楊 蕾 王繼峰 牛建昭 趙丕文 孫麗萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悅 齊明月

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

二仙湯含藥血清對(duì)順鉑干預(yù)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白bcl-2、bax表達(dá)的影響

楊 蕾 王繼峰 牛建昭 趙丕文 孫麗萍 陶仕英 武洪波 蔡欣悅 齊明月

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：觀察二仙湯含藥血清對(duì)順鉑干預(yù)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白bcl-2、bax表達(dá)的影響，從細(xì)胞凋亡的角度探討二仙湯含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。方法：22～24 d的SD雌性大鼠30只，隨機(jī)分為3組，分別為生理鹽水組，補(bǔ)佳樂組，二仙湯組。每組大鼠10只。給藥4 d后處死大鼠，心臟取血，制備藥物血清。22～24 d的SD大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)貼壁后，用順鉑損傷大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞。經(jīng)各組藥理血清作用后，應(yīng)用放免法，進(jìn)行雌激素和孕激素水平測定及分析。應(yīng)用免疫組化法，測定各分組bcl-2、bax蛋白的表達(dá)情況，并進(jìn)行圖像分析。結(jié)果：放免結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組和補(bǔ)佳樂組E2表達(dá)明顯改變，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)佳樂組、二仙湯組E2表達(dá)均有增加；與正常組相比，模型組P表達(dá)水平有所變化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，二仙湯組P表達(dá)略高于補(bǔ)佳樂組，但低于正常組。免疫組化結(jié)果顯示，在卵巢顆粒細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)上可見bcl-2和bax蛋白表達(dá)的棕黃色顆粒。和正常組相比較，順鉑干預(yù)后各組bcl-2表達(dá)均減弱，而以模型組最明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見bcl-2陽性表達(dá)增加，但弱于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。bax與bcl-2表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果相反，和正常組比較，順鉑干預(yù)后的各組bax均表達(dá)增強(qiáng)，模型組呈現(xiàn)極強(qiáng)表達(dá)現(xiàn)象，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見陽性表達(dá)減弱，但表達(dá)高于正常組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:二仙湯能降低經(jīng)順鉑干預(yù)后大鼠bax蛋白在卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)，增強(qiáng)bcl-2蛋白的表達(dá)，二仙湯能夠通過調(diào)節(jié)凋亡蛋白bcl-2、bax蛋白的表達(dá)，抑制卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而保護(hù)卵巢功能。

二仙湯；順鉑；顆粒細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

卵巢顆粒細(xì)胞對(duì)育齡期女性的生殖功能起著重要的作用。正常卵泡生長、發(fā)育以及排卵均需要顆粒細(xì)胞的正常的增殖和功能表達(dá)[1]。順鉑作為抗癌藥物，在臨床治療腫瘤的同時(shí)也具有細(xì)胞毒性作用。它可以破壞正常的卵巢顆粒細(xì)胞，使其發(fā)生凋亡，甚至形成卵巢早衰[2]。而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵巢功能發(fā)生異常主要是腎氣虧虛，精血不足所致，治當(dāng)以填精益髓，調(diào)理陰陽，補(bǔ)益天癸。二仙湯是張伯訥教授研制出來的以補(bǔ)腎為主的方劑。在臨床治療卵巢功能異常中具有明顯的療效。

本實(shí)驗(yàn)觀察二仙湯含藥血清對(duì)順鉑干預(yù)的大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白bcl-2、bax表達(dá)的影響，旨在從細(xì)胞凋亡的角度探討二仙湯含藥血清對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 22～24 d健康雌性SD大鼠，共40只，體質(zhì)量(60±10)g。購于斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。使用許可證：SCXK(京)2011-0004。

1.1.2 藥物 二仙湯由淫羊藿、仙茅、巴戟天、當(dāng)歸、黃柏和知母組成。按照《婦科臨床方劑學(xué)》規(guī)定的劑量比(9∶6∶10∶15∶12∶10)稱取，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院提供,根據(jù)東直門院提供的中藥顆粒與中藥飲片的固有比例進(jìn)行計(jì)算，最終按照人用藥劑量計(jì)算大鼠用藥劑量為7.5 mg/(kg·d)。注射用順鉑(CDDP)，每支10 mg，由齊魯制藥有限公司生產(chǎn)。補(bǔ)佳樂(雌激素)購自東直門醫(yī)院，規(guī)格：1 mg/片，由拜耳醫(yī)藥有～限公司生產(chǎn)。用法與劑量：成人每日1 mg，折算成大鼠所需劑量即0.009 mg/kg。

