夏美娟，宦才輝，姜婷，鄭兆娟，歐陽嘉,2*

(1.南京林業(yè)大學化學工程學院；2.南京林業(yè)大學林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京210037)

凝結(jié)芽孢桿菌N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因的克隆鑒定及酶學性質(zhì)

夏美娟1，宦才輝1，姜婷1，鄭兆娟1，歐陽嘉1,2*

(1.南京林業(yè)大學化學工程學院；2.南京林業(yè)大學林木遺傳與生物技術(shù)省部共建教育部重點實驗室，南京210037)

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)是微生物幾丁質(zhì)酶系中不可缺少的一部分，近年來由于其在幾丁質(zhì)降解過程中的特殊作用而受到關注。筆者從凝結(jié)芽孢桿菌NL01基因組上克隆獲得了1個假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因，長度為1 761 bp，編碼586個氨基酸，蛋白質(zhì)理論分子量為64.5 kDa，編碼氨基酸序列與已報道的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相似性僅為38%。將該基因克隆至表達載體pETDuet-1上，并在大腸桿菌 BL21(DE3)中進行重組表達，結(jié)果顯示重粗酶具有N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力，經(jīng)鎳柱純化獲得純酶的比酶活為74.3 U/mg。對重組酶酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，該酶是一種新型耐高溫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶。最適pH為5.5，最適溫度為75℃，pH和熱穩(wěn)定性較好，在pH 3.5～7.5范圍內(nèi)比較穩(wěn)定，在不高于65℃條件下熱處理30 min后，酶活力可以保持在70%以上。

凝結(jié)芽孢桿菌；N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；表達純化；酶學性質(zhì)

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-β-D-glucosaminidase，NAGase)是幾丁質(zhì)酶系中不可缺少的一部分，主要負責催化水解β-1,4-糖苷鍵生成N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷。它的底物包括殼二糖及其聚合物和衍生物[1]，多發(fā)現(xiàn)于糖苷水解酶家族GH20[2]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶近年來由于應用意義顯著，被廣泛研究。已有研究表明，昆蟲和甲殼動物體內(nèi)的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶參與降解食物和周期性蛻殼[3]；真菌中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶與真菌細胞分裂和形態(tài)的形成相關[4]；植物中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶有抑菌防御作用[5]；細菌中的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶可以降解幾丁質(zhì)作為碳源和能量來源[6]。目前，N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶研究多集中于動物來源，在植物中玉米籽[7]真菌的粗糙脈孢菌[8]和里氏木霉[1]中也有發(fā)現(xiàn)，但來源于細菌的較少，主要存在于枯草芽孢桿菌[9]和乳酸乳球菌[10]。其中，鯉魚血液來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶最適pH為6.5，在pH 7.0～11.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，是一種偏堿性的酶[11]；南美白對蝦來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶最適pH為5.2，在pH 4.2～10.0的范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，在20～40℃酶活力穩(wěn)定，是一種常溫的酶[12]。

筆者對實驗室保存的1株凝結(jié)芽孢桿菌NL01測序過程發(fā)現(xiàn)其上存在假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因，鑒于細菌來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶研究較少，本研究通過PCR技術(shù)擴增獲得該假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因，將其構(gòu)建到表達載體pETDuet-1上，在大腸桿菌表達宿主BL21(DE3)中進行誘導表達，并對重組蛋白的酶學性質(zhì)進行分析，為進一步研究其對凝結(jié)芽孢桿菌的生長影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

目的基因來源菌BacilluscoagulansNL01、克隆宿主菌EscherichiacoliTrans1-T1、表達宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)由本實驗室保存?；蚩寺≥d體pEASY-Blunt Simple(氨芐青霉素抗性)、Fast Pfu DNA聚合酶和購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；基因表達載體pETDuet-1(氨芐青霉素抗性)購自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI購自Takara公司；T4DNA連接酶購自New England Biolabs(北京)公司；DNA膠回收試劑盒購自Promega公司；質(zhì)粒提取試劑盒和細菌基因組提取試劑盒購自上海捷瑞生物工程有限公司；Tryptone、Yeast Extract購自Oxoid公司； 4-硝基苯-β-D-葡萄糖苷(4-nitrophenyl-β-D-glucoside,pNPG)，4-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(4-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide,pNPNAc)，4-硝基苯酚(4-nitrophenol,pNP)均購自Sigma公司；鎳柱購自GE Healthcare公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 引物設計

參考已完成全基因組測序的凝結(jié)芽孢桿菌NL01(GenBank登錄號：NZ_LBMQ01000001.1)的全基因組DNA序列設計上下游引物，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

