毛欣欣，何琳燕，王 琪，盛下放

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

具礦物風(fēng)化效應(yīng)伯克霍爾德氏菌的篩選與生物學(xué)特性研究①

毛欣欣，何琳燕，王 琪，盛下放*

(農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

從鉀質(zhì)粗面巖表面和野青茅根、根際和非根際土壤中分離篩選到10株具礦物風(fēng)化效應(yīng)的伯克霍爾德氏菌，通過(guò)菌株16S rDNA序列分析，10株伯克霍爾德氏菌分別屬于6個(gè)種群，同時(shí)研究了伯克霍爾德氏菌對(duì)鉀長(zhǎng)石和黑云母的溶解效應(yīng)與菌株的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，分離自不同生境伯克霍爾德氏菌對(duì)硅酸鹽礦物的風(fēng)化能力不同，供試伯克霍爾德氏菌從鉀長(zhǎng)石中釋放出的Si、K、Ca分別比對(duì)照增加了23.7% ~ 119%、12.6% ~ 40.3% 和18.7% ~ 57.9%，從黑云母中釋放出的Si、K、Ca分別比對(duì)照增加了86.4% ~ 876%、5.6 ~ 14.6倍和70% ~ 147%；其中菌株g6從鉀長(zhǎng)石中釋放Si、K、Ca的能力最強(qiáng)，菌株G31從黑云母中釋放K、Ca的能力最強(qiáng)，而菌株R22從黑云母中釋放Si的能力最強(qiáng)。在鉀長(zhǎng)石和黑云母存在條件下接種伯克霍爾德氏菌處理的發(fā)酵液pH分別為3.05 ~ 4.67和7.03 ~ 7.43。不同伯克霍爾德氏菌產(chǎn)鐵載體能力不同，而且對(duì)溫度、pH和鹽濃度具有一定的耐受性。

伯克霍爾德氏菌株；硅酸鹽礦物；礦物溶解；生物學(xué)特性

硅酸鹽礦物是土壤中礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的重要來(lái)源[1]。礦物中的營(yíng)養(yǎng)元素如Si、K、Ca等在礦物風(fēng)化后成為有效態(tài)，可以為植物直接吸收利用。微生物–硅酸鹽礦物相互作用是地球上廣泛發(fā)生的一種地質(zhì)作用，微生物作用下硅酸鹽礦物的風(fēng)化作用是表生環(huán)境中普遍存在的地球化學(xué)過(guò)程[2]。研究表明，細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生的有機(jī)酸、胞外多聚物以及鐵載體等破壞礦物的晶格結(jié)構(gòu)，釋放出其中的營(yíng)養(yǎng)元素[3–5]。細(xì)菌對(duì)于土壤礦物的溶解，對(duì)于巖石風(fēng)化、元素生物地球化學(xué)循環(huán)、土壤形成以及土壤肥力的維持有重要的作用，同時(shí)在長(zhǎng)時(shí)間尺度上對(duì)土壤環(huán)境和大氣CO2產(chǎn)生重要的影響[6–10]。

伯克霍爾德氏菌(Burkholderia spp.)廣泛分布于各種生態(tài)環(huán)境中。雖然細(xì)菌分解硅酸鹽礦物及其機(jī)制的研究已有不少報(bào)道[11–15]，但從鉀質(zhì)粗面巖表面和生長(zhǎng)在礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物野青茅根、根際和非根際土壤中分離篩選高效風(fēng)化硅酸鹽礦物的伯克霍爾德氏菌并研究其對(duì)礦物溶解效能和生物學(xué)特性等至今未見報(bào)道。本研究采用高效選擇性培養(yǎng)基，從鉀質(zhì)粗面巖表面和野青茅根、根際和非根際土壤中分離篩選高效礦物分解伯克霍爾德氏菌，并比較不同菌株溶解硅酸鹽礦物的效能和生物學(xué)特性，豐富礦物風(fēng)化細(xì)菌資源庫(kù)，同時(shí)為提高土壤礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。