1.1.3 試劑 免疫組化試劑：1)Bax(Rabbit polyclonal IgG)、Bcl-2(Rabbit polyclonal IgG)購于北京歐北科技有限公司。2)DAB顯色劑、二抗SP-9000,(羊抗兔)購于北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。

放免試劑：1)血清孕酮放免測定盒P(HY-031)RIAKIT、血清雌二醇放免測定盒E2-17β(HY-10029)RIAKIT均購于北京華英生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備卵巢顆粒細(xì)胞 22～24 d雌性SD大鼠10只，體質(zhì)量35 g，飼養(yǎng)在23～25 ℃，光照12 h，食水隨意，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，注射PMSG 50IU/只，48 h后，在無菌條件下取出雙側(cè)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。具體操作如下：1)取SD大鼠，10%水合氯醛麻醉后，經(jīng)脫臼處死，浸泡75%乙醇中消毒3 min。2)消毒后放入已消毒托盤中在超凈臺(tái)中取雙側(cè)卵巢，放入預(yù)冷的Hank′s液2.7 mL。3)用Hank′s液清洗3次，將其中的脂肪、包膜等清理干凈。4)將卵巢移入無血清培養(yǎng)基中，用1 mL一次性注射器刺破卵巢，5 min/只，使顆粒細(xì)胞充分釋放。5)加入0.3 mL 2.5%胰酶反復(fù)用吸管吹打懸液數(shù)次，使顆粒細(xì)胞團(tuán)塊分離。37 ℃消化10 min(每3 min，震蕩或吹打一次)。6)加入1 mL含血清培養(yǎng)液終止胰酶消化，并靜置10 min。取懸液加入15 mL離心管中。7)1 000 r/min離心10 min，棄上清。加入生理鹽水5 mL沖散細(xì)胞再次離心。8)棄上清，加入10%胎牛血清0.2 mL，吹打均勻。9)計(jì)數(shù)：應(yīng)用血球小板計(jì)數(shù)，調(diào)整懸液濃度，以5×105接種于96孔板中。在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察貼壁情況，待細(xì)胞長滿瓶底至75%～80%融合時(shí)，用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 制備藥理血清組 22～24 d的雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量35～40 g，飼養(yǎng)在23～25 ℃，光照12 h，食水隨意，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d，第2天取藥理血清。具體操作如下。藥理血清動(dòng)物分3組：1)正常組：灌胃蒸餾水0.4 mL/d。2)補(bǔ)佳樂組：灌胃補(bǔ)佳樂0.5 mL/d。3)二仙湯組：灌胃二仙湯0.4 mL/d，各組連續(xù)灌胃3 d，于第4天晨起七點(diǎn)灌胃，2 h以后，心臟取血并分離血清，-20 ℃保存。

1.2.3 順鉑干預(yù)卵巢顆粒細(xì)胞 待細(xì)胞生長至底壁的75%～80%時(shí)，將模型組、補(bǔ)佳樂組、二仙湯組的培養(yǎng)基吸出，每孔加入CDDP(濃度為2.5 μg/mL)200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。

