張曉勤+陳川+方彩云 陸豪杰

摘要 半胱氨酸的巰基具有很高的反應(yīng)活性，作為親核、氧化還原催化反應(yīng)、金屬結(jié)合及變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)等在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮著非常重要的作用，且容易發(fā)生多種翻譯后修飾，調(diào)控亦或損傷蛋白功能，與人類許多重要疾病關(guān)系密切，因此，定性與定量分析蛋白質(zhì)半胱氨酸上的翻譯后修飾組對理解其生物學(xué)功能具有重要意義。本文綜述了近年來蛋白質(zhì)半胱氨酸上常見的翻譯后修飾組的質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法進(jìn)展。

關(guān)鍵詞半胱氨酸；蛋白質(zhì)翻譯后修飾；質(zhì)譜；蛋白質(zhì)組學(xué)；綜述

1引言

自20世紀(jì)80年代以來，一系列軟電離技術(shù)如基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）[1＼]和電噴霧電離（ESI）[2＼]發(fā)現(xiàn)后，生物質(zhì)譜（MS）技術(shù)得到了迅速發(fā)展，為生命科學(xué)各領(lǐng)域包括蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究提供了高通量、高靈敏和高分辨的分析平臺，并已成為現(xiàn)代生物技術(shù)快速發(fā)展的重要支撐。它不僅可提供修飾蛋白質(zhì)的類型和位點(diǎn)信息，且可定量研究其修飾程度及變化，促進(jìn)了人們對蛋白翻譯后修飾的理解。半胱氨酸（Cys，C）是一種存在于大多數(shù)蛋白質(zhì)中頻次較低的氨基酸（約占1%～2%）[3＼]，但Cys的巰基反應(yīng)活性高（親核性和氧化還原敏感性），常作為氧化還原催化反應(yīng)、金屬結(jié)合及變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)等在蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)控細(xì)胞識別、信號傳導(dǎo)等生理過程[4＼]。Cys巰基對細(xì)胞內(nèi)局部環(huán)境的變化很敏感，易發(fā)生一系列非酶或酶催化的翻譯后修飾，從而快速、動態(tài)調(diào)控蛋白質(zhì)的構(gòu)型、活性等，甚至導(dǎo)致蛋白功能損傷，與人類許多重要疾病關(guān)系密切，因此，對蛋白質(zhì)Cys上的翻譯后修飾組的研究具有十分重要的生物學(xué)意義，受到研究者的廣泛關(guān)注。但研究對象多為復(fù)雜的生物樣品，蛋白質(zhì)豐度變化范圍大，而Cys被修飾的蛋白質(zhì)/肽段大多豐度較低，在質(zhì)譜分析過程中的信號容易受到抑制，常需特異富集后才能被有效鑒定；Cys上修飾種類多，但性質(zhì)各異，在樣品處理或質(zhì)譜分析時大多不穩(wěn)定，常需建立合適的質(zhì)譜方法進(jìn)行分析。此外，在質(zhì)譜分析過程中，不同的離子斷裂方式如碰撞誘導(dǎo)解離（Collisioninduceddissociation，CID），高能碰撞解離（Highenergycollisiondissociation，HCD），電子捕獲解離（Electroncapturedissociation，ECD）和電子轉(zhuǎn)移解離（Electrontransferdissociation，ETD）等各有特點(diǎn)，能提供的碎片離子信息各不相同，在蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究中應(yīng)用不同?；诖耍疚木C述了質(zhì)譜和蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法對Cys殘基上一些常見的翻譯后修飾組的研究進(jìn)展（如圖1示），包括氧化還原依賴的修飾如亞硝基化、Cys氧化和谷胱甘肽化等，脂質(zhì)衍生親電試劑（Lipidderivedelectrophiles，LDEs）如4Hydroxy2nonenal（HNE）化修飾，及脂質(zhì)修飾如棕櫚?；彤愇煜┗?。