1 材料與方法

1.1 硅酸鹽礦物和培養(yǎng)基

鉀長(zhǎng)石(購(gòu)自煙臺(tái)市華威礦業(yè)有限公司)元素組成：SiO263.6%，K2O 13.5%，Al2O318.4%，F(xiàn)e2O31.7%，MgO 0.1%，CaO 0.04%；黑云母(購(gòu)自河北華源云母廠)元素組成：SiO239.9%，K2O 9.1%，Al2O318.9%，F(xiàn)e2O314.7%，MgO 13.6%，CaO 0.07%。礦物樣品經(jīng)粉碎、研磨和過(guò)篩，收集100 ~ 300 目顆粒，用去離子水超聲波清洗后，在pH = 4 的鹽酸溶液中浸泡24 h，再用去離子水超聲清洗若干次，直至溶液澄清并且pH達(dá)到7.0，烘干備用。

BHm 培養(yǎng)基：150 mg MgSO4×7H2O，80 mg NaH2PO4，90 mg Na2HPO4，65 mg (NH4)2SO4，20 mg CaCl2，2 g葡萄糖，1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0；LB培養(yǎng)基：10 g 胰蛋白胨，5 g 酵母粉，10 g 氯化鈉，1 L 蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0；有氮培養(yǎng)基：10 g 蔗糖，2 g K2HPO4，1 g (NH4)2SO4，0.5 g MgSO4×7H2O，0.1 g NaCl, 0.5 g 酵母粉, 1 L蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至7.0。

1.2 菌株分離與純化

采用低鉀選擇性培養(yǎng)基(有氮培養(yǎng)基中的 K2HPO4替換成等量的 Na2HPO4)按文獻(xiàn)[16–17]分離。鉀質(zhì)粗面巖和礦區(qū)優(yōu)勢(shì)植物野青茅樣品采自南京小龍山鉀礦區(qū)(118° 45′E，31°47′N)。采用稀釋涂布法分離鉀質(zhì)粗面巖表面和野青茅根際和非根際土壤細(xì)菌；野青茅根內(nèi)生細(xì)菌分離：滅菌剪刀取植株根部和地上部，自來(lái)水將根部清洗干凈，無(wú)菌水再清洗一遍，75% 乙醇浸泡3 min后，無(wú)菌水沖洗一遍，2.5% 次氯酸鈉浸泡 2 min，無(wú)菌去離子水沖洗3次。將表面消毒的根置于無(wú)菌研缽內(nèi)研磨后取勻漿液涂布在低鉀選擇性培養(yǎng)基平板上，同時(shí)取最后一次浸洗的無(wú)菌水100 μl涂布于低鉀選擇性培養(yǎng)基平板上，以檢測(cè)樣品表面消毒是否徹底。從平板上隨機(jī)挑取細(xì)菌單菌落，純化后保存待用。

1.3 供試菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石的溶解效應(yīng)

貧營(yíng)養(yǎng)BHm培養(yǎng)基作為礦物溶解試驗(yàn)培養(yǎng)基，以發(fā)酵液中有效 Al含量的增加作為鉀長(zhǎng)石溶解的標(biāo)志。150 ml塑料瓶中分裝30 ml BHm培養(yǎng)基，加入0.15 g鉀長(zhǎng)石粉，115℃滅菌30 min，將供試菌株分別接種于2 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 ~ 16 h，離心(6 000 r/min，5 min)收集菌體后，用無(wú)菌水洗滌2次后重懸于無(wú)菌水中，調(diào)整其OD600為0.8左右，接種于每一只塑料瓶中，同時(shí)設(shè)不接菌處理為對(duì)照，28℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)7天后分析發(fā)酵液中有效Al含量，以篩選高效溶解鉀長(zhǎng)石的細(xì)菌菌株。發(fā)酵液中有效Al含量的測(cè)定：將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液用電感耦合等離子發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測(cè)定溶液中Al的含量。