1.2.4 藥理血清處理 于CDDP作用12 h后，進(jìn)行給藥處理，每孔加入相應(yīng)的藥理血清組200 μL，放入37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.2.5 卵巢顆粒細(xì)胞bcl-2、bax免疫組化染色步驟 免疫組化染色采用SABC法,其中bcl-2、bax的一抗?jié)舛染鶠?∶200。1)96孔板每孔滴加20 μL 4%多聚甲醛固定20 min。2)1*PBS清洗標(biāo)本3次，2 min/次。3)每孔滴加20 μL 0.5%tritox-100，搖勻，孵育20 min。4)1*PBS清洗標(biāo)本3次，2 min/次。5)3%H2O2去離子水孵育7 min。6)1*PBS清洗標(biāo)本3次，3 min/次。7)滴加試劑A(封閉用正常山羊血清工作液)室溫孵育12 min，傾去，勿洗。8)滴加一抗，37 ℃孵育3 h。9)1*PBS清洗標(biāo)本3次，3 min/次。10)滴加試劑B(生物素化二抗工作液IgG/Bio)，室溫孵育12 min。11)1*PBS清洗標(biāo)本3次，3 min/次。12)滴加試劑C(辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液S-A/HRP)，室溫孵育12 min。13)1*PBS清洗標(biāo)本3次，3 min/次。14)DAB顯色劑顯色。15)自來水沖洗，顯微鏡觀察。

每孔隨機(jī)選取6個(gè)視野，統(tǒng)一放大倍數(shù)為200倍，利用免疫組化軟件包對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)行灰度測量分析，并測算視野內(nèi)陽性目標(biāo)總面積，并與視野面積相比得到陽性反應(yīng)顆粒的灰度值。

1.2.6 放免法對(duì)E2及P的測定 取標(biāo)本100 μL、標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，加E2及P抗體100 μL，加E2及P標(biāo)記物100 μL，37 ℃2 h，加二抗分離劑1 mL，室溫15 min，3 500 r/min離心15 min。去上清，測沉淀CPM。自動(dòng)放免分析儀出結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠雌二醇及孕激素實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果 與正常組相比，模型組和補(bǔ)佳樂組E2表達(dá)明顯改變，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，補(bǔ)佳樂組E2表達(dá)明顯增加，而二仙湯組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可看出與模型組相比較二仙湯組表達(dá)明顯增加，見圖1；與正常組相比，模型組P表達(dá)水平有所變化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，可見模型組P表達(dá)明顯減少，見圖2。與模型組相比，補(bǔ)佳樂組、二仙湯組均有所變化，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中二仙湯組P表達(dá)略高于補(bǔ)佳樂組?？煽闯龆蓽幯迥艽龠M(jìn)順鉑干預(yù)后的卵巢顆粒細(xì)胞E2和P的合成與分泌能力。見表1。

表1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中E2、P的表達(dá)情況

注：與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

圖1 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中E2分泌柱狀圖

圖2 各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中P分泌柱狀圖

2.2 卵巢顆粒細(xì)胞中bcl-2、bax蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示：各組bcl-2棕黃色陽性表達(dá)位于胞質(zhì)內(nèi)，其中正常組表達(dá)最多，呈深棕色；模型組bcl-2陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少，呈淡棕色。補(bǔ)佳樂組、二仙湯組陽性細(xì)胞著色增強(qiáng)，而二仙湯組陽性表達(dá)最為明顯，但少于正常組。見圖3。而bax蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相反的趨勢，各組bax在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，可見棕黃色陽性物質(zhì)位于胞質(zhì)內(nèi)，正常組bax陽性細(xì)胞染色較淺，呈棕色或淺棕色，表達(dá)較少。模型組陽性細(xì)胞著色較深，呈深棕色，表達(dá)較多。補(bǔ)佳樂組、二仙湯組和模型組相比，陽性表達(dá)細(xì)胞著色變淺，但不及正常組。見圖4。

圖3 檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bcl-2蛋白的表達(dá)情況(免疫組化×200)

注：正常組：陽性顆粒表達(dá)多，染色呈深棕色；模型組：陽性顆粒表達(dá)明顯減少，呈現(xiàn)淡棕色；補(bǔ)佳樂組：陽性表達(dá)較模型組明顯增多但不及正常組，呈現(xiàn)淺棕色；二仙湯組：陽性表達(dá)比補(bǔ)佳樂組表達(dá)多但不及正常組，呈現(xiàn)淺棕色偶有深棕色。

圖4 檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bax蛋白的表達(dá)情況(免疫組化×200)

注：正常組：陽性顆粒表達(dá)少，染色呈淺棕色；模型組：陽性顆粒表達(dá)明顯增多，呈現(xiàn)深棕色；補(bǔ)佳樂組：陽性表達(dá)較模型組明顯減少但不及正常組，呈現(xiàn)淺棕色；二仙湯組：陽性表達(dá)比補(bǔ)佳樂組表達(dá)少但不及正常組，呈現(xiàn)淺棕色。