2氧化還原依賴的翻譯后修飾

Cys巰基的氧化還原修飾是細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個重要機(jī)制。細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸或代謝時不可避免地會產(chǎn)生“活性氮”（RNS）或“活性氧”（ROS）等高活性物質(zhì)，這些天然副產(chǎn)物在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中扮演著重要的角色；同時，在外界刺激下過量產(chǎn)生的RNS或ROS也會引起氧化應(yīng)激甚至抗氧化防御系統(tǒng)的破壞，與心血管、腫瘤等重大疾病關(guān)系密切。

LM

2.1S亞硝基化修飾（SNitrosylation）

一氧化氮性質(zhì)活潑，可共價結(jié)合到蛋白質(zhì)Cys巰基上，使之變成亞硝基硫醇（SNO）形成S亞硝基化，這是一種可逆、氧化還原依賴的翻譯后修飾形式，參與調(diào)控幾乎所有的生物學(xué)過程，與人類疾病密切相關(guān)[5＼]。但SNO修飾蛋白豐度低，SNO穩(wěn)定性相對較差，質(zhì)譜尤其是MALDIMS分析時[6＼]，SNO鍵比肽段的骨架結(jié)構(gòu)更易碎裂，引起NO丟失，而在相對溫和的條件下如ESIMS分析，有時能檢測到含NO基團(tuán)的修飾肽段[7＼]。Hao等[8＼]利用NO的中性丟失，發(fā)展了SNO修飾蛋白質(zhì)及其位點(diǎn)的質(zhì)譜直接檢測方法。Wang等[9＼]通過調(diào)節(jié)儀器參數(shù)（如椎體電壓等）和緩沖溶液的組成，可保持SNO鍵在質(zhì)譜分析時不斷裂。為避免中性丟失，Beuve等[10＼]則先用N（6＼[生物素胺＼]3′（2′吡啶二硫）丙酰胺（biotinHPDP）衍生化NO修飾位點(diǎn)，再聯(lián)用不同的質(zhì)譜碎裂方式（CID和HCD）進(jìn)行分析。由于ETD是通過將電子從活潑的陰離子基團(tuán)轉(zhuǎn)移到質(zhì)子化的肽段上，誘發(fā)肽段主鏈發(fā)生斷裂，而側(cè)鏈上的SNO等修飾基團(tuán)仍保留在肽段上，因此被越來越多地用于各種翻譯后修飾如亞硝基化的研究中[11＼]。但這些方法均限于純化的重組蛋白等簡單樣品的分析。

為高通量分析亞硝基化蛋白質(zhì)及位點(diǎn)，在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域中以生物素轉(zhuǎn)換方法（Biotinswitchmethod，BS）應(yīng)用最為廣泛，一般是通過烷基化封閉蛋白質(zhì)中的自由巰基，用抗壞血酸鹽選擇性還原SNO產(chǎn)生新的自由巰基，采用生物素化試劑如biotinHPDP標(biāo)記新產(chǎn)生的自由巰基，再利用其中的生物素親和純化后質(zhì)譜分析[12，13＼]，得到修飾蛋白和位點(diǎn)信息。但這類方法操作繁瑣，富集效率受多步反應(yīng)的影響，內(nèi)源性生物素化蛋白等可能會帶來背景干擾，而且富集材料的理化性質(zhì)也會在很大程度上影響富集的效果。Camerini等[14＼]將SNO轉(zhuǎn)換成Histag標(biāo)簽，再利用鎳柱純化目標(biāo)蛋白，避免了內(nèi)源性生物素化蛋白等的干擾。另外，有機(jī)汞樹脂[15＼]、丙基硫氧嘧啶功能化的瓊脂糖樹脂[16＼]和金納米粒子[17＼]等能直接與巰基反應(yīng)的固相材料也被用于SNO化蛋白質(zhì)的富集，通過一步反應(yīng)即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的富集，操作更簡便快捷，避免了內(nèi)源性生物素化蛋白的干擾，進(jìn)而可提高富集效率。