上游引物ghf3.f：5′-GCGGAATTCGATGAA-AAGATCCGGAT-3′(EcoR I)和下游引物ghf3.r：5′-ACTCTCGAGTTAGTAATGAAGACCGTG-3′(XhoI)。

1.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

用于培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌NL01的液體培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：葡萄糖20 g/L、Yeast Extract 10 g/L，在50℃、100 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。

用于培養(yǎng)大腸桿菌的LB培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件：Tryptone 10 g/L、氯化鈉10 g/L、Yeast Extract 5 g/L，在37℃、200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。固體培養(yǎng)基為液體培養(yǎng)基中加入終濃度為15 g/L的瓊脂粉。

1.4 目的基因的擴增及測序

提取凝結(jié)芽孢桿菌NL01的全基因組作為PCR反應的模板，以ghf3.f和ghf3.r為引物PCR擴增目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳驗證后，連接到pEASY-Blunt Simple載體上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTrans1-T1，在含有氨芐青霉素抗性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子試管培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒命名為Blunt Simple-ghf3，經(jīng)雙酶切驗證后送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.5 重組N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的表達與純化

利用限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI同時雙酶切重組質(zhì)粒Blunt Simple-ghf3和pETDuet-1，膠回收相應片段后用T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)，在含氨芐青霉素抗性平板上挑選陽性轉(zhuǎn)化子試管培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證，將驗證正確的重組菌株命名為E.coliBL21(pETDuet-ghf3)。培養(yǎng)重組菌株至D(600)達到0.8時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，25℃條件下誘導6 h，收集菌體，用超聲波破碎菌體后離心，所得上清即為粗酶液。將粗酶液通過Ni2+親和柱純化，用不同梯度的洗脫緩沖液洗脫，收集目的蛋白組分，進行SDS-PAGE鑒定。

1.6 測定方法

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶活測定方法：反應體系總體積為1 mL，分別加入600 μL 0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉配成的緩沖溶液(pH 5.5)，300 μL 15 mmol/L的pNPNAc溶液以及100 μL適當稀釋的酶液，混合均勻后在75℃條件下水浴10 min后，立即加入2 mL 1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應。在400 nm波長處測定吸光值，根據(jù)pNP標準曲線確定pNP的生成量，1個酶活力單位定義為1 min內(nèi)催化水解生成1 μmolpNP所需要的酶量[13]。

Bradford法測定蛋白濃度：取要測定的樣品0.1 mL，加入3 mL Bradford，混合均勻，13 min后，以水溶液為空白對照，595 nm處測定其吸光度。將測得的吸光值代入標準曲線中得到樣品的蛋白濃度。

1.7 酶學性質(zhì)分析

為了測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的最適pH，在pH 3.0～8.0的范圍內(nèi)測定其酶活，所用緩沖液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液。為了測定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的最適溫度，在45～95℃的范圍內(nèi)測定其酶活。為了測定酶的pH穩(wěn)定性，將酶液置于不同pH的緩沖液中，4℃下放置24 h后測定殘留酶活。為了測定酶的溫度穩(wěn)定性，將酶液置于不同溫度下孵育30 min，測定殘留酶活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因的克隆和測序

以凝結(jié)芽孢桿菌NL01的基因組為模板，PCR擴增得到假定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因。將得到的PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt Simple載體后轉(zhuǎn)化至E.coliTrans1-T1中，從抗性篩選平板上選取轉(zhuǎn)化子，試管培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒Blunt Simple-ghf3，雙酶切驗證，結(jié)果如圖1所示，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在3.9和1.7 kb附近出現(xiàn)條帶，與預期一致，說明轉(zhuǎn)化子含有正確的重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒送樣測序。

注：泳道1為來自轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒。圖1 雙酶切后的重組質(zhì)粒Blunt-ghf3Fig. 1 Recombinant plasmid Blunt-ghf3 double digested by EcoR I and Xho I

2.2 N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶序列分析

測序結(jié)果顯示，來源于凝結(jié)芽孢桿菌NL01的假定N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因序列全長1 761 bp，編碼586個氨基酸。根據(jù)Henrissat建立的糖苷水解酶家族分類方法，屬于GH-3家族，目前已經(jīng)鑒定的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大多屬于GH-20家族[2]，尚未見報道屬于GH-3家族。將不同來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶氨基酸序列進行同源性比對，結(jié)果如圖2所示，該基因編碼蛋白與已報道的真核生物來源的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶，如來源于Litopenaeusvannamei(GenBank登錄號為ACR23316.1)[11]、Triboliumcastaneum(GenBank登錄號為ABQ95982.1)[14]和TrichodermareeseiQM6a/Rutc30(GenBank登錄號為EGR50812.1)[1]的相似性低于40%；與細菌來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，如來源于Bacillusanthracis(GenBank登錄號為AAT55709.1)[15]、Bacillussubtilis168(GenBank登錄號為AAA67857.1)[7]的相似性低于20%。而與NCBI數(shù)據(jù)庫里公布的凝結(jié)芽孢桿菌HM-08和S-lac基因組上注釋的假定的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶同源相似性達到95%。比對數(shù)據(jù)表明,本研究中凝結(jié)芽孢桿菌NL01來源的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶可能是一種新型的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶，該酶在不同凝結(jié)芽孢桿菌菌株中普遍存在。

