張潔+石小風(fēng)+諶新興+賈靜

【摘要】目的：研究阿司匹林對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞增殖及BCL-6 mRNA 表達(dá)量的影響。方法：不同劑量的阿司匹林干預(yù)人宮頸癌 Hela細(xì)胞24h后，用MTS法觀察其對(duì)人宮頸癌 Hela細(xì)胞增殖狀態(tài)的影響及采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR） 檢測(cè)阿司匹林作用后 Hela 細(xì)胞 BCL-6 mRNA 量的變化。結(jié)果：阿司匹林能抑制Hela細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞中 BCL-6 mRNA 的表達(dá)，且促進(jìn)強(qiáng)度隨阿司匹林的濃度的增加而增加。結(jié)論：阿司匹林能夠抑制人宮頸癌Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)，并從 mRNA 水平促進(jìn) BCL-6 蛋白的表達(dá)。

【關(guān)鍵詞】 阿司匹林；人宮頸癌 Hela 細(xì)胞；BCL-6

【中圖分類號(hào)】R73-36+1【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）05-0049-03

阿司匹林屬于非甾體抗炎藥的代表藥，是臨床上常用的解熱鎮(zhèn)痛藥。研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期低劑量服用阿司匹林具有預(yù)防腫瘤的作用[1]，對(duì)腸癌細(xì)胞系、乳腺癌、胰島瘤NIT-1細(xì)胞、宮頸癌Hela細(xì)胞等均有抑制作用[2-4]。宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率位居女性惡性腫瘤中第2位[5]。其發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟級(jí)連的過(guò)程[6]，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。BCL-6基因（B cell lymphoma 6，簡(jiǎn)稱 BCL-6）是Ye等[7]在 1993年研究非霍奇金淋巴瘤免疫基因圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因。在生理?xiàng)l件下，BCL-6 主要表達(dá)于生發(fā)中心 B 細(xì)胞和 CD4T 細(xì)胞，調(diào)節(jié)B細(xì)胞活化及分化相關(guān)基因如 blimp-1、CD4等[8]、細(xì)胞周期調(diào)控基因如p27kip1、cyclinD2、炎癥有關(guān)的趨化因子基因如MIP-1a 和 IP-10[9]的表達(dá)。大量研究發(fā)現(xiàn)[10-12]發(fā)現(xiàn)BCL-6 在多種腫瘤中表達(dá)量增加，并且與腫瘤的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)。由于BCL-6與腫瘤密切相關(guān)，所以我們推測(cè)阿司匹林可能通過(guò)促進(jìn)BCL-6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖。本研究通過(guò)觀察阿司匹林對(duì)人宮頸癌 Hela 細(xì)胞 BCL-6 mRNA 表達(dá)的影響來(lái)探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制。

1儀器與材料

11細(xì)胞人宮頸癌 Hela 細(xì)胞株，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。

12試劑和藥品RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司）；青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗，Gibco公司）；胎牛血清 （FBS，Gibco公司）；二甲基亞砜 （DMSO，Sigma公司）； 0 02% EDTA/0 25% 胰蛋白酶（Gibco公司）；Trizol （Invitrogen公司）；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（promega公司）；GoTaq 2-Step RT-qPCR System （Promaga公司）；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

13儀器二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)thermo公司）；BX51倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）； NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；T100 Thermal Cycler PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Eco熒光定量PCR系統(tǒng)（美國(guó)Illumina公司）。

14藥物Aspirin（貨號(hào)：A2093，SIGMA公司）。

2方法

21阿司匹林溶液的配制與人宮頸癌 Hela 細(xì)胞培養(yǎng)

211阿司匹林溶液的配制將40mL完全培養(yǎng)基放至 50mL的離心管中備用；再用電子天平準(zhǔn)確稱取72064g的阿司匹林粉末（分子量為 18016），溶于準(zhǔn)備好的 40mL完全血清培養(yǎng)基中，用震蕩混勻器充震蕩使其完全溶解，再將pH值調(diào)至 71～72，即得 1mol/L 的阿司匹林母液，隨后轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)用 022μm 的微孔過(guò)濾器過(guò)濾除菌，分裝至小離心管中，置于-20℃冰箱保存，使用時(shí)予完全培養(yǎng)基稀釋至不同濃度的阿司匹林25、50、100、200mmol/L。

212人宮頸癌 Hela 細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌 Hela細(xì)胞于37℃、飽和濕度、 5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)，經(jīng)025%的胰蛋白酶常規(guī)消化后按一定量接種至RPMI-1640培養(yǎng)基（含10% FBS，1%雙抗）中吹散均勻，移入新細(xì)胞培養(yǎng)皿，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。