為進(jìn)一步研究不同生理、病理?xiàng)l件下SNO蛋白質(zhì)的動態(tài)變化，相應(yīng)的基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的質(zhì)譜定量分析方法也得到了迅速發(fā)展，利用化學(xué)衍生、體內(nèi)代謝等方法在樣品中引入穩(wěn)定同位素標(biāo)簽如13C和18O等，通過比較含“輕”和“重”同位素標(biāo)簽的同一肽段的質(zhì)譜峰信號強(qiáng)度，可實(shí)現(xiàn)定量研究。因此，在BS方法的基礎(chǔ)上，Zhang等[18＼]用與巰基反應(yīng)的ICAT（Isotopecodedaffinitytag）試劑開展了亞硝基化定量蛋白質(zhì)組研究，發(fā)現(xiàn)37條肽段在正常小鼠和Ⅱ型糖尿病小鼠中具有不同的修飾水平；Zhou等[19＼]則利用SILAC（Stableisotopelabelingwithaminoacidsincellculture）技術(shù)定量比較了LPS/IFNγ誘導(dǎo)前后RAW264.7細(xì)胞中亞硝基化蛋白質(zhì)組。此外，iTRAQ（Isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation）[20＼]和iodoTMT（Iodoacetyltandemmasstag）[21＼]也相繼用于亞硝基化定量蛋白質(zhì)組研究中。這些標(biāo)記定量方法分析原理不同，各有優(yōu)缺點(diǎn)。SILAC為體內(nèi)代謝標(biāo)記方法，“重”同位素標(biāo)簽是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中引入的，因此可減少實(shí)驗(yàn)操作中帶來的誤差，但它不能用于臨床樣本等的定量分析。而ICAT、iTRAQ和iodoTMT標(biāo)記技術(shù)則可用于體外樣品的標(biāo)記定量，ICAT和iodoTMT是與巰基特異反應(yīng)的試劑，質(zhì)譜分析時，前者根據(jù)一級質(zhì)譜定量，后者利用二級質(zhì)譜定量；iTRAQ雖也屬二級質(zhì)譜定量，但它是與肽段氨基反應(yīng)進(jìn)行同位素標(biāo)記，因此需與SNO蛋白質(zhì)特異富集方法結(jié)合使用。此外，SILAC和ICAT能同時標(biāo)記的樣品數(shù)量相對較少，而iTRAQ和iodoTMT則能進(jìn)行6組甚至更多樣品的同時定量分析，提高了分析通量。實(shí)際上，這些富集和定量分析方法大多是通用的，與Cys上特定修飾（如亞磺酰化）的樣品預(yù)處理方法相結(jié)合，也同樣適用其它修飾的定性和定量分析，如Wojdyla等[22＼]利用iodoTMT試劑同時定量分析了氧化應(yīng)激狀態(tài)下大腸桿菌中亞硝基化和亞磺?；@兩種修飾及其位點(diǎn)占有率，并發(fā)現(xiàn)它們常會發(fā)生在同一位點(diǎn)上；Araki等[23＼]定量研究了還原（如DTT）和氧化（如H2O2）條件下細(xì)胞中不同Cys殘基的氧化還原敏感程度。

2.2半胱氨酸氧化（Cysteineoxidation）

Cys巰基是胞內(nèi)ROS的主要靶點(diǎn)，平均pKa≈8.5。受胞內(nèi)環(huán)境、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)、附近氨基酸的極性和帶電狀態(tài)等影響，不同蛋白質(zhì)巰基的pKa不同，對氧化修飾的敏感度也不同，通常pKa較低的巰基較易被氧化，可被選擇性氧化生成次磺酸（CysSOH）、亞磺酸（CysSO2H）、磺酸（CysSO3H）及分子內(nèi)/間二硫鍵（CysSSCys）[24＼]，其中次磺酸容易進(jìn)一步氧化成二硫鍵、亞磺酸或磺酸，成為“氧化還原開關(guān)”影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

