馮宏玲+黃森+李穆睿+張慧+于思慧+韓麗

【摘要】目的：測(cè)定雙黃連口服液化學(xué)成分含量，建立化學(xué)成分指紋圖譜的研究，為雙黃連口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供理論依據(jù)。方法：采用高效液相色譜法，Agilent C18色譜柱（250mm×46mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-025%冰乙酸（B），流速為10mL/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣體積為10μL。結(jié)果：測(cè)定雙黃連口服液中化學(xué)成分含量并建立了指紋圖譜，標(biāo)定12個(gè)共有峰，以9號(hào)峰（即黃芩苷）為參照。方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。結(jié)論：建立了以黃芩苷、連翹苷和綠原酸為參照物，測(cè)定不同廠家的雙黃連口服液的含量及化學(xué)指紋圖譜方法，結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性，此方法簡(jiǎn)便，重現(xiàn)性好，精密度高，可以為雙黃連口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】雙黃連口服液；高效液相色譜法；含量測(cè)定；指紋圖譜

【中圖分類號(hào)】R284【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）05-0017-06

雙黃連口服液是臨床抗菌抗病毒常用藥，由金銀花、黃芩和連翹三味中藥提取精制而成，具有抑菌[1]、抗病毒[2-3]、解熱抗炎[4]的作用，用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒，癥見發(fā)熱頭痛、咳嗽及咽痛等。此三味中藥主要成分為綠原酸、黃芩苷以及連翹苷，綠原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用[5]，黃芩苷具有抗菌抗病毒、解熱鎮(zhèn)痛抗炎、清除氧自由基等作用[6]，連翹苷具有抗菌抗病毒、抗炎、保肝等作用[7]，這三種化合物是雙黃連口服液中主要活性及藥效成分。目前用高效液相色譜法來(lái)測(cè)定雙黃連口服液中的有效成分是主要的檢測(cè)方式[8-10]，且指紋圖譜是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的鑒別中藥品種和評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的非常有效的手段。因此有必要對(duì)不同廠家及批次的制劑中這三種成分的含量及指紋圖譜進(jìn)行研究，為此建立了本文的研究方案，可能會(huì)對(duì)控制藥品質(zhì)量、保證人民用藥的安全有效起到積極的作用。

1儀器與材料

11儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（包括四元泵，DAD 檢測(cè)器，柱溫箱，工作站，安捷倫科技有限公司）；AR2140型電子分析天平（上海奧豪斯公司）；METTLER AB135-S十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士）；超聲提取儀（240W，50-60Hz，上海必能超聲儀器公司）。

12材料連翹苷（批號(hào)：110821-201213）、綠原酸（批號(hào)：110753-201314）、黃芩苷（批號(hào)：110715-201117）等對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），甲醇等試劑均為色譜純。藥品見表1。

2化學(xué)成分含量測(cè)定

雙黃連口服液是由金銀花、黃芩、連翹三種藥材制成的中藥制劑，金銀花中有效成分主要為綠原酸、黃芩中有效成分主要為黃芩苷、連翹中有效成分主要為連翹苷，中國(guó)藥典也以這三種成分作為指標(biāo)性成分[11]，以3種成分為指標(biāo)，建立了雙黃連口服液的含量測(cè)定方法。

21色譜條件梯度洗脫：0～8min，A（15%～30%）-B（85%～70%）；8～15min，A（30%～35%）-B（70%～65%）；15～20min，A（35%～53%）-B（65%～47%）；20～45min，A（53%～63%）-B（47%～37%）；45～65min，A（63%～100%）-B（37%～0%）；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm。

22對(duì)照品溶液制備分別精密稱取綠原酸、連翹苷、黃芩苷對(duì)照品，用50%甲醇制成01822、0053、118mg/mL的混合對(duì)照品溶液，045μm微孔濾膜濾過，即得。

23供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量?jī)?nèi)容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045μm微孔濾膜濾過，即得。

24陰性對(duì)照溶液制備取除去金銀花、連翹、黃芩藥材，按雙黃連口服液制備工藝制備陰性藥品，按供試品溶液制備方法操作，制成缺失金銀花、連翹、黃芩的陰性對(duì)照溶液，備用。