1.4 礦物風(fēng)化細(xì)菌的鑒定與伯克霍爾德氏菌株的篩選

將具有礦物風(fēng)化能力的菌株用LB培養(yǎng)基活化，提取細(xì)菌基因組總DNA并以其為模板，采用細(xì)菌通用引物(27F/1492R)擴(kuò)增其16S rRNA基因片段，擴(kuò)增體系25 μl：2×Taq mix(包含5 U/μl DNA polymerase、DNA polymerase buffer和2.5 mmol/L dNTP)12 μl，10 mmol/L引物各0.5 μl，DNA模板1 μl，用水補(bǔ)足至25 μl。擴(kuò)增條件如下：94℃ 預(yù)變性3 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將上述擴(kuò)增得到的 16S rRNA基因片段用Axygen PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化，取純化產(chǎn)物2.5 μl于EP管中，加入0.3 μl pEASY T3載體，用水補(bǔ)足至5 μl，25℃ 連接10 min，將連接產(chǎn)物全部加入T1感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30 min，42℃水浴熱擊30 s后，迅速冰浴2 min，加入500 μl 液體LB培養(yǎng)基，37℃ 180 r/min復(fù)蘇1 h。將復(fù)蘇的感受態(tài)細(xì)胞懸液涂布于含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB平板上，37℃ 培養(yǎng)9 ~ 12 h，挑取克隆子用M13引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將陽(yáng)性克隆子液體培養(yǎng)后送南京金斯瑞生物科技有限公司測(cè)序。將獲得的序列用 BLAST軟件與GenBank中已知的 16S rRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，鑒定菌株。將獲得的高效礦物風(fēng)化伯克霍爾德氏菌用于菌株溶解礦物試驗(yàn)和菌株生物學(xué)特性測(cè)定。

1.5 搖瓶條件下伯克霍爾德氏菌對(duì)硅酸鹽礦物的溶解效應(yīng)

采用鉀長(zhǎng)石和黑云母作為供試硅酸鹽礦物，礦物溶解試驗(yàn)同1.3，振蕩培養(yǎng)7 d后，用Sartourius pB-10型pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液中pH。將發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min，取上清液用ICP-OES測(cè)定溶液中Si、K、Ca含量。

1.6 伯克霍爾德氏菌產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定

將供試菌株接入有氮液體培養(yǎng)基，在30℃ 搖床中振蕩培養(yǎng)48 h，發(fā)酵液6 000 r/min離心10 min，取1.0 ml上清液加入1.0 ml CAS檢測(cè)液，混勻，以去離子水作對(duì)照，1 h后測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光值；取1.0 ml未接菌的1/5 LB液體培養(yǎng)基與1.0 ml CAS檢測(cè)液混勻，同法測(cè)定為參比值[18–20]。

1.7 溫度、初始 pH和鹽濃度對(duì)伯克霍爾德氏菌生長(zhǎng)的影響

將供試菌株點(diǎn)接于BHm固體平板，分別在4℃、15℃、28℃、37℃和45℃的溫度下培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長(zhǎng)及生長(zhǎng)情況；用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將BHm培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至2.0、4.0、7.0、8.5和10.0。將活化的供試菌株分別點(diǎn)接于上述不同pH的培養(yǎng)基中，28℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長(zhǎng)及生長(zhǎng)情況；按質(zhì)量百分比濃度分別配制NaCl濃度為0.4%、0.8%、1.0% 和2.0%的BHm培養(yǎng)基，將供試菌株分別點(diǎn)接于上述培養(yǎng)基上，30℃ 培養(yǎng)72 h，觀察其能否生長(zhǎng)。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Microsoft Office Excel 2007處理，采用SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同樣品中礦物風(fēng)化細(xì)菌的分離篩選

細(xì)菌廣泛分布在巖石(礦物)表面、土壤和植物體內(nèi)[4,10]。以鉀長(zhǎng)石為唯一K源的選擇性培養(yǎng)基分離到38株能夠從鉀長(zhǎng)石中釋放Al的細(xì)菌菌株，供試菌株從鉀長(zhǎng)石中釋放的Al比不接菌對(duì)照增加2.4 ~ 8.7倍(圖1)。在這些礦物風(fēng)化細(xì)菌中，16株分離自巖石樣品表面，6株分離自野青茅(Deyeuxia arundinacea)根部，6株分離自根際土壤，10株分離自非根際土壤。

2.2 具礦物風(fēng)化效應(yīng)伯克霍爾德氏菌株的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)對(duì)礦物風(fēng)化細(xì)菌16S rDNA序列分析，共獲得10株具礦物風(fēng)化效應(yīng)的伯克霍爾德氏菌，占礦物風(fēng)化細(xì)菌的26.3%(圖2)。其中，3株(分別為G21、G25和G31)分離自巖石表面，2株(g4和g6)分離自野青茅根部，3株(R22、R24和R28)分離自根際土壤，2株(F1和F25)分離自非根際土壤。

圖1 菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石中Al元素的釋放效應(yīng)Fig. 1 Al element release from potash feldspar in presence of bacteria

圖2 基于16S rDNA 序列系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)Fig. 2 Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequences

將獲得的具礦物風(fēng)化效應(yīng)的伯克霍爾德氏菌株16S rRNA序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行相似性比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件經(jīng)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，研究不同生境伯克霍爾德氏菌株的系統(tǒng)發(fā)育特征。由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，菌株R24、R22、g6形成一個(gè)分支，且與B. contaminans LMG 23361的16S rRNA基因序列相似性分別為 99.86%、99.86% 和 99.93%；菌株G31、G25與B. stabilis LMG 14294形成一個(gè)分支，16S rRNA基因序列相似性均為100%；菌株F25和F1與B. phenoliruptrix AC1100形成一個(gè)分支，16S rRNA基因序列相似性分別為 100% 和 99.93%；菌株G21、R28和g4分別與B. territorii LMG 28158、B. arboris R-24201和B. caledonica NBRC 102488形成一個(gè)分支，16S rRNA基因序列相似性分別為100%、99.86% 和 99.71%。由此可見，分離篩選到的具礦物風(fēng)化能力的伯克霍爾德氏菌表現(xiàn)出一定的種群多樣性(圖2)。

2.3 伯克霍爾德氏菌株對(duì)鉀長(zhǎng)石和黑云母的溶解作用

研究表明，細(xì)菌可以通過(guò)產(chǎn)生的有機(jī)酸、鐵載體、多糖以及氧化還原作用加速礦物的風(fēng)化并釋放其中的元素[2,4,8,13–14]。為了研究伯克霍爾德氏菌對(duì)不同硅酸鹽礦物的風(fēng)化能力，我們測(cè)定了伯克霍爾德氏菌對(duì)鉀長(zhǎng)石和黑云母中 Si、K、Ca元素的釋放能力以及發(fā)酵液中 pH的差異(圖 3)。結(jié)果表明，供試伯克霍爾德氏菌從鉀長(zhǎng)石中釋放出的 Si、K、Ca分別比對(duì)照增加了23.7% ~ 119%、12.6% ~ 40.3%和18.7% ~ 57.9%；其中菌株g6釋放Si、K、Ca的能力最強(qiáng)，菌株G31釋放Si的能力最弱，而菌株G25、G31、R22、R24和R28沒有顯著提高鉀長(zhǎng)石中K的釋放能力；另外，供試伯克霍爾德氏菌在風(fēng)化鉀長(zhǎng)石的過(guò)程中可以通過(guò)產(chǎn)酸來(lái)降低發(fā)酵液中的pH，接菌處理的發(fā)酵液pH為3.05 ~ 4.67，對(duì)照處理發(fā)酵液的pH為6.58，其中菌株R22處理發(fā)酵液pH最低(圖3)。由圖3可以看出，供試伯克霍爾德氏菌對(duì)黑云母的風(fēng)化能力更強(qiáng)，接種伯克霍爾德氏菌處理的發(fā)酵液中Si、K、Ca的含量分別比對(duì)照提高了86.4% ~ 876%、5.6 ~ 14.6倍和70% ~ 147%；其中菌株R22釋放Si的能力最強(qiáng)，而菌株F1釋放Si的能力最弱；菌株G31釋放K、Ca的能力最強(qiáng)，而菌株R22釋放K和菌株g6釋放Ca的能力最弱。值得注意的是，在黑云母存在的條件下接菌處理發(fā)酵液的pH比對(duì)照(pH 6.84)偏高(菌株F1除外)，發(fā)酵液pH達(dá)7.03 ~ 7.43，可能的原因是伯克霍爾德氏菌在風(fēng)化黑云母過(guò)程中釋放出大量的堿性元素(K、Ca)，使溶液pH升高(圖3)。另外，伯克霍爾德氏菌風(fēng)化硅酸鹽礦物的效能與礦物種類、菌株種類和來(lái)源密切相關(guān)(圖3)。

圖3 伯克霍爾德氏菌對(duì)風(fēng)化鉀長(zhǎng)石和黑云母的溶解作用Fig. 3 Element release from feldspar and biotite in presence of Burkholderia strains