亞磺?；揎棧⊿Sulfenylation，SOH）由Cys巰基與氧化劑如H2O2、HClO和羥自由基等反應(yīng)生成，S亞硝基硫醇（SNitrosothiol）也能水解產(chǎn)生亞磺?；揎?，對催化、信號傳導(dǎo)等都有重要作用。為高通量分析亞磺?；揎椀鞍踪|(zhì)，Saurin等[25＼]利用亞砷酸鹽將次磺酸還原變?yōu)閹€基，在BS方法的基礎(chǔ)上，建立了選擇性富集亞磺酰化修飾蛋白質(zhì)的方法。由于雙甲酮可作為次磺酸的特異受體，所形成的加合物可用于檢測蛋白質(zhì)中的次磺酸[26＼]，帶上生物素基團(tuán)便可實(shí)現(xiàn)選擇性富集[27＼]用于組學(xué)研究中。但生物素偶聯(lián)的雙甲酮對細(xì)胞膜的滲透性較低，因此Carroll等[28～30＼]發(fā)展了含炔基和疊氮基的雙甲酮類似物探針，再利用點(diǎn)擊化學(xué)結(jié)合質(zhì)譜分析研究了細(xì)胞內(nèi)亞磺?；揎椀鞍踪|(zhì)組，該類探針能直接標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)可能發(fā)生修飾的位點(diǎn)，且點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)效率高，提高了富集效率并減少了假陽性結(jié)果。為定量研究蛋白質(zhì)亞磺酰化修飾，Seo等[31＼]發(fā)展了基于雙甲酮穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑的質(zhì)譜定量分析方法，ElKhatib等[32＼]則利用含金屬離子的雙甲酮試劑建立了基于ICPMS（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry）的定量方法。

由于亞磺酸和磺酸的酸性極強(qiáng)，會明顯改變被修飾肽段的電荷特性，因此，Paulech等[33＼]發(fā)展了強(qiáng)陽離子交換和親水作用色譜聯(lián)用的分離純化方法，從心肌組織中鑒定到181個亞磺酸和磺酸化修飾位點(diǎn)。JP

二硫鍵（Disulfidebonds）是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式，發(fā)生在一級或高級結(jié)構(gòu)中相鄰的Cys殘基之間，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和生物活性至關(guān)重要。聯(lián)用不同的烷基化試劑，如先在非還原條件下用碘乙酰胺（IAM）標(biāo)記蛋白質(zhì)中原有自由Cys，加入還原劑打開二硫鍵后，再用N乙基馬來酰亞胺（NEM）等其它烷基化試劑封閉新產(chǎn)生的自由巰基，可在一定程度上通過烷基化標(biāo)簽的質(zhì)量數(shù)差異質(zhì)譜分析其中的二硫鍵[34＼]。自上而下（Topdown）的蛋白質(zhì)組技術(shù)是在質(zhì)譜儀上直接對完整蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，可提供完整蛋白質(zhì)更豐富的信息，因此，利用質(zhì)譜碎裂信息可獲取相關(guān)二硫鍵及其它翻譯后修飾的信息[35，36＼]。Scotcher等[37，38＼]將Topdown與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)聯(lián)用，通過定量測定Cys巰基的氧化還原電位，建立了Cys巰基氧化還原活性位點(diǎn)的分析新方法。由于譜圖復(fù)雜、解譜困難，上述分析方法僅適用于簡單樣品的分析。為此，Lu等[39＼]發(fā)展了精確解析復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)二硫鍵結(jié)構(gòu)的高通量分析方法，包括克服蛋白質(zhì)二硫鍵體外交換、保持其天然結(jié)構(gòu)的樣品制備方法，以及二硫鍵交聯(lián)肽段的最優(yōu)質(zhì)譜分析方法及配套的鑒定軟件pLinkSS，并開展了目前最大規(guī)模的蛋白質(zhì)二硫鍵組學(xué)研究。

為富集含二硫鍵的蛋白質(zhì)，BS方法也得到了廣泛應(yīng)用。采用還原劑打開二硫鍵后用帶生物素標(biāo)簽的烷基化試劑如biotinIAM、biotinHPDP等[40＼]標(biāo)記，可純化富集目標(biāo)蛋白/肽，用于質(zhì)譜分析；也可用熒光試劑如碘乙酰胺熒光素、Cy3/Cy5馬來酰亞胺等標(biāo)記，結(jié)合雙向凝膠電泳（2DE）分離進(jìn)行定量分析[41＼]。對于鄰位的兩個巰基（一級結(jié)構(gòu)中處于-CXnC-結(jié)構(gòu)域，n=2～6，或三級結(jié)構(gòu)中非常接近）形成的分子內(nèi)二硫鍵，可用對、鄰位二巰基特異的試劑氧化苯胂（PAO）先封閉臨近的兩個巰基，用NEM烷基化封閉其它巰基后，用2，3二巰基丙磺酸除去PAO，重新暴露鄰位二巰基，再進(jìn)行生物素化標(biāo)記純化或熒光試劑標(biāo)記結(jié)合2DE實(shí)現(xiàn)定性與定量分析[42＼]。其中ICAT試劑也常被用于二硫鍵的定量分析[43＼]。