25方法學(xué)考察

251專屬性試驗(yàn)取金銀花、連翹、黃芩的陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液、供試品溶液分別注入液相色譜儀，測(cè)定色譜峰，結(jié)果顯示，金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液色譜中在與供試品色譜中綠原酸、連翹苷、黃芩苷相同保留時(shí)間處，未見色譜峰，表明金銀花、連翹、黃芩的陰性溶液無(wú)干擾。結(jié)果見圖1、2、3。

252線性關(guān)系考察精密量取上述混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、14、16 μL注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=18909X+63468，R=09997，線性范圍為236μg～1888μg。精密量取上述混合對(duì)照品溶液5、75、10、15、20 μL注入液相色譜儀，測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=12898X+19970，R=09998，線性范圍為0911μg～3644μg。連翹苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Y=12152X+52111，R=09997，線性范圍為053～106μg。

253中間精密度試驗(yàn)由3個(gè)不同實(shí)驗(yàn)人員，分別在3天，取雙黃連口服液（S-2），精密量取5mL，按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件，每人重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算含量。結(jié)果顯示，RSD小于15%，表明中間精密度良好。

254穩(wěn)定性試驗(yàn)取雙黃連口服液（S-2），按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件分別在提取后 0、2、4、6、8、10h取樣，分別注入色譜儀，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在配制完成后的10h內(nèi)色譜峰面積無(wú)明顯變化，表明在10h內(nèi)供試液溶液穩(wěn)定。

255重復(fù)性試驗(yàn)取雙黃連口服液（S-2）6份，按“23” 項(xiàng)下制備供試品溶液，按“21”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定色譜峰面積，計(jì)算含量，RSD小于3%，結(jié)果顯示，6次測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性良好。

256準(zhǔn)確度試驗(yàn)精密量取6份已知含量的雙黃連口服液（S-2）025mL，置10mL量瓶中，分別精密加入黃芩苷（118mg/mL）5mL、綠原酸（01822mg/mL）5mL和連翹苷（0053mg/mL） 5ml對(duì)照品溶液，按供試品溶液的制備方法制備，注入色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，3個(gè)成分的含量的回收率均在95%～105%之間。

27含量測(cè)定按“24”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算含量。11個(gè)不同廠家雙黃連口服液含量測(cè)定結(jié)果有一定差異，其黃芩苷含量在15055～34614mg/mL范圍內(nèi)，連翹苷在0589～2072mg/mL范圍內(nèi)，綠原酸在0694～5781mg/mL范圍內(nèi)，均滿足《中國(guó)藥典》2015版一部的含量限度要求，其中S-7（匯利）3種成分的總量最低。結(jié)果見表2。

3雙黃連口服液指紋圖譜的建立

31供試品溶液制備分別取10支雙黃連口服液的等量?jī)?nèi)容物混合，精密量取05mL，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，045μm微孔濾膜濾過，即得。

32參照物溶液制備分別精密稱取黃芩苷1401mg、綠原酸424mg、連翹苷503mg，置于10mL量瓶中，加入50%甲醇定容，搖勻，分別制得黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液1401mg/mL、綠原酸0424μg/mL、連翹苷0503mg/mL。

33陰性溶液的制備取除去雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法操作，制備陰性對(duì)照溶液，備用。

34色譜條件色譜柱：Agilent C18色譜柱（250mm×46mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）-025%冰乙酸（B）；梯度洗脫：0～8min，A（15%～30%）-B（85%～70%）；8～15min，A（30%～33%）-B（70 %～67 %）；15～20min，A（33%～40%）-B（67%～60%）；20～40min，A（40%～43%）-B（60%～57%）；40～50min，A（43%～47%）-B（57%～53%）；50～70min，A（47%～100%）-B（53%～0%）。流速：10mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積： 10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：278nm。

35參照物的確定通過測(cè)定11批不同廠家的雙黃連口服液供試品，制劑的色譜峰均在70min之內(nèi)出現(xiàn)，由于對(duì)照品黃芩苷、綠原酸、連翹苷為已知成分，且11批制劑中均存在，因此選擇這3個(gè)峰作為雙黃連口服液的參照峰。參照色譜圖見圖4。