2.3 各組卵巢顆粒細(xì)bcl-2、bax表達(dá)的比較 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果：和正常組相比較，順鉑干預(yù)后各組bcl-2表達(dá)均減弱，而以模型組最明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；和模型組比較，各藥物組均可見bcl-2陽性表達(dá)增加，但弱于正常組，其中二仙湯組陽性表達(dá)要高于補(bǔ)佳樂組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表2)。bax與bcl-2表達(dá)強(qiáng)度結(jié)果相反，和正常組比較，順鉑干預(yù)后的各組bax均表達(dá)增強(qiáng)，模型組呈現(xiàn)極強(qiáng)表達(dá)現(xiàn)象，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；和模型組比較，各治療組均可見陽性表達(dá)減弱，但表達(dá)高于正常組，其中二仙湯組陽性表達(dá)略低于補(bǔ)佳樂組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠卵巢細(xì)胞中bcl-2、bax蛋白免疫組化圖像分析結(jié)果±s，n=6)

注：與正常對(duì)照組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

細(xì)胞凋亡是一個(gè)受嚴(yán)格調(diào)控的能量依賴性的自殺程序，它引發(fā)細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)式放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞凋亡是通過2個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑實(shí)現(xiàn)：一種是內(nèi)在途徑另一種是外在途徑[3]。近年來研究表明，bcl-2蛋白廣泛的存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上，但其主要存在于線粒體外膜，bcl-2蛋白能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞的分裂，可以抑制凋亡，近而使卵泡閉鎖率降低也就是說bcl-2蛋白表達(dá)缺失，會(huì)導(dǎo)致卵巢組織中有效卵泡減少，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)無卵母細(xì)胞的卵泡[4]而bax蛋白約21%與bcl-2同源且有拮抗作用。高表達(dá)bax蛋白是卵子細(xì)胞死亡的關(guān)鍵因素，同時(shí)，bax的基因產(chǎn)物能加速細(xì)胞凋亡[5]。bcl-2與Bax,組成一個(gè)平衡體系，bax過度表達(dá)可以加速細(xì)胞凋亡，而bcl-2過度表達(dá)則使細(xì)胞凋亡得到抑制。免疫組化結(jié)果提示：bcl-2和bax蛋白表達(dá)與卵巢顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，而細(xì)胞凋亡則是通過促進(jìn)或抑制參與細(xì)胞凋亡的相關(guān)基因蛋白的表達(dá)情況來實(shí)現(xiàn)的[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明二仙湯可增加bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)而抑制顆粒細(xì)胞的凋亡。同時(shí)，二仙湯也可以降低bax蛋白的表達(dá)進(jìn)而減緩顆粒細(xì)胞的凋亡。

雌二醇(Estradiol,E2)是女性激素中生物活性最強(qiáng)的一種甾體類化合物，主要由卵巢合成和分泌，少量由腎上腺分泌。雌二醇濃度是檢查下視丘—垂體—生殖腺軸功能的指標(biāo)之一[7]。孕酮(Progesterone,P)是一種重要性激素，不僅在月經(jīng)周期的調(diào)節(jié)中起重要作用，也是維持妊娠所必須的重要激素之一，P由卵巢分泌，在卵巢內(nèi)主要是由黃體產(chǎn)生，因此，臨床上測定血清孕酮的含量，對(duì)于婦女卵巢排卵功能也有著重要的意義。本實(shí)驗(yàn)所反映出來的激素水平，可能預(yù)示著正常卵泡由正常到功能衰竭之間的一個(gè)過渡階段。E2的升高可作為早期卵巢功能不全或障礙的重要指標(biāo)，可估計(jì)卵泡池中所剩卵泡的數(shù)量。本次實(shí)驗(yàn)表明，二仙湯能夠升高P、E2水平，進(jìn)而改善卵巢功能。