2.3S谷胱甘肽化（Glutathionylation，proteinSSG）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是細(xì)胞內(nèi)含量豐富的一種含巰基小分子肽，是體內(nèi)重要的抗氧化劑和自由基清除劑，它可通過與蛋白質(zhì)Cys上的巰基形成二硫鍵使蛋白質(zhì)發(fā)生谷胱甘肽化修飾。這是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾形式，在基礎(chǔ)和氧化應(yīng)激狀態(tài)下均能發(fā)生，在信號傳導(dǎo)、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞氧化還原狀態(tài)調(diào)節(jié)等方面都發(fā)揮著重要作用，與心血管、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等相關(guān)[44＼]。

質(zhì)譜是分析蛋白質(zhì)及其翻譯后修飾狀態(tài)的有力工具，修飾前后蛋白質(zhì)/肽段分子量的變化以及串級質(zhì)譜中離子的碎片信息等，都能在一定程度上為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究提供證據(jù)[45＼]。Chen等[46＼]利用二級（MS2）和三級（MS3）譜圖信息分析了蛋白質(zhì)Hemoglobin上104，93和112位點(diǎn)上的谷胱甘肽化修飾及其修飾程度，發(fā)現(xiàn)20位吸煙者中Cys104和Cys93的谷胱甘肽化程度顯著高于20位不吸煙者，且修飾程度與吸煙者每天吸煙的數(shù)量和吸煙指數(shù)顯著相關(guān)。不同的質(zhì)譜碎裂模式下，產(chǎn)生的碎片離子信息不同，因此能為蛋白質(zhì)的鑒定分析提供的信息也不盡相同。Chou等[47＼]比較了谷胱甘肽化肽段在不同碎裂模式（CID，HCD，ETD）下的MS/MS碎裂行為，發(fā)現(xiàn)HCD能得到更多留有谷胱甘肽化肽段的碎片離子信息，側(cè)鏈中性丟失較少，有助于修飾位點(diǎn)的鑒定。另外，Topdown技術(shù)也在重要蛋白質(zhì)（如Ras、p53）的谷胱甘肽化等氧化修飾研究中發(fā)揮著越來越重要的作用[48～50＼]。

要分析復(fù)雜生物樣品中的谷胱甘肽化修飾蛋白質(zhì)組，則需選擇性富集純化后再進(jìn)行分析?，F(xiàn)有高通量的分析方法有兩類：（1）基于谷胱甘肽標(biāo)記的方法。利用生物素化谷胱甘肽類似物如還原型的BiotinGSH、氧化型的BiotinGSSG或谷胱甘肽乙酯（BiotinGEE）等[51＼]標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)，純化分離后進(jìn)行組學(xué)分析，Zaffagnini等[52＼]用BiotinGEE方法從C.reinhardtii中鑒定到225個谷胱甘肽化修飾蛋白質(zhì)。盡管能有效標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)，但外加的BiotinGSSG等可能會改變胞內(nèi)正常巰基含量及GSH/GSSG比例[53＼]，且GSSG并不是生理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)谷胱甘肽化的主要途徑，可能會使一些蛋白質(zhì)得不到分析。Chiang等[54＼]利用谷胱甘肽特異的酶（GspS）發(fā)展了一種可選擇性分析哺乳動物細(xì)胞中谷胱甘肽化蛋白質(zhì)的方法，該酶能將生物素化的多胺基團(tuán)連接到GSH上形成GSH衍生物，再利用生物素實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的分離純化。這是與常規(guī)富集方法不同之處，由于酶的催化效率高且專一性強(qiáng)，因此，可在很大程度上提高富集的特異性和效率。Samarasinghe等[55＼]發(fā)現(xiàn)將谷胱甘肽合成酶突變后，可高效、選擇性地催化帶疊氮基團(tuán)的Ala代替Gly，產(chǎn)生疊氮標(biāo)記的谷胱甘肽，進(jìn)而可利用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)接上生物素等，實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽化蛋白質(zhì)的特異、靈敏檢測。（2）基于谷氧還蛋白介導(dǎo)還原反應(yīng)（GRXmediatedreduction）的方法：谷氧還原蛋白是一種二硫鍵氧化還原酶，能特異切除與谷胱甘肽混合形成的二硫鍵，因此，NEM封閉樣品中自由巰基后，再用GRXs選擇性地還原產(chǎn)生新的自由巰基，最后利用含生物素等富集標(biāo)簽的巰基反應(yīng)試劑選擇性富集目標(biāo)蛋白/肽[56＼]，結(jié)合iTRAQ[57＼]和TMT[58＼]等標(biāo)記技術(shù)還能進(jìn)行定量分析。