36共有指紋峰的標(biāo)定分別測(cè)定陰性溶液與供試品溶液，并且進(jìn)行比較，排除陰性干擾峰，以黃芩苷、綠原酸、連翹苷為參照物，選擇11個(gè)廠家雙黃連口服液指紋圖譜中保留時(shí)間與參照物相對(duì)比的相對(duì)保留時(shí)間一致的峰做為共有指紋峰，在《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》中導(dǎo)入11批不同廠家雙黃連口服液的指紋圖譜，對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，最終確定共有指紋峰12個(gè)，相似度均大于099，經(jīng)計(jì)算，每個(gè)廠家供試品溶液中色譜圖中的共有峰的峰面積之和大于90%，符合共有峰標(biāo)定要求，共有峰色譜圖見圖5、6、7，相似度評(píng)價(jià)見表3。結(jié)果顯示不同廠家制劑的指紋圖譜存在差異性。

37方法學(xué)考察

371精密度試驗(yàn)取供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，考察共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的值。結(jié)果表明，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到6個(gè)圖譜的相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明精密度良好。

372穩(wěn)定性試驗(yàn)取雙黃連口服液，按供試品溶液制備方法制備，分別在0、2、4、6、8、10h進(jìn)樣，考察共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的值。結(jié)果，各個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，10h內(nèi)圖譜相似度均大于096，符合指紋圖譜分析要求，表明穩(wěn)定性良好。

373重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取同一批號(hào)雙黃連口服液6份，按供試品溶液制備方法處理，分別注入色譜儀，考察共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的值。結(jié)果，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，符合指紋圖譜分析要求。在中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)中導(dǎo)入色譜圖，得到圖譜相似度。結(jié)果表明，圖譜的相似度均大于097，符合指紋圖譜分析要求，表明重復(fù)性良好。

4討論

41分別以乙腈-水、甲醇-水等不同比例的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行等度和梯度洗脫試驗(yàn)。結(jié)果表明，用甲醇-025%冰乙酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫可同時(shí)將三個(gè)有效成分黃芩苷、連翹苷、綠原酸在同一個(gè)色譜條件下分開，且分離度較好，為此選用文中流動(dòng)相。

42本法對(duì)雙黃連口服液中3種成分同時(shí)測(cè)定，解決了《中國(guó)藥典》中采用3個(gè)色譜條件分別測(cè)定黃芩苷、連翹苷、綠原酸含量的方法的繁瑣性，操作簡(jiǎn)便，提高了雙黃連口服液含量測(cè)定效率。

43建立了雙黃連口服液指紋圖譜，標(biāo)定了12個(gè)共有峰，以9號(hào)峰（即黃芩苷）為參照，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)（0200），2號(hào)（0220），3號(hào)（0287），4號(hào)（0358），5號(hào)（0447），6號(hào)（0554），7號(hào)（0713），8號(hào)（0859），9號(hào)（1000），10號(hào)（1285），11號(hào)（1321），12號(hào)（1465），方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%；以3號(hào)峰（即綠原酸）為參照，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)（0692），2號(hào)（0760），3號(hào)（1），4號(hào)（1233），5號(hào)（1558），6號(hào)（1910），7號(hào)（2481），8號(hào)（2962），9號(hào)（3463），10號(hào)（4432），11號(hào)（4536），12號(hào)（5058），方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。以8號(hào)峰（即連翹苷）為參照，共有峰的相對(duì)保留時(shí)間分別為：1號(hào)（0234），2號(hào)（0257），3號(hào)（0338），4號(hào)（0416），5號(hào)（0526），6號(hào)（0645），7號(hào)（0837），8號(hào)（1），9號(hào)（1169），10號(hào)（1496），11號(hào)（1531），12號(hào)（1707），方法學(xué)考察符合規(guī)定，RSD均小于30%。證明此方法可行。

44從11批不同廠家雙黃連口服液指紋圖譜相似度結(jié)果可以看出，不同廠家的雙黃連口服液特征圖譜相似度較高。但是，各共有特征峰相對(duì)峰面積存在差異，說明不同廠家雙黃連口服液之間存在質(zhì)量差異。

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