注：1.凝結(jié)芽孢桿菌NL01. Bacillus coagulans NL01；2.南美白對蝦 Litopenaeus vannamei (ACR23316.1)；3.擬谷盜屬 Tribolium castaneum (ABQ95982.1)；4.里氏木霉 Trichoderma reesei (EGR50812.1)。圖2 假定編碼的氨基酸序列與其他N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶序列同源性分析(催化殘基以△標記)Fig. 2 Homology analysis of deduced amino acid sequences from Bacillus coagulans NL01 and the other N-acetyl-β-D-glucosaminidase

2.3 重組質(zhì)粒pETDuet-ghf3的構(gòu)建和鑒定

注：泳道1為來自轉(zhuǎn)化子的重組質(zhì)粒。圖3 雙酶切后的重組質(zhì)粒pETDuet-ghf3Fig. 3 Recombinant plasmid pETDuet-ghf3 double digested by EcoR I and Xho I

用EcoR I和XhoI雙酶切pETDuet-1和Blunt Simple-ghf3，膠回收相應片段后連接并轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)中，從抗生素平板上選取轉(zhuǎn)化子，試管培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒pETDuet-ghf3，進行雙酶切驗證，結(jié)果如圖3所示，重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在5.4和1.7 kb附近出現(xiàn)條帶，說明轉(zhuǎn)化子含有正確質(zhì)粒。

2.4 重組N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的誘導表達與純化

注：泳道M為標準蛋白分子量，kDa；泳道1為重組大腸桿菌BL21(pETDuet-ghf3)誘導后的破碎液；泳道2～5分別為以0%，20%，60%和100%洗脫液洗脫的重組蛋白。圖4 重組蛋白的SDS-PAGE電泳Fig. 4 SDS-PAGE electrophoresis of recombinant protein

將重組菌E.coliBL21(pETDuet-ghf3) 誘導表達后進行超聲波破碎，利用鎳柱對重組蛋白進行純化，結(jié)果如圖4所示，目的蛋白分子質(zhì)量約為66.0 kDa。分別以pNPG和pNPNAc為底物，利用1.6測定方法檢測重組酶酶活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以pNPG為底物沒有酶活，而以pNPNAc為底物測得粗酶液比酶活5.0 U/mg，經(jīng)鎳柱純化獲得的純酶的比酶活74.3 U/mg，純化倍數(shù)為14.9倍。

2.5 重組N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶酶學性質(zhì)分析

以pNPNAc為底物來確定重組N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的最適pH。在pH 5.5條件下測得最高的酶活力，并且在pH 4.5～6.5范圍內(nèi)可以得到的酶活力在60%以上。將不同pH的緩沖液與酶液等量混合后，4℃條件下靜置24 h，將處理過的酶液取出適量在pH 5.5、75℃條件下檢測殘余酶活力，殘余酶活力以初始酶活力的相對百分數(shù)表示。結(jié)果顯示，在pH 3.5～7.5范圍內(nèi)，重組酶的穩(wěn)定性非常好，殘余酶活力在80%以上(圖5a)。

同時，本研究還探討了溫度對酶活力的影響。將酶液在40～75℃溫度范圍內(nèi)熱處理30 min后迅速冷卻至室溫，然后取出適量酶液在pH 5.5、75℃條件下檢測酶的殘余酶活力，殘余酶活力以初始酶活力的相對百分數(shù)表示。試驗結(jié)果顯示，酶在65℃以下處理30 min，酶活力基本保持在70%以上，在溫度為75℃的條件下測得最高的酶活力。(圖5b)。

此外，本研究還探討了不同金屬離子對酶活力的影響。在酶活測定體系中分別添加終濃度為2 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Co2+、Mn2+、Cu2+、Ni2+和Fe2+。在最適溫度75℃和最適pH 5.5的條件下測定，同時設置空白對照。結(jié)果顯示，不同的金屬離子對酶活力影響有差異，其中，Mn2+和Fe2+對酶有輕微的促進作用，Cu2+和Ca2+有輕微的抑制作用，Mg2+、Co2+和Ni2+對酶活力影響不大(圖5c)。