34羥基壬烯酸（HNE）修飾

LDEs如HNE等是細(xì)胞代謝和脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，具有很高的生物反應(yīng)活性，能與蛋白質(zhì)上組氨酸、賴氨酸，尤其是Cys發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而改變蛋白質(zhì)的功能，甚至損傷細(xì)胞機(jī)制。

盡管通過分析修飾前后分子量的變化，可用質(zhì)譜直接檢測蛋白質(zhì)的HNE修飾[59＼]，但含HNE修飾的肽段在CID模式下通常會發(fā)生中性丟失（156Da）[60＼]，基于此，Rauniyar等[61＼]發(fā)展了基于中性丟失掃描質(zhì)譜直接分析HNE修飾及其位點(diǎn)的方法。Milic等[62＼]則利用7（二乙氨基）香豆素3甲酰肼特異衍生后，在正離子模式下產(chǎn)生特征的碎片離子，建立了HNE修飾肽段的分析方法。

為大規(guī)模分析HNE修飾蛋白質(zhì)組，Roe等[63＼]先用肼化學(xué)法富集，再聯(lián)用中性丟失掃描和Q值脈沖裂解（PulsedQdissociation，PQD）兩種質(zhì)譜掃描方式，鑒定了67個蛋白質(zhì)上的125個修飾位點(diǎn)。肼化學(xué)法是基于肼基與醛基間的反應(yīng)，由于非特異性吸附少，富集特異性高，在糖組學(xué)等領(lǐng)域中也應(yīng)用廣泛。Maier研究組[64，65＼]利用醛基與羥胺反應(yīng)生成肟的性質(zhì)，發(fā)展了HNE修飾蛋白質(zhì)組的選擇性富集新方法。與Cys上其它修飾類似，生物正交法也得到了廣泛的應(yīng)用，Porter研究組[66，67＼]以含疊氮或炔基的HNE衍生物為分子探針，經(jīng)施陶丁格連接或點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)連接上生物素后進(jìn)行分離富集，建立了高通量分析HNE修飾蛋白質(zhì)組的方法。

為定量研究HNE修飾蛋白質(zhì)組，Han等[68＼]設(shè)計(jì)了酰肼功能化的同位素親和標(biāo)簽（Hydrazidefunctionalizedisotopecodedaffinitytag，HICAT），利用酰肼與醛基的反應(yīng)選擇性標(biāo)記目標(biāo)蛋白質(zhì)，利用“輕”（12C）或“重”（13C）同位素進(jìn)行質(zhì)譜相對定量，但該標(biāo)記試劑只能提供輕重兩種標(biāo)記。Yang等[69＼]利用一種光可裂解的含炔基HNE類似物發(fā)展了選擇性富集HNE修飾蛋白質(zhì)的方法，并利用該類似物中輕重同位素標(biāo)簽，從RKO細(xì)胞中鑒定并定量了398個含炔基HNE類似物的蛋白質(zhì)，其中386個發(fā)生在Cys上。此外，iTRAQ[70＼]、琥珀?；痆71＼]和二甲基[72＼]標(biāo)記也被用于HNE修飾定量蛋白質(zhì)組的研究中。

