體系相圖(見圖4)。由此可知，清-濁點輔助相圖制作方法同樣適合其他型號或類型的雙水相系統相圖的制作。

3 討 論

與其他方法相比，清-濁點輔助相圖制作法樣品用量少使體系能夠快速平衡，從而在單位時間內能夠采集更多相分離臨界點，提高了相圖的準確度，同時又大大地減少了相圖制作時間并節(jié)約了測試試劑成本(見表2)。另外，由于本方法無需測定各成相組分的質量分數，故具有極高的通用性。由表2可知，傳統濁點法依然是相圖制作的主流方法。此種方法雖然具有操作簡便快捷的優(yōu)點，但在臨界點判斷上往往存在誤差。濁度滴定法[12]是在傳統濁點法的基礎上，用回滴水或回滴有機相的方法對濁點加以確定。濁度滴定法雖在一定程度內提高了濁點的判定的準確度，但反復滴加和每管至多測定一個濁點，也在一定程度上增加了操作步驟的繁瑣度。安建平等[6]用吸光度法和電導率法分別測定PEG和(NH4)2SO4的質量分數帶替代傳統的稱重法，在臨界點的判定上并沒有做出改進。

圖3 相圖精準度驗證

圖4 PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系相圖

表2 清-濁點輔助相圖制作法與其他相圖制作方法的比較

4 結 語

本文提出的清-濁點輔助相圖制作方法依據雙節(jié)線的定義修正了傳統上用濁點來表示臨界點的方法，提高了臨界點確定的準確度，具有快捷簡便、試劑用量少和適用范圍廣等特點；另外，清-濁點輔助相圖制作方法同時也傳承了傳統濁點法適用范圍廣的優(yōu)點，即不僅適用于PEGs/(NH4)2SO4的雙水相體系還適用于其他雙水相萃取體系的相圖制作，如高聚物-鹽、高聚物-高聚物、表面活性劑、離子液體等組成的雙水相體系。綜上，清-濁點輔助相圖制作法作為一種新型雙水相系統相圖制作方法，可以用于與雙水相萃取相關的實驗教學、科研及生產等領域。

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A Novel Method for Construction Aqueous Two-phase System Phase Diagram: Clear-cloud Points Aid Phase Diagram Establishment

GAOXiangyang1,MUHongtao2,FANGYin3

(1. Food College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China； 2. College of Biological and Food Engineering, Guangdong Education Institute, Guangzhou 510303, China; 3. Public Basic Course Experimental Teaching Center, South China Agrical Telrel University, Guangzhou 510510, China)

Phase diagrams are essential and important in the application of aqueous two-phase extraction technology. Conventional methods in the determination of phase boundaries are inaccurate, complicated and time consuming. In this paper, we proposed a novel method to overcome these imperfections. Using adjustable-volume pipettes and pipette calibration method, the method proposed could steadily provide accurate phase diagrams in a short time. It was tested in the phase diagram of PEG/(NH4)2SO4, and the result showed extensive reliability. This method can be used in area of experiment teaching, scientific research, and industrial manufacture which related to aqueous two-phase extraction technology.

clear-cloud points aid phase diagram establishment; bimodal; microtitration; PEG/(NH4)2SO4aqueous two-phase extraction system

2016-05-13

國家自然科學基金項目(6130425);華南農業(yè)大學校級教學改革項目(JG14110)

高向陽(1966-)，女，湖南麻陽人，博士，副教授，研究方向：食品生物化學。Tel.:13310896601;E-mail:xin-198310@163.com

1006-7167(2017)03-0016-04

TP 212

A