2.4 菌株產(chǎn)鐵載體能力

鐵載體是一類特異性螯合劑，是微生物在限鐵條件下(即鐵離子濃度較低時(shí))產(chǎn)生并分泌的一種低分子量(<1 000 Da)、能夠螯合Fe (III)離子的化合物。本試驗(yàn)采用CAS通用檢測(cè)法檢測(cè)供試菌株產(chǎn)鐵載體的能力。運(yùn)用國(guó)際上通用的A/Ar比值(即菌株測(cè)定值/對(duì)照值)對(duì)微生物鐵載體的產(chǎn)量進(jìn)行半定量比較，A/Ar比值越小菌株產(chǎn)鐵載體能力越強(qiáng)[18–19]。菌株G21的A/Ar比值在0 ~ 0.2范圍內(nèi)，產(chǎn)鐵載體能力最強(qiáng)；菌株g4、g6、R22、R24的A/Ar比值在0.2 ~ 0.4范圍內(nèi)，產(chǎn)鐵載體能力較強(qiáng)；菌株G25、G31的A/Ar比值在0.4 ~ 0.6范圍內(nèi)，產(chǎn)鐵載體能力中等；而菌株F1、F25、R28的A/Ar比值>1，不產(chǎn)鐵載體。

2.5 菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力

伯克霍爾德氏菌對(duì)不同的溫度、pH和鹽濃度等不同培養(yǎng)條件均表現(xiàn)出一定的適應(yīng)性。供試伯克霍爾德氏菌為中溫菌，在15 ~ 37℃下能較好生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為30℃左右，菌株F25能夠耐受高溫，在45℃下能夠生長(zhǎng)；供試伯克霍爾德氏菌生長(zhǎng)的pH范圍是4 ~ 10，菌株耐酸耐堿，在pH 4和pH 10的條件下均能生長(zhǎng)；供試伯克霍爾德氏菌均可在 0.4% ~ 1.0% 的 NaCl中良好生長(zhǎng)，菌株耐高滲能力較弱，只有菌株F25能夠在2% NaCl中生長(zhǎng)。

3 結(jié)論

1) 從巖石表面、野青茅根、根際和非根際土壤中分離篩選到具礦物風(fēng)化能力的伯克霍爾德氏菌，系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析表明，具礦物風(fēng)化能力的伯克霍爾德氏菌有較豐富的種群多樣性。

2) 供試伯克霍爾德氏菌能夠顯著促進(jìn)鉀長(zhǎng)石和黑云母的溶解并釋放出其中的 Si、K、Ca元素，菌株可以通過(guò)產(chǎn)酸加速硅酸鹽礦物的風(fēng)化。另外，伯克霍爾德氏菌風(fēng)化硅酸鹽礦物的能力與菌株的種類和來(lái)源有關(guān)，菌株g6和G31具有較好的應(yīng)用前景。

3) 具礦物風(fēng)化能力的伯克霍爾德氏菌具有較強(qiáng)的產(chǎn)鐵載體的能力，不同的伯克霍爾德氏菌產(chǎn)鐵載體的能力不同。

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Isolation of Mineral-weathering Burkholderia Strains and Their Biological Characteristics

MAO Xinxin, HE Linyan, WANG Qi, SHENG Xiafang*
(Key Laboratory of Agricultural and Environmental Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

Ten mineral-weathering Burkholderia strains were obtained from the surface of potassic trachyte, root tissue interior, rhizosphere and bulk soils of Deyeuxia arundinacea. The Burkholderia strains belonged to six species based on 16S rDNA sequence analysis. In addition, the dissolution of feldspar and biotite by the strains and their biological characteristics were evaluated. The results showed that the Burkholderia strains isolated from different environments had different abilities to weather silicate minerals. The concentrations of Si, K and Ca were increased by 23.7%–119%, 12.6%–40.3% and 18.7%–57.9% released from feldspar and 86.4%–876%, 5.6–14.6 folds and 70%–147% released from biotite in the presence of the Burkholderia strains respectively compared with the controls. Among the strains, strain g6 had the best ability to release Si, K, and Ca from feldspar, strain G31 had the best ability to release K and Ca from biotite, while strain R22 had the best ability to release Si from biotite. pH in the culture medium inoculated with the Burkholderia strains ranged from 3.05–4.67 and 7.03–7.43 in the presence of feldspar and biotite, respectively. Furthermore, the Burkholderia strains had the different abilities to produce siderophores in culture medium. The Burkholderia strains also had the characteristics of acid or alkali and salt tolerances and temperature resistance.

Burkholderia strains; Silicate minerals; Dissolution of minerals; Biological characteristics

Q93; S1

A

10.13758/j.cnki.tr.2017.01.012

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(41473075)資助。

* 通訊作者(xfsheng@njau.edu.cn)

毛欣欣(1991—)，女，山東泰安人，碩士研究生，主要從事硅酸鹽礦物–細(xì)菌相互作用研究。E-mail: 2013116068@njau.edu.cn