22MTS法檢測(cè)不同濃度阿司匹林對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌 Hela細(xì)胞經(jīng)025%的胰蛋白酶常規(guī)消化后按按1×104個(gè)/孔接種于96孔板內(nèi)，每孔200μL，接種完畢后，將板置于37℃，含5% CO2的培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜，24h 后，更換培養(yǎng)基為無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后開(kāi)始進(jìn)行分組加藥，空白組及對(duì)照組再分別加入200μL完全培養(yǎng)基，加藥組分別加入不同濃度阿司匹林的完全培養(yǎng)基各200μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加藥完畢繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24h后，將板取出，每孔加入40μL MTS溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1～4h取出96孔板，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處的吸光度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD 值）×100%。

23qRT-PCR 檢測(cè)阿司匹林對(duì)HeLa細(xì)胞中BCL-6 mRNA表達(dá)的影響 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞如前常規(guī)消化后按1×106個(gè)/孔接種于6孔板內(nèi)，每孔2mL，接種完畢后，將板置于37℃，含 5%CO2的培養(yǎng)箱中貼壁過(guò)夜。次日，分別加藥入不同濃度阿司匹林的完全培養(yǎng)基各2mL，對(duì)照組加入2mL完全培養(yǎng)基，加藥完畢繼續(xù)于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出細(xì)胞提取總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定的RNA的濃度與純度。按GoTaq 2-Step RT-qPCR System說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（反應(yīng)體系20μL，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：25℃×10min，42℃×60min，70℃×15min，4℃×5min）以及qPCR（反應(yīng)體系20μL，反應(yīng)條件：擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃×2min，95℃×15sec，60℃×60sec，總共45個(gè)循環(huán)），實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。qPCR引物由北京市金瑞斯生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成，基因引物見(jiàn)表1。采用相對(duì)定量法（2-ΔΔCT法）計(jì)算目的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

24統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)用 SPSS210統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，單因素方差分析，P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31阿司匹林對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的影響MTS結(jié)果顯示，不同濃度的阿司匹林（25、50、100、200mmol/L）作用HeLa細(xì)胞24h后能抑制HeLa細(xì)胞的增殖，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且呈劑量依賴性，即其抑制率隨濃度的增大而逐漸增加。見(jiàn)圖1、表2。

32阿司匹林對(duì)HeLa細(xì)胞中BCL-6 mRNA表達(dá)的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，不同濃度的阿司匹林（0、25、50、100、200mmol/L）作用HeLa細(xì)胞24h后能促進(jìn)HeLa 細(xì)胞中BCL-6 mRNA表達(dá)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005），且呈劑量依賴性，即其促進(jìn)程度隨濃度的增大而逐漸增加。見(jiàn)圖2。

4討論

原癌基因BCL-6屬于抗細(xì)胞凋亡家族，編碼核轉(zhuǎn)錄抑制蛋白，在生發(fā)中心B細(xì)胞和具有生發(fā)中心B細(xì)胞表型的淋巴瘤中高表達(dá)。BCL-6的主要功能是轉(zhuǎn)錄抑制作用，受BCL-6調(diào)控的靶基因主要與細(xì)胞活化、分化和增生相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)BCL-6在多種腫瘤中有高表達(dá)，且與腫瘤的增殖、侵襲等密切相關(guān)[10-12]。BCL-6在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤等淋巴瘤中顯著高表達(dá)，且已成為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的診斷標(biāo)志物之一[13-14]。

宮頸癌是發(fā)生在全球婦女中僅次于乳腺癌的第二常見(jiàn)的惡性腫瘤。我國(guó)宮頸癌發(fā)病率已高居世界第二位，僅次于智利，且發(fā)病年輕化趨勢(shì)明顯，因此研究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制、治療、預(yù)防是一大熱點(diǎn)。目前認(rèn)為宮頸癌的發(fā)病主要與HPV感染引起機(jī)體內(nèi)源性因素產(chǎn)生影響，如相關(guān)癌基因激活、抑癌基因失活、端粒酶活性高表達(dá)和機(jī)體免疫調(diào)節(jié)機(jī)制失衡等一系列病理改變，引起細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)節(jié)異常，導(dǎo)致組織癌變。阿司匹林是非甾體抗炎藥 （NSAIDs），可以通過(guò)抑制COX和NOS-2激活等途徑來(lái)預(yù)防和抑制腫瘤的作用[15]。實(shí)驗(yàn)研究[16-18]也確實(shí)證明了阿司匹林能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖與凋亡，但具體機(jī)制不詳。

基于原癌基因BCL-6與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，本項(xiàng)目組進(jìn)行了此次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明阿司匹林具有明確的抗宮頸癌的作用，并且該作用可能與其促進(jìn)BCL-6的表達(dá)有關(guān)。其促進(jìn)作用于阿司匹林的濃度呈正相關(guān)，但是阿司匹林是如何通過(guò)促進(jìn)BCL-6表達(dá)來(lái)抑制宮頸癌的還需進(jìn)一步的深入研究。

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