二仙湯對(duì)順鉑損傷的卵巢顆粒細(xì)胞具有較好的療效。以往研究表明，二仙湯可以作用于垂體，改善GTH細(xì)胞的結(jié)構(gòu)促性腺激素的合成和分泌，有效的治療絕經(jīng)后高血壓?？梢哉{(diào)節(jié)自身性腺分泌，使性激素增加，臨床治療月經(jīng)不調(diào)。也可以延緩老年大鼠弓狀核退化，用于治療女性更年期綜合征[8-11]。本次實(shí)驗(yàn)研究表明，二仙湯通過調(diào)節(jié)血清中激素含量，能降低順鉑干預(yù)后大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中bax蛋白在卵泡顆粒細(xì)胞表達(dá)，增強(qiáng)bcl-2蛋白的表達(dá)，二仙湯可抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，降低順鉑對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞的損害，從而促進(jìn)卵泡發(fā)育，改善卵巢功能。

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(2016-06-28收稿 責(zé)任編輯：白樺)

Effects of Erxian Decoction Serum on Regulating Expression of Protein bcl-2 and bax in Rat Ovarian Granulosa Cells Apoptosis Induced by Cisplatin

Yang Lei,Wang Jifeng,Niu Jianzhao,Zhao Piwen,Sun Liping,Tao Shiying,Wu Hongbo,Cai Xinyue,Qi Mingyue

(BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effect of serum containing Erxian decoction on regulating the expression of bcl-2and bax protein from rats′ ovarian granulosa cells induced by cisplatin and to investigate the mechanism of Erxian Decoction serum on apoptosis of ovarian granulosa cells from the perspective of apoptosise. Methods:Thirty SD female rats for 22 to 24 days birth were randomly divided into three groups：the normal saline group,progynova group and the Erxian Decoction group with 10 rats in each group. After 4-day drug administration,rat hearts were taken to prepare drug serum. Ovarian granulosa cells were taken from SD rats and cultured to acquire adherent cells. Then,primary ovarian granulosa cells in rats were induced by cisplatin. After pharmacological action to serum,radio immunity method was used to detect estrogen and progestin and make analysis. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of bcl-2 and bax protein in each group and then for image analysis. Results:Test results showed that E2 expression significantly changed in the model group and progynova group (P<0.05) with statistically significant difference,compared with the normal group. Compared with the model group,the expression of E2 increased significantly in the progynova group and the Erxian Decoction group. Compared with the normal group,P expression in the model group was somewhat changed (P<0.05),which showing statistically significant difference. Compared with the model group,P expression in Erxian Decoction group was slightly higher than that of the progynova group,but lower than that of the normal group. Immunohistochemistry results showed that brown granules of bcl-2 and bax protein were expressed in the cytoplasm of ovarian granulosa cells. Compared with the normal group,the expression of bcl-2 in each group under the intervention of cisplatin was decreased,and the model group was the most obvious (P<0.05).Compared with model group,the positive expression of bcl-2 in each drug group was increased,but it was weaker than that in the normal group (P<0.05). The intensity of bax and bcl-2′s expression was opposite. Compared with the normal group,Bax expression in each group under the intervention of cisplatin were enhanced and that in the model group especially showed a strong expression (P<0.05). Compared with the model group,the positive expression of the drug groups was decreased,but was higher than that of the normal group (P<0.05) with statistically significant difference. Conclusion:Erxian Decoction can decrease the expression of Bax protein in follicular granulosa cells induced by cisplatin injury and increase the expression of bcl-2 protein. It can inhibit the apoptosis of ovarian granulosa cells and protect the ovarian function by adjusting the expression of bcl-2 and bax.

Erxian Decoction; Cisplatin; Granulosa cells; Apoptosis

教育部國家外專局創(chuàng)新引智基地項(xiàng)目(編號(hào)：B07007)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81273887；30772849)

楊蕾(1990.02—)，女，在讀研究生，研究方向：中醫(yī)藥防治女性生殖內(nèi)分泌疾病基礎(chǔ)研究，E-mail：1171935855@qq.com

陶仕英(1970.09—)，女，副教授，研究方向：中醫(yī)藥防治女性生殖內(nèi)分泌疾病基礎(chǔ)研究，Tel：(010)64287538,E-mail：taoshiying1970@163.com

R-332；R271.9

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.040