圖5 重組N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶的酶學分析Fig. 5 The enzymological characteristics of N-acetyl-β-D-glucosaminidase

在報道的細菌來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶當中，來源于乳酸乳球菌IL1403的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的最適pH為5.5，酸堿穩(wěn)定區(qū)域pH為5.5～8.0，酶在pH低于5.5的條件下不穩(wěn)定；最適溫度為37℃，酶在50℃條件下熱處理30 min后的酶活性完全喪失[10]。來源于芽孢桿菌NCIM 5120的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的最適pH為6.0，在pH 5.5～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，最適溫度為70℃[16]。本研究中來源于凝結(jié)芽孢桿菌的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶最適pH為5.5，在pH 3.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好，與上述來源于芽孢桿菌NCIM 5120的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相比耐酸性更好；本研究中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶最適溫度為75℃，酶在65℃以下熱處理30 min后的穩(wěn)定性較好，與上述來源于乳酸乳球菌IL1403的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相比耐熱性更高。

3 結(jié) 論

1)鑒定了來自于凝結(jié)芽孢桿菌NL01的一種新型N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因，該基因全長1 761 bp，其編碼的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶屬于糖苷水解酶GH-3家族，與已報道的其他微生物來源的N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶相似性極低。

2)以大腸桿菌為表達宿主菌，將N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因連接到表達載體pETDuet-1上，構(gòu)建重組菌株后進行異源表達，并利用鎳柱純化獲得重組蛋白，結(jié)果顯示重組酶是一種新型耐高溫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，純酶比酶活為74.3 U/mg；該酶在65℃以下熱處理30 min后穩(wěn)定性較好，在pH 3.5～7.5范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。

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Molecular cloning and enzymological characteristics of a novelN-acetyl-β-D-glucosaminidase fromBacilluscoagulans

XIA Meijuan1, HUAN Caihui1, JIANG Ting1, ZHENG Zhaojuan1, OUYANG Jia1,2*

(1. College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University;2. Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology of Ministry of Education, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)

Chitin, an unbranched homopolymer of 1,4-β-linked N-acetyl-D-glucosamine (GlcNAc), is widely distributed and believed to be the second most abundant and renewable source in nature, next to cellulose. Chitinases, chitin-degrading enzymes are mainly composed of chitobiosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase,β-D-glucosaminidase and chitosanase. As an indispensable member of the chitinolytic system and involved in chitin degradation, N-acetyl-β-D-glucosaminidase (NAGase) catalyzes the hydrolysis ofβ(1-4) linked N-acetylglucosaminyl residues from glycol-conjugates at the non-reducing end, producing different lengths of GlcNAc. The NAGase is widely distributed among most types of living organisms and has numerous biological functions. Bacterial NAGase has a crucial physiological role in cell wall recycling, even in altering the function of the host cell. In recent years, NAGase has been extensively studied due to its significance in many fields. In this study, theBacilluscoagulansgenome was used as the template to amplify the putative N-acetyl-β-D-glucosaminidase gene, whose length is 1 761 bp. It encodes 586 amino acids and the theoretical molecular weight mass is 64.5 kDa. The results of amino acid sequence analysis showed that the enzyme had a very low similarity with the reported N-acetyl-β-D-glucosaminidase, only 38%. The gene was cloned into pETDuet-1 and expressed inEscherichiacoliBL21(DE3). The crude enzyme had N-acetyl-β-D-glucosaminidase activity and the purified specific activity was 74.3 U/mg after Ni-NTA purification. The optimal pH and temperature is 5.5 and 75℃, respectively. Enzymological characteristics showed that the enzyme was stable in a range of pH from 3.5 to 7.5. The enzyme activity remained more than 70% after incubation for 30 min below 65℃. A low-level inhibition of N-acetyl-β-D-glucosaminidase (15.1%) was observed with Cu2+(2 mmol/L), and a low-level promotion of N-acetyl-β-D-glucosaminidase (10.7%) and (13.5%) was observed with Mn2+and Fe2+(2 mmol/L), resepectively. These results indicated that the N-acetyl-β-D-glucosaminidase is a new type of N-acetyl-β-D-glucosaminidase with thermo stability.

Bacilluscoagulans; N-acetyl-β-D-glucosaminidase; cloning and expression; enzymological characteristics

2016-06-27

2016-09-30

國家自然科學基金(51561145015，31300487)；江蘇省自然科學基金(BK20130970)。

夏美娟，女，研究方向為生物化工。通信作者：歐陽嘉，女，教授。E-mail:hgouyj@njfu.edu.cn

Q812

A

2096-1359(2017)02-0070-06