4S棕櫚?；揎棧⊿Palmitoylation）

蛋白質(zhì)的S棕櫚?；揎梉73＼]，即S?；揎棧⊿Acylation），通常是指16碳飽和脂肪酸在S?；D(zhuǎn)移酶的作用下通過硫酯鍵共價修飾到蛋白質(zhì)Cys殘基上形成的。它是一種動態(tài)、可逆的脂質(zhì)修飾，通過增加蛋白質(zhì)的疏水性，調(diào)控蛋白質(zhì)（如離子通道和激酶等）的結(jié)構(gòu)、組裝、成熟及其功能，對細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝和疾病的發(fā)生、發(fā)展等都起著重要作用。

棕櫚酰化修飾基團(tuán)不穩(wěn)定，在樣品制備和質(zhì)譜分析過程中易丟失。Ji等[74＼]考察了不同實(shí)驗(yàn)條件（如反應(yīng)溫度、試劑等）和質(zhì)譜碎裂模式（CID，HCD，ECD和ETD）下棕櫚?；揎楇亩蔚姆€(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在常規(guī)的胰酶酶解條件下便可導(dǎo)致修飾基團(tuán)的明顯丟失，相比于其它碎裂模式，ETD更適于直接鑒定棕櫚酰化修飾肽段。盡管已有利用質(zhì)譜方法直接檢測棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)的報(bào)道[75＼]，但也只限于簡單樣品的分析。目前用于大規(guī)模分離富集棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組的方法主要有兩類，一是?；锼刂脫Q（Acylbiotinylexchange，ABE）[76，77＼]及其衍生方法[78，79＼]，即將蛋白質(zhì)Cys殘基上的自由巰基烷基化封閉后，利用羥胺溶液選擇性水解，在棕櫚?；揎椢稽c(diǎn)處產(chǎn)生新的自由巰基，再與巰基特異的生物素化試劑反應(yīng)后進(jìn)行生物素親和純化或直接利用固相載體富集后進(jìn)行組學(xué)分析；另一類則是基于疊氮[80＼]或炔基[81＼]棕櫚酸類似物代謝標(biāo)記的方法，結(jié)合點(diǎn)擊化學(xué)可實(shí)現(xiàn)高通量的棕櫚?；揎椀鞍踪|(zhì)組定性（含位點(diǎn)確定）甚至定量分析。本研究組也曾對此進(jìn)行過綜述[82＼]。

5S異戊烯化（SPrenylation）

異戊烯化修飾是一種重要的脂質(zhì)修飾，是法尼基（Farnesyl，C15）或牻牛兒牻牛兒基（Geranylgeranyl，C20）通過硫酯鍵連接到蛋白質(zhì)C末端附近保守的CaaX結(jié)構(gòu)域（a指脂肪族氨基酸，X通常為絲氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、谷氨酸或亮氨酸）或雙Cys結(jié)構(gòu)域（CC/CXC，X為任意氨基酸）的Cys殘基上形成的，由法尼基轉(zhuǎn)移酶（FTase）和牻牛兒牻牛兒基轉(zhuǎn)移酶Ⅰ和Ⅱ（GGTaseⅠ和Ⅱ）[83＼]調(diào)控，形成法尼基化（Farnesylation）和牻牛兒牻牛兒基化（Geranylgeranylation）修飾，廣泛存在于動物、植物和真菌，在蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位、信號傳導(dǎo)等方面有重要作用。

法尼基化修飾肽段在質(zhì)譜碎裂過程中會產(chǎn)生204Da的中性丟失[84＼]，在反相色譜中具有更強(qiáng)的保留，可與非修飾肽段分離[85＼]。Bhawal等[86＼]利用H2O2或間氯過氧苯甲酸將異戊烯化肽段氧化，在修飾位點(diǎn)處會產(chǎn)生巰脂鍵，再利用亞砜基在氣相中可斷裂而產(chǎn)生特征串級譜圖的性質(zhì)，發(fā)展了一種研究蛋白質(zhì)異戊烯化修飾的新方法，通過特征的質(zhì)量丟失可在一次實(shí)驗(yàn)中鑒定并區(qū)分法尼基化和牻牛兒牻牛兒基化肽段。此外，Topdown技術(shù)也被用于異戊烯化修飾蛋白質(zhì)的研究中[87＼]。

為大規(guī)模富集和分析異戊烯化修飾蛋白質(zhì)組，Nguyen等[88＼]以生物素牻牛兒焦磷酸（BGPP）為脂質(zhì)供體，構(gòu)建了一整套哺乳動物蛋白質(zhì)異戊烯轉(zhuǎn)移酶選擇性地將BGPP連接到異戊烯化底物中用于分離分析胞內(nèi)異戊烯化蛋白質(zhì)的方法。為減小生物素對蛋白質(zhì)的膜定位和下游信號傳導(dǎo)的干擾，研究者們進(jìn)一步發(fā)展了以炔基或疊氮類似物為報(bào)告基團(tuán)[89＼]的分析方法，Chan等[90＼]用azidoGG類似物為探針發(fā)展了牻牛兒牻牛兒基化蛋白質(zhì)組的方法。由于炔基探針比疊氮的靈敏度更高，背景標(biāo)記少[91＼]，Charron等[92，93＼]設(shè)計(jì)合成了炔基法尼醇（alkFOH）為報(bào)告基團(tuán)用于異戊烯化蛋白質(zhì)組的分析。

6展望

Cys作為蛋白質(zhì)組成序列中一個重要且特殊的氨基酸，正被越來越多的研究者關(guān)注，但Cys殘基含量較低，被修飾的Cys豐度更低；Cys巰基反應(yīng)活性高，修飾類型多樣，受環(huán)境影響大，且常存在Crosstalk，大大增加了Cys翻譯后修飾組研究的難度。與其它方法相比，質(zhì)譜技術(shù)能直接分析多種翻譯后修飾的類型及位點(diǎn)，與分離富集方法和同位素標(biāo)記等技術(shù)相結(jié)合，還能進(jìn)行大規(guī)模地定性和定量分析，在（修飾）蛋白質(zhì)組學(xué)研究中具有非常重要的地位。因此，現(xiàn)代質(zhì)譜儀器、各種質(zhì)譜碎裂技術(shù)（如CID，HCD，ECD和ETD）、分析策略（如Topdown）和分析軟件等的發(fā)展，都極大地促進(jìn)了Cys修飾組的研究。由于這些修飾都發(fā)生在Cys上，所以無論是定性還是定量方法大多是通用的，先將樣品中自由巰基烷基化封閉，再用特定的還原劑還原特定的修飾獲得新的自由巰基，然后利用合適的試劑衍生、分離純化，進(jìn)行定性與定量分析。需要指出的是，利用生物正交反應(yīng)結(jié)合質(zhì)譜分析進(jìn)行Cys修飾組研究是近年的重要進(jìn)展，也仍將是今后的研究熱點(diǎn)。相信隨著各項(xiàng)技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，Cys上的翻譯后修飾組分析方法必將得到迅速地發(fā)展，為進(jìn)一步理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能提供更有力的支持。

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AbstractCysteinethiolshavehighreactionactivityandplaysignificantrolesinproteinstructuresandfunctionsasthesitesofnucleophilic，redoxcatalysis，metalbindingandallostericregulation.Duetothereactivityofthethiolgroup，cysteineresiduesareverypronetoposttranslationalmodifications（PTMs）suchasoxidation，lipidation，andsoon，whichcanregulate/damageproteinfunctionsandareassociatedwithmanydiseases.Thus，itisveryimportanttoqualitativelyandquantitativelyanalyzePTMsinthecysteineresiduesforfurtherunderstandingitsbiologicalfunctions.Thisreviewmainlyfocusesonthedevelopmentofmassspectrometricandhighthroughputproteomicapproachesforinvestigatingsomecommoncysteineposttranslationalmodifications.

KeywordsCysteine；Posttranslationalmodifications；Massspectrometry；Proteomics；Review

HQWT6JY（Received23August2016；accepted26September2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21205